Artículo de investigación

Investigación de un dispositivo LED de luz azul para suprimir patógenos de heridas utilizando un modelo cutáneo sintético basado en colágeno

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DOI:

10.3791/69403

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24 de febrero de 2026

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1School of Engineering Technology and Applied Sciences (SETAS), Centennial College, 2Cofan Thermal/Violumas

En este artículo

Resumen

Un dispositivo LED de luz azul de 405 nm demuestra eficacia antimicrobiana contra una amplia gama de patógenos de heridas cuando se evalúa en un modelo cutáneo sintético basado en colágeno. Este enfoque simplificado in vitro ofrece una alternativa reproducible y éticamente viable para la evaluación en fases tempranas de terapias antimicrobianas basadas en la luz.

Resumen

El manejo convencional de heridas se ve cada vez más desafiado por el aumento de la resistencia a los antimicrobianos y los efectos secundarios citotóxicos de los agentes tradicionales. La fototerapia, especialmente utilizando luz azul (BL), ofrece una prometedora alternativa no invasiva y sin contacto. Este estudio evaluó la eficacia y seguridad antimicrobiana de un dispositivo BL-LED de 405 nm frente a un amplio espectro de patógenos de heridas médicamente importantes utilizando un modelo cutáneo sintético basado en colágeno, subrayando la novedad de aplicar esta plataforma para pruebas antimicrobianas basadas en luz. Esta piel sintética proporciona un entorno más realista, imitando la estructura y topografía de la piel humana. El mapeo de uniformidad de la luz mostró irradiancia consistente a lo largo de un diámetro de 10 cm (30,14 ± 0,78 mW/cm2). El dispositivo logró una reducción sustancial de logarítmicos microbianos dependientes de la fluencia de hasta 3,5 a 27 J/cm2, demostrando una eficacia considerablemente superior a la reportada en estudios similares. Su actividad de amplio espectro se confirmó contra patógenos ESKAPE y Candida albicans, una ventaja significativa para el manejo de infecciones polimicrobianas de heridas. Un hallazgo clave fue la susceptibilidad diferencial entre especies, siendo Klebsiella pneumoniae la que mostró la mayor susceptibilidad, mientras que Staphylococcus aureus resultó ser la más resistente. Esto probablemente se deba a variaciones en la estructura de la envoltura microbiana y el contenido de moléculas fotosensibles, que afectan a las especies reactivas de oxígeno (ROS). Los experimentos de transmisión óptica y los análisis de superficie frente a colonias incrustadas no revelaron ninguna significación estadística, lo que sugiere la posible aplicación de BL para inhibir patógenos bajo la piel. La espectroscopía infrarroja confirmó que la exposición a BL, incluso en fluencias altas (108 J/cm 2), no causó degradación química o conformacional detectable de la matriz de colágeno, a diferencia de los efectos dañinos observados con el control germicida UV-C. Finalmente, una evaluación única en una cámara de aerosoles demostró que el tratamiento con BL redujo la deposición microbiana en superficies en más de un 95%, destacando su potencial para mitigar infecciones nosocomiales. Estos hallazgos demuestran la idoneidad de los sustratos que imitan la piel como alternativa accesible para evaluar el BL en ensayos preclínicos, eliminando así la necesidad de modelos animales.

Introducción

Las infecciones de heridas suponen un desafío persistente y una carga significativa para el sistema sanitario global, y afectan a la calidad de vida de los pacientes. La cicatrización de heridas suele verse complicada por infecciones microbianas que retrasan el cierre de las heridas cutáneas, provocando lesiones y heridas crónicas, principalmente en poblaciones de ancianos y diabéticos. Las estrategias convencionales de manejo de heridas se basan en antibióticos, antisépticos, productos químicos y agentes bioactivos naturales que suprimen principalmente los organismos causantes de la herida. Aunque estos métodos tradicionales son efectivos para acelerar el proceso de curación al reducir las células inflamatorias y aumentar el número defibroblastos, están asociados a muchos efectos secundarios. Muchos antimicrobianos tópicos utilizados en apósitos de heridas generalmente no son amigables para la piel y pueden provocar efectos indeseables como deshidratación cutánea, irritación tisular y efectos citotóxicos sobre las células necesarias para el proceso de cicatrizaciónde la herida 2. La resistencia antimicrobiana (RAM), ampliamente informada debido al uso excesivo deantimicrobianos 3, principalmente el uso sistémico de antibióticos, amenaza la viabilidad a largo plazo de los tratamientos farmacológicos existentes. Teniendo en cuenta estas limitaciones de la práctica clínica existente, se enfatiza la necesidad de alternativas más seguras y sostenibles para el manejo de las heridas, especialmente los métodos sin contacto y sin dolor como la fototerapia.

La fototerapia, que aprovecha el espectro visible de la luz, ha ido ganando progresivamente atención como una intervención prometedora no invasiva y no farmacológica para diversas aplicaciones dermatológicas y terapéuticas. Sus aplicaciones abarcan desde el rejuvenecimiento generalde la piel y mejoras estéticas hasta tratamientos específicos para afecciones como el acné y terapias antienvejecimiento. Entre las longitudes de onda visibles (400-760 nm), la luz azul, que normalmente oscila entre 400 nm y 480 nm, ha despertado un interés científico y clínico considerable debido a su potencial terapéuticomultifacético 5. A diferencia de la radiación ultravioleta (UV), especialmente la banda UV-C (100-280 nm), que se emplea ampliamente para la desinfección superficial debido a sus propiedades germicidas pero conlleva riesgos bien documentados de daño en el ADN, carcinogénesis y cáncer de piel, la luz azul se clasifica como radiación no ionizante. Esta diferencia fundamental hace que la luz azul sea inherentemente más segura para los tejidoshumanos 5, ya que no posee la energía necesaria para dañar directamente el ADN celular ni inducir efectos mutagénicos.

Se ha reportado la actividad antimicrobiana de la luz azul tanto contra bacteriasGram-positivas 6 comoGram-negativas 7 . Se han realizado algunos ensayos clínicos para validar el uso de la terapia de luz azul contra infecciones o trastornoscomunes 8, por ejemplo, la supresión del acné Propionibacterium que causa acnévulgar 9, y el tratamiento de infecciones estomacales10 causadas por Helicobacter pylori. Sin embargo, no se han reportado ensayos clínicos que investiguen la eficacia antimicrobiana de las infecciones de heridas. Un número creciente de estudios recientes in vitro demuestran que la luz violeta-azul (400-420 nm) es capaz de inactivar múltiples patógenos ESKAPE manteniendo una citotoxicidad mínima para las células demamíferos 11. Recientemente, se ha demostrado que la luz azul en el rango de 410-430 nm modula la actividad de los fibroblastos y la deposición de colágeno, promueve la proliferación celular, regula respuestas inflamatorias y genera especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante excitación endógena de porfirina que altera las célulasbacterianas 12, convirtiéndola en un candidato prometedor para aplicaciones de cicatrización de heridas.

Sin embargo, la complejidad de la cicatrización de heridas, determinada por múltiples variables como la varianza individual, el tipo de heridas y las condiciones fisiológicas y patológicas preexistentes, plantea desafíos significativos para la investigación. Las pruebas directas in vivo de terapias para heridas siguen siendo complicadas debido a la variabilidad biológica, consideraciones éticas y la complejidad de los entornos de las heridas. Los modelos animales, aunque comúnmente utilizados, a menudo no representan con precisión la fisiología de la piel humana y están limitados por estrictos requisitosregulatorios 13. Los estudios de cicatrización de heridas que involucran ensayos clínicos son raros y a menudo rara vez representativos debido a su pequeño tamaño de muestra, lo que requiere grandes muestras estadísticas, controles rigurosos y aprobaciones éticas estrictas. Para superar estas barreras, los modelos in vitro que replican propiedades de la piel humana han surgido como plataformas eficaces para el cribadoinicial 14. Los sistemas sintéticos de la piel basados en colágeno, como VITRO-Skin, imitan la piel humana en pH, retención de humedad y textura superficial, y son ideales para probar intervenciones externas bajo condicionescontroladas 15. Aunque varios estudios han demostrado efectos antimicrobianos de amplio espectro de la luz azul, la mayoría ha utilizado cultivos de caldo, placas de agar o modelos animales, con una aplicación limitada a sustratos similares a la piel.

Basándose en el potencial demostrado de la luz azul y en las ventajas de los modelos in vitro , el estudio actual pretende probar la eficacia de un dispositivo de diodo emisor de luz (LED) que opera a una longitud de onda máxima de 405 nm para suprimir patógenos comunes de heridas. Introducimos una metodología novedosa de evaluación para evaluar la eficacia de la cicatrización basada en un modelo de microbioma simplificado aplicado a la piel sintética basada en colágeno. También compara la eficacia antimicrobiana y el impacto en la topografía cutánea de la luz azul generada por diodos emisores de luz (LED-BL) frente a la fluidez germicida UV-C. Aunque este método carece de la complejidad de los sistemas biológicos, adopta un enfoque pragmático que permite experimentos altamente controlados y reproducibles que evitan la variabilidad y complejidad ética asociadas a los estudios in vivo y ensayos clínicos, acelerando así la evaluación preliminar y el cribado inicial de intervenciones terapéuticas novedosas similares. La innovación central de este trabajo radica en la aplicación de un modelo cutáneo basado en colágeno como plataforma reproducible y controlable para evaluar la eficacia antimicrobiana con luz azul, acompañada de análisis de penetración óptica, uniformidad y seguridad basados en FTIR.

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Protocolo

1. Preparación de muestras de piel sintética

Una lámina de modelo de piel sintética a base de colágeno (VITRO-Skin) fue cortada en muestras rectangulares de 5,0 cm × 2,5 cm bajo condiciones asépticas en un armario de bioseguridad. Cada muestra se colocaba en una placa de Petri estéril y se almacenaba a 4 °C hasta su uso. Antes de la inoculación, las muestras se equilibraron a temperatura ambiente e hidrataron en una cámara de humedad según las instrucciones del fabricante para imitar el nivel de hidratación de la piel humana.

2. Preparación de cultivos microbianos

Cepas de referencia de la American Type Culture Collection (ATCC), incluyendo Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Acinetobacter baumannii (ATCC 19606), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) y Candida albicans (ATCC 10231), se utilizaron. Las colonias individuales fueron inoculadas en 5 mL de Caldo de Soja Tríptico (TSB) en condiciones asépticas. Se incubaron cultivos bacterianos a 35 °C durante 24 horas, y cultivos fúngicos a 22 °C durante 5 días. Tras la incubación, la turbidez se ajustó a 0,5 McFarland Standard (aproximadamente 1,5 × 10⁸ UFC/mL) utilizando solución salina con fosfato tamponado estéril (PBS) para ensayos antimicrobianos.

3. Inoculación de modelos cutáneos sintéticos

Cada sección de piel sintética hidratada fue inoculada con 100 μL de suspensión microbiana y distribuida uniformemente usando un esparcidor estéril desechable. Las superficies inoculadas se secaron al aire durante 15 minutos en una cámara estéril bajo condiciones ambientales de laboratorio (22-24 °C, 60%-70% HR). Las muestras se asignaron a tres grupos: control no tratado (Grupo A), fuente de luz (LED de luz azul, 405 nm), irradiación (Grupo B) e irradiación con LED UV-C (265 nm) (Grupo C). La Figura 1 muestra la representación esquemática de los experimentos en la evaluación de la eficacia antimicrobiana de la fuente de luz utilizando el modelo de piel sintética.

4. Configuración de la fuente de luz e irradiación

Un dispositivo LED de luz azul de 405 nm se montó sobre un disipador de aluminio para evitar la acumulación de calor y garantizar la irradiación térmicamente segura de muestras sintéticas de piel (Figura 2). La irradiancia se medía en el plano exacto de tratamiento mediante un medidor de potencia óptica calibrado, ajustando la altura de la sonda para tener en cuenta el grosor del sensor. La irradiancia de trabajo se estandarizó a 30 mW/cm² ajustando la distancia de lanzamiento del LED.

La uniformidad de la iluminación en todo el campo de tratamiento se verificó midiendo la irradiancia en 16 puntos equidistantes, lo que obtuvo un promedio de 30,14 ± 0,78 mW/cm² (Figura 3). Para la comparación inicial de los efectos germicidas, se realizaron tratamientos UV-C utilizando una fuente LED de 265 nm que suministraba 3 mW/cm² a una distancia de 20 cm durante 2 minutos.

La fluencia se calculaba como irradiancia × tiempo de exposición y correspondía a 27 J/cm² para luz azul (30 mW/cm² × 900 s) y 3,6 J/cm² para UV-C.

Para ensayos antimicrobianos, muestras sintéticas hidratadas inoculadas con suspensiones microbianas se colocaron asépticamente en placas de Petri estériles (con tapas retiradas) y colocadas directamente bajo el LED de luz azul. Las muestras asignadas al grupo de irradiación (Grupo B) se expusieron continuamente hasta alcanzar la fluidez objetivo (15 min). La duración de exposición de 15 minutos (27 J/cm²) se seleccionó en base a experimentos preliminares de time-kill, que demostraron una eficacia antimicrobiana consistente entre especies y representaban una duración práctica de exposición para posibles aplicaciones clínicas o en el punto de atención. La temperatura de cada muestra se monitorizaba cada 5 minutos usando un termómetro infrarrojos sin contacto para confirmar que no se producía un calentamiento significativo durante la iluminación. El monitoreo de temperatura no reveló un aumento medible de la temperatura superficial (>2 °C) durante la irradiación con luz azul, confirmando que los efectos antimicrobianos observados no eran térmicos.

5. Eficacia antimicrobiana de la luz azul, LED y UV-C contra patógenos de heridas

Tras el tratamiento, cada muestra de piel sintética se transfirió a un tubo estéril de 15 mL que contenía 9,0 mL de PBS (pH 7,4). Los tubos se vórtizaron suavemente durante 1 minuto para desalojar microbios adheridos a la superficie. Se prepararon diluciones en serie de diez veces más y se placaron alicotas de 100 μL sobre agar de soja tríptico (TSA) para bacterias y agar de dextrosa Sabouraud (SDA) para hongos. Se incubaron placas (bacterias a 35 °C durante 24 horas; hongos a 22 °C durante 5 días) y se enumeraron unidades formadoras de colonias (UFC). La reducción microbiana se cuantificó utilizando las siguientes ecuaciones:

Reducción logarítmica = log10(A) - log10(B)

Reducción porcentual = ((A - B)/A) × 100

Donde A = recuento de UFC desde el control; B = Recuento de UFC de muestras tratadas.

Los controles negativos consistieron en placas solo con medio y PBS para verificar la esterilidad, mientras que se utilizaron muestras inoculadas sin tratar para comparar la eficacia del tratamiento. Las placas de control positivas consistieron en suspensiones microbianas de ATCC inoculadas para confirmar la viabilidad del cultivo. Todos los pasos experimentales se realizaron en condiciones asépticas.

6. Eficacia antimicrobiana dependiente del tiempo de la irradiación con luz azul

Para evaluar el efecto dependiente de la fluidez, las duraciones de exposición a la luz azul se establecieron en 2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min y 30 min. La actividad antimicrobiana se evaluó mediante la enumeración de UFC como se indicó anteriormente, permitiendo analizar las relaciones dependientes de la dosis.

7. Eficacia del LED con luz azul en una cámara aerosolizada que simula condiciones nosocomiales

Se utilizó una cámara de aerosoles acrílico personalizada, bajo condiciones ambientales controladas, para simular la exposición nosocomial en el aire (Figura 4). Se introdujeron suspensiones microbianas aerosolizadas (~1,5 x 106 CFU/mL) usando un nebulizador, y se expusieron muestras de piel sintética durante 30 minutos. La luz azul se dirigía a las muestras durante toda la exposición (10 μW/cm², distancia de 20 cm). En el experimento de control, se aplicaron condiciones de exposición idénticas, pero el dispositivo BL-LED permaneció apagado. Las densidades celulares microbianas dentro de la cámara de aerosoles se monitorizaron mediante mediciones de actividad de radiación, en las que las placas de agar se colocaron dentro de la cámara antes de la exposición. Las células microbianas viables adheridas a las muestras sintéticas de piel (2 cm x 2 cm) se cuantificaron mediante el análisis estándar de recuento de placas como se describió anteriormente. Esta baja irradiancia (10 μW/cm²) fue seleccionada para imitar condiciones reales de iluminación ambiental en entornos sanitarios, donde la irradiación continua de alta intensidad no es factible.

8. Transmisión óptica y pruebas de colonias embebridas

  1. Transmisión óptica a través de sustrato de piel sintética
    Para cuantificar la penetración de luz azul a través de la piel sintética, se midió la irradiancia utilizando un medidor de potencia óptica calibrado situado en el plano de tratamiento. Se registró la intensidad BL (405 nm, 30 mW/cm²) con y sin muestras sintéticas hidratadas colocadas horizontalmente entre el LED y el detector. La transmisión (%) se calculó como la relación entre la irradiancia transmitida (con piel) y la irradiancia incidente (sin piel).
    La transmisión en condiciones acuosas se evaluó utilizando un espectrofotómetro UV-Vis. Se insertó verticalmente una tira sintética hidratada en una cubetas estándar de poliestireno llena de agua desionizada. La cubeta, llena de agua, solo servía como espacio en blanco. Se registró absorbancia a 405 nm y se calculó el porcentaje de transmisión usando % T = 10(-A) × 100.
  2. Validación funcional mediante ensayo de colonias embebidas
    Se realizaron ensayos de reducción microbiana en la superficie y en colonias incrustadas como un correlato funcional de la transmisión, donde las muestras se inoculaban en una superficie pero se irradiaban desde el lado opuesto (inferior) para simular microbios que residían bajo la superficie de la piel. Las UFC se cuantificaron como se describió anteriormente en la sección de eficacia antimicrobiana.

9. Espectroscopía FT-IR para degradación de piel sintética tras exposición a luz azul y UV-C

Para evaluar posibles cambios químicos y estructurales en la matriz cutánea sintética basada en colágeno debido a la exposición a la luz, se realizó espectroscopía de Transformada de Fourier en Infrarrojo (FT-IR). Las muestras de piel sintética (2 cm × 2 cm) se hidrataron según las instrucciones del fabricante, de forma idéntica a las muestras utilizadas en los ensayos de reducción microbiana. Las muestras hidratadas se expusieron a luz azul de 405 nm (30 mW/cm²) o a 265 nm UV-C (3 mW/cm²) durante 15 minutos (exposición estándar, 27 J/cm²) o 60 minutos (peor caso de estrés). Tras la irradiación, las muestras se absorbieron suavemente para eliminar la humedad superficial y se analizaron inmediatamente mediante FT-IR.

10. Medición ATR-FTIR

Los espectros se adquirían utilizando un espectrofotómetro IR equipado con un software de análisis compatible. Todas las muestras se analizaron utilizando el módulo iD7 de Reflectancia Total Atenuada (ATR). Para aislar los cambios espectrales atribuibles a la irradiación, (1) se realizó una comparación espectral directa entre controles no tratados y muestras irradiadas. (2) Se realizaron comparaciones relevadas de la línea base utilizando la muestra de control sin tratar como referencia de fondo antes de escanear las muestras irradiadas, permitiendo visualizar solo los picos nuevos o alterados.

Este enfoque dual reduce el ruido topográfico y mejora la detección de cambios sutiles en las regiones de amida y huella dactilar. El nivel de hidratación, el grosor de la muestra y la orientación se estandarizaron en todas las muestras para reducir la variabilidad espectral. Cada condición de exposición (control, BL-15 min, BL-60 min, UV-15 min, UV-60 min) se escaneó en triplicado.

11. Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron utilizando triplicados biológicos independientes, salvo que se indique lo contrario. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DS) o como media con intervalos de confianza (IC) del 95%, según indican las leyendas de las figuras. La normalidad de la distribución de los datos se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Se realizaron comparaciones por pares entre dos grupos (por ejemplo, luz azul vs. UV-C, colonias superficiales vs. inmersas) utilizando pruebas t de Student bicolas no emparejadas. Para comparaciones que involucran más de dos condiciones o puntos temporales, se aplicó un análisis unidireccional de varianza (ANOVA) seguido de pruebas post-hoc adecuadas. La prueba estadística específica utilizada para cada comparación está indicada en la leyenda correspondiente de la figura. Se consideró estadísticamente significativo un valor p <0,05.

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Resultados

Eficacia antimicrobiana de la luz azul, LED y UV-C contra patógenos de heridas
El dispositivo LED de luz azul (405 nm), que operó a una intensidad de 30 mW/cm² durante 15 minutos, demostró una eficacia antimicrobiana significativa contra todos los patógenos de heridas probados en modelos cutáneos sintéticos (Figura 5). Entre las especies analizadas, Klebsiella pneumoniae mostró la mayor susceptibilidad a la luz azul, con una redu...

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Discusión

Este estudio demuestra el potencial antimicrobiano significativo de un dispositivo LED de Luz Azul (BL-LED) de 405 nm frente a un panel de patógenos clínicamente relevantes analizados en modelos cutáneos sintéticos basados en colágeno. La exposición al BL-LED con una fluencia de 27 J/cm² logró una reducción de hasta 3,5 logarítimos en la carga microbiana (Figura 6), superando el rendimiento antimicrobiano reportado en varios estudios anteriores

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado (W24-21) por "Applied Research, Innovation and Entrepreneurship Services" (ARIES), Centennial College, Canadá. Los suministros microbianos y las instalaciones BSL-2 fueron proporcionados por "Applied Biological and Environmental Sciences (ABES), Centennial College, Canadá. Los autores agradecen la orientación proporcionada por Andrew Baer y Gillian Goring en espectroscopía FT-IR y el personal de la sala de preparación por su ayuda en la preparación y esterilización de los medios.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Acinetobacter baumannii  ATCC El Centro Global de Recursos BiológicosATCC 19606
Luz azul - Diodo de emisión de luz  ViolumasN/ABL-LED es un prototipo, por lo que no tiene número de catálogo ni nbsp;
Candida albicans  ATCC El Centro Global de Recursos BiológicosATCC 10231
Enterobacter aerogenesATCC El Centro Global de Recursos BiológicosATCC 13048
Escherichia coliATCC El Centro Global de Recursos BiológicosATCC 25922
Transformada de Fourier Infrarroja   (FT-IR) Espectrofotómetro Nicolet iS5Termo CientíficaIQLAADGAAGFAHDMAZAEl software OMNIC se utiliza para el análisis
Módulo de transmisión de haz directo FT-IR Nicolet iS5 iD1 (adaptador base)Termo CientíficaIQLAADGAAGFAJAMAYX
Módulo de Refracción Interna Atenuada de Diamante FT-IR Nicolet iS5 iD7Termo CientíficaIQLAADGAAGFAJAMBFN
Incubadora Percival Scientific & nbsp;9330.01.06L
Teromómetro IRThermo Fisher Scientific y nbsp;  06-664-254
Klebsiella pneumonía  ATCC El Centro Global de Recursos BiológicosATCC 13883
Solución salina tamponada con fosfatoThermo Fisher Scientific y nbsp;  AM9624Número de catálogo PBS (Thermo Fisher Scientific) y nbsp;
Pseudomonas aeruginosaATCC El Centro Global de Recursos BiológicosATCC 27853
Agar de Sabouraud dextrosaBD Difco & nbsp;DF0109-17-1Número de catálogo SAB (BD Difco)
Staphylococcus aureus  ATCC El Centro Global de Recursos BiológicosATCC 25923
Agar de soja trípticoBD DifcoDF0369-17-6Número de catálogo de la TSA (BD Difco)
Caldo de soja trípticoBD Difco & nbsp;DF0370-17-3Número de catálogo de TSB (BD Difco)
UV-LEDViolumasN/AUV-LED es un prototipo, por lo que no tiene número de catálogo y nbsp;
Espectrofómetro UV-VIZ (escaneo UV Genesys 10)Thermo Scientific y nbsp;335907P
Vitro-SkinMEDELINKSKU24000Vitro-Skin

Referencias

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