Artículo de método

Una técnica sencilla de microaspiración para aislar células somáticas de semen equino criopreservado como donantes nucleares para clonación

DOI:

10.3791/69404

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19 de diciembre de 2025

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1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, 3Integrated Cell Culture & Bioimaging Laboratory, Division of Science, Mathematics & Agribusiness, Mayville State University, 4Conservation, Genetics & Biotech, LLC, 5Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal, Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco

En este artículo

Resumen

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Este protocolo presenta una técnica sencilla de microaspiración para aislar células somáticas (SC) viables a partir del semen equino criopreservado. A diferencia de los enfoques tradicionales, esta técnica evita cultivos in vitro prolongados y supera la contaminación de espermatozoides, permitiendo su uso inmediato en la clonación de células somáticas.

Resumen

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El semen es un fluido complejo que, además de los espermatozoides, contiene otras poblaciones celulares, incluyendo células inmunitarias, células germinales masculinas inmaduras, células epiteliales y fibroblastos. Estas células comparten la condición diploide, lo que las convierte en candidatas adecuadas como donantes nucleares para la clonación de transferencia nuclear de células somáticas (SCNT). Se ha demostrado la generación de embriones y descendencia viables utilizando estas células. Los métodos efectivos para aislarlos del semen incluyen centrifugación y técnicas de gradiente osmótico; Sin embargo, son necesarios periodos prolongados de cultivo in vitro para establecer cultivos primarios a partir de estas células aisladas. Además, las muestras obtenidas contenían una alta carga de espermatozoides, lo que interfiere con el establecimiento y mantenimiento de cultivos in vitro . Hasta la fecha, los cultivos primarios solo se han establecido con éxito a partir de muestras frescas de semen, mientras que los intentos con semen criopreservado han fracasado de forma consistente. Esta limitación restringe significativamente la capacidad de generar clones a partir de muestras de semen criopreservadas. El presente estudio propone una metodología sencilla basada en microaspiración para aislar células somáticas a partir de semen equino criopreservado. Este enfoque permite la recuperación rápida de un número suficiente de células para su uso inmediato en procedimientos de clonación SCNT.

Introducción

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La clonación de transferencia nuclear de células somáticas es una herramienta invaluable para el rescate y multiplicación de individuos de interés zootécnico y científico. Numerosas líneas celulares se han utilizado como donantes nucleares, incluyendo células derivadas de piel, músculo, granulosa, linfocitos y célulasurinarias 1,2,3,4. Curiosamente, el semen ha surgido como una alternativa novedosa para la recolección de células somáticas (SC) para ser utilizadas como donantes nucleares en la clonaciónde 5,6. Este hallazgo es especialmente importante para el rescate de individuos cuyo solo se ha conservado el semen. Sin embargo, el establecimiento de cultivos primarios a partir de SCs aislados de semen congelado no ha tenido éxito y, hasta la fecha, sigue siendo el principal obstáculo para obtener animales clonados de estafuente 7,8,9. Estas células probablemente se originan en epitelios glandulares y el revestimiento de los túbulos, en secreciones seminales y, lo más importante, en contaminación seminal con orina, siendo esta última una fuente bien conocida de células somáticas con alto potencial proliferativoe indiferenciado 3.

Se han implementado varios métodos para aislar los SC del semen, incluyendo centrifugación5, gradientes osmóticos7, 8 y 10 y citometría de flujo11. Sin embargo, las células somáticas, una vez aisladas por estos métodos, aún requieren condiciones optimizadas para su inserción, crecimiento yproliferación. Los requisitos específicos de estas células hacen que el cultivo in vitro sea más complejo, ya que se requieren periodos prolongados de incubación para el establecimiento de cultivos celularesprimarios 9. Además, la alta concentración de espermatozoides presentes en las muestras interfiere tanto en la iniciación como en el mantenimiento de estoscultivos 5.

A diferencia de los enfoques descritos anteriormente, esta técnica de microaspiración ofrece varias ventajas claras. Permite seleccionar los SCs en función del tamaño y la morfología12 y facilita la recuperación de núcleos tanto de células viables como no viables, una estrategia demostrada con éxito con tejido congelado sincrioprotectores 13 y células reproductoras liofilizadas 14,15,16. Es importante destacar que los SC pueden utilizarse inmediatamente después de la descongelación del semen, reduciendo así el riesgo de errores de ploidía típicamente asociados al cultivo in vitro prolongado de células somáticas primarias utilizadas para la clonación animal17,18. Específicamente, la técnica se centra en el semen equino criopreservado, permitiendo la recogida de un número suficiente de SCs para usarse inmediatamente para SCNT12.

La fabricación de micropipetas y el desarrollo de técnicas de microaspiración han avanzado significativamente en las últimas décadas. El uso de estas herramientas permite la manipulación precisa de gametos, embriones y sus citoestructuras, creando nuevas posibilidades en el campo de la biotecnología reproductiva (https://www.jove.com). Las técnicas de micromanipulación permiten evaluar propiedades mecánicas celulares y proporcionan valiosas perspectivas sobre su estado fisiológico, aunque este campo sigue siendo relativamente poco explorado.

Hasta la fecha, ninguna investigación ha detallado una técnica eficaz para aislar los SC del semen utilizando ninguna variante de los procedimientos de micromanipulación. Dadas las limitaciones de los métodos convencionales de aislamiento, este estudio propone un protocolo práctico basado en microaspiración para aislar los SCs a partir del semen equino criopreservado, permitiendo su uso inmediato en procedimientos de clonación somática tras la recogida.

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Protocolo

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Muestras de semen criopreservadas, conservadas durante más de 19 años en nitrógeno líquido, se obtuvieron de distribuidores comerciales autorizados por las autoridades veterinarias pertinentes en México, en cumplimiento con la Norma Oficial Mexicana NOM-027-ZOO-1995, que regula el proceso zoosanitario del semen de animales domésticos. Todas las muestras de semen, ya fueran utilizadas o no aptas para análisis, fueron inactivadas y eliminadas siguiendo los protocolos institucionales de bioseguridad y las normativas aplicables, incluyendo la NOM-087-ECOL-SSA1-2002 para la gestión de residuos biológicos-infecciosos en México. El ácido fluorhídrico residual (HF) se neutralizaba de forma segura bajo una campana extractora, transfiriéndolo lentamente a un recipiente de plástico y añadiendo gradualmente pequeñas porciones de CaCO3 o Ca(OH)2 hasta que cesaba la efervescencia, formandoCaF 2 insoluble. Se confirmó que el pH de la suspensión neutralizada oscilaba entre 6 y 8 antes de ser gestionada como residuo químico inorgánico según la normativa local. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Fabricación de agujas de micropipeta para aislamiento de células somáticas

  1. Seleccionar capilares de vidrio borosilicato (1,0 mm de diámetro exterior × diámetro de 0,78 mm de diámetro interior × 100 mm).
  2. Utiliza un extractor de micropipetas para producir capilares de punta fina. Ajusta el punto de corte para variar el diámetro de la punta.
  3. Inserta el capilar en el extractor y bótalo firmemente.
  4. Retira la micropipeta con cuidado después de tirar y colócala horizontalmente sobre la microforja.
  5. Alinea el calentador y la micropipeta dentro del campo de visión del microscopio.
  6. Localiza el punto de corte usando la retícula del ocular (Figura 1A,B).
  7. Pon la punta de la micropipeta en contacto con la perla de vidrio (en el filamento del calentador).
  8. Aumenta el calor poco a poco hasta que la punta se derrita en la perla.
    1. Apaga el calentador.
    2. Deja que la punta se adhiera a la cuenta y sepárala.
      NOTA: No es necesario doblar la micropipeta; puede usarse en su forma recta. Sin embargo, si el operador lo prefiere, puede formarse un ángulo (Figura 1C).
  9. No alises la punta, ya que este paso no es necesario para el procedimiento.
  10. Limpia las puntas de la pipeta sumergiendo cada punta durante ~10 segundos secuencialmente en:
    1. 20% de ácido fluorhídrico (HF).
      PRECAUCIÓN: El ácido fluorhídrico es altamente tóxico y corrosivo. Utiliza el equipo de protección individual indicado por el proveedor. Enfatiza el uso de protección ocular y facial, guantes y bata de laboratorio, y trabaja siempre con una campana extractora.
    2. Agua estéril doble destilada.
    3. Etanol absoluto.
      NOTA: Para facilitar el lavado de la punta de la pipeta, prepare las soluciones mencionadas anteriormente en tubos Corning estériles de 15 mL.
  11. Seca micropipetas en un horno a 50 °C.
  12. Guarda micropipetas en un recipiente estéril.

2. Configuración de microaspiración

  1. Comprueba que el sistema de microaspiración esté en condiciones de funcionar correctamente, con el joystick de microaspiración centrado en el panel de control.
  2. Para sistemas que usan aceite, asegúrate de que no haya burbujas de aire en el interior, ya que pueden afectar la precisión del movimiento.
  3. Inserta la micropipeta de aspiración de células somáticas en el manipulador de sujeción en el lado dominante de la mano del operador.
    NOTA: Sustituye la micropipeta por una nueva si la punta se obstruye durante la recogida de células somáticas.

3. Descongelación y dilución del semen equino criopreservado

  1. Retira las pajitas del nitrógeno líquido, expone al aire durante 10 s y descongela a 37 °C durante 30 s.
  2. Primera dilución del semen: Tomar una muestra del semen descongelado (250 μL) y diluir con 1,0 mL de medio DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 0,1 mg/mL de albúmina sérica bovina, 12,5 μM β-mercaptoetanol y antibiótico-antimicótico al 1%.
    1. Incuba la mezcla a 37 °C durante 30 minutos.
  3. Segunda dilución de semen: toma 25 μL de la primera dilución, dilúyelos en 975 μL de 1x DPBS suplementado con 0,1 mg/mL de poli(alcohol vinílico) (PVA) o polivinilpirrolidona (PVP), deposita en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y mezcla suavemente.
    1. Mantén esta mezcla a 37 °C durante todo el proceso de recogida de celdas.

4. Preparación de platos para la colección de los SC

  1. Recoge los SCs usando dos tapas de platos de cultivo de 35 mm de diámetro.
  2. Prepara la primera tapa de la siguiente manera (tapa #1, Figura 2A).
    1. Toma 100 μL de la segunda dilución de semen y deposétala en el centro de la tapa (véase la Figura 2A).
    2. Haz una segunda microgota (10 μL) de 1x DPBS suplementada con 0,1 mg/mL de PVA o PVP encima de la primera gota (véase la Figura 2A).
    3. Cubre ambas microgotas completamente con aceite de parafina para evitar la evaporación y mantener la estabilidad térmica durante la aspiración del SC.
  3. Preparar la segunda tapa para eliminar los restos celulares y los espermatozoides asociados (tapa #2, Figura 2B).
    1. Colocar tres gotas de 30-50 μL de 1x DPBS complementadas con 0,1 mg/mL de PVA o PVP en el centro de la tapa; No los cubras con aceite mineral.
      NOTA: Prepara este plato de cultivo solo después de que todas las células somáticas hayan sido seleccionadas para evitar cambios en las propiedades fisicoquímicas de la solución de DPBS debido a la exposición al aire.
  4. Realiza todos los pasos de microaspiración bajo un microscopio invertido a temperatura ambiente. Evita cambios bruscos de temperatura.

5. Procedimiento de microaspiración para aislar los CS de semen equino criopreservado

  1. Coloca la primera tapa (tapa #1, Figura 2A) en el escenario del microscopio, lista para recoger los SCs.
  2. Selecciona una micropipeta con el diámetro adecuado para recoger los SCs y conéctala al sistema mecánico de aspiración.
  3. Inserta cuidadosamente la micropipeta en la microgota y alínea la base con la tapa del plato. Una vez que la pipeta ha aspirado el medio de cultivo, comienza la captura individual de los SCs.
  4. En la parte inferior del plato deberían verse diversas morfologías celulares (Figura 3).
  5. Coloca la punta de la micropipeta junto a cada nivel y aspira bajo presión negativa. Aspira células circulares y alargadas independientemente de su tamaño. El volumen de aspiración varía entre capturas de SCs.
  6. Después de capturar 10 células, deposarlas en la microgota situada en la parte superior (10μL) (Figura 2A). Repite este paso hasta obtener el número requerido de SCs para el experimento de clonación.
  7. Guarda todas las células somáticas capturadas dentro de esta microgota durante todo el proceso de recogida.
  8. Una vez obtenido el número requerido de SC para la clonación, realizar un procedimiento sencillo de lavado utilizando microgotas para eliminar los espermatozoides, restos celulares y contaminantes microbianos.
  9. Toma la segunda tapa de platos y realiza un lavado secuencial de tres pasos de los SCs (tapa #2, Figura 2B):
    1. Captura las células somáticas con una micropipeta y depositalas cuidadosamente en la superficie de la primera gota. Déjales reposar durante 3-5 minutos (Figura 2B; Caída #1).
    2. Repite el paso 5.9.1 y deposa las gotas en la segunda gota (Figura 2B; Caída #2).
    3. Repite el paso 5.9.1 y deposita las células somáticas en la tercera gota (Figura 2B; Caída #3).
  10. Como paso final, depositar las células somáticas aisladas en una microgota final preparada para su uso posterior en procedimientos de transferencia nuclear de células somáticas (Figura 4D).
    NOTA: Aspirar los SCs en el menor volumen medio posible durante cada recaptura para minimizar los espermatozoides, residuos y contaminantes microbianos.

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Resultados

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La Tabla 1 muestra que la técnica de microaspiración recupera eficazmente células somáticas del semen equino criopreservado, con tasas de captura que oscilan entre 317,7 ± 9,60 a 424,7 ± 33,65 células/hora en tres sementales. El semental #03 tenía el mayor rendimiento, demostrando la eficacia del método incluso con muestras almacenadas a largo plazo. Los datos indican que la técnica aísla de forma consistente y efectiva las células somáticas del semen, y que las tasas med...

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Discusión

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La micromanipulación de células y gametos ha permitido simplificar técnicas complejas de reproducción asistida. Ejemplos de estos incluyen la clonación somática mediante Clonación Hechaa Mano 21, la eclosiónasistida 22, la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)23 y la microinyección pronuclear encigotos 24, entre otros.

El desarrollo de métodos efic...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.

Agradecimientos

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Los autores agradecen al Laboratorio de Gestión de la Reproducción, Departamento de Producción Agrícola y Animal, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco (UAM-X), por su apoyo técnico y logístico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2 beta MercaptoetanolSIGMAM7522Cultivo de células somáticas
1x DPBSGIBCOREF-21600010Manipulación de células somáticas
Etanol absolutoHYCELEL CRISOL 50181-1L73Para fabricar pipetas
Antimicótico antibiótico 100xINVITRO SA. Mé xicoCultivo de células somáticas
Capilares borosilicatos (1,0 mm de sobredosis y multiplicados por 0,78 mm de diámetro interior y multiplicados por 100 mm de longitud)APARATO DE HARVARD, EE. UU.EC1-30-0035Para fabricar pipetas
BSASIGMAA3311Cultivo de células somáticas
DMEM/F12 mediaGIBCOREF-12500-062Cultivo de células somáticas
Muestra de semen criopreservado equinoLas muestras de semen criopreservadas se obtuvieron de un distribuidor comercial y se conservaron durante más de 19 años en nitrógeno líquido. Todas las muestras congeladas de semen equino se obtuvieron de distribuidores comerciales autorizados por las autoridades veterinarias correspondientes en México, de acuerdo con el Estándar Oficial Mexicano NOM-027-ZOO-1995, Proceso Zoosanitario de Semen de Animales Domésticos.
Retícula ocularHerramienta para fabricar pipetasEquipamiento requerido
Suero fetal bovinoGIBCOREF-26140-079Cultivo de células somáticas
Ácido hidrofluíricoSIGMA-ALDRICH339261Para fabricar pipetas
Microscopio óptico invertidoEclipse, TE 200NIKONMicromanipulación de células somáticas
Laboratorio  Horno secoHerramienta para fabricar pipetasEquipamiento requerido
MicroforjaHerramienta para fabricar pipetasEquipamiento requerido
Set de micromanipuladores para microscopio invertidoMicromanipulación de célulasEquipamiento requerido
Extractor de micropipetasP-97, INSTRUMENTO SUTTERHerramienta para fabricar pipetasUsa los siguientes ajustes y mdash; Calor: 720; Tirón: 30; Velocidad: 50; Hora: 220; Presión
Aceite mineralSIGMAM8410Manipulación de células somáticas
Nunclon  Platos de cultivo celular, diamétrica y tiempos; H 35 mm y tiempos; 10 mmNUNCLONNunc 153066
PVASIGMAP8136Cultivo de células somáticas
PVPSIGMAP5288Cultivo de células somáticas
Solución azul de tripán 0,4%GIBCOREF- 15250061Tinte celular

Referencias

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Microaspiration TechniqueSomatic Cell IsolationCryopreserved Equine SemenNuclear Donor CellsSomatic Cell Nuclear TransferEquine CloningCell Morphology SelectionMicropipette AspirationSequential Cell WashingDiploid Cell Recovery

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