Tinción con peroxisomas en células de mamíferos utilizando sondas específicas de peroxisomas

Resumen

Las sondas PeroxiSPY se utilizan para detectar peroxisomas en células de mamíferos. Aquí demostramos cómo utilizar las sondas para teñir peroxisomas en células vivas y fijas.

Resumen

Los peroxisomas son orgánulos ubicuos con roles esenciales en la salud humana, y su disfunción conduce a una amplia variedad de trastornos genéticos. La visualización de los peroxisomas es clave para identificar la disfunción de los peroxisomas; Sin embargo, el progreso se ha visto limitado por la falta de sondas específicas para peroxisomas. Al desarrollar PeroxiSPY, sondas específicas para peroxisomas que imitan metabolitos naturales de peroxisomas, permitimos la detección, seguimiento y cuantificación en tiempo real de la dinámica de los peroxisomas en células vivas de mamíferos. Además, la aplicación de esta técnica a células de pacientes con trastornos de los peroxisomas revela fenotipos patológicos. Aquí ofrecemos un protocolo detallado para la detección de peroxisomas en células vivas de mamíferos, así como para la detección de peroxisomas tras la tinción en células fijas. Demostramos cómo teñir peroxisomas en células vivas utilizando sondas específicas de peroxisomas, centrándonos en la preparación de las células, el momento del procedimiento, la reproducibilidad y la resolución de problemas. Estas sondas permiten la detección rápida, específica y no tóxica de peroxisomas en células vivas, ofreciendo un método único y cuantitativo para evaluar la función de los peroxisomas y su disfunción en trastornos relacionados con los peroxisomas.

Introducción

El peroxisoma es el orgánulo eucariota más abundante, con algunas células que superan los mil^peroxisomas. Sus funciones son fundamentales para el desarrollo del organismo y la adaptación^{metabólica 1,2}, evidenciadas por una variedad de trastornos de peroxisoma humanos, típicamente condiciones neurodegenerativas y neurometabólicas incurables en niños^{pequeños 3,4}. Hasta donde sabemos, anteriormente ha habido una falta de métodos selectivos disponibles para marcar peroxisomas en células y tejidos vivos. Estas herramientas son invaluables para aplicaciones de investigación y diagnóstico, permitiendo la medición directa y cuantitativa de varios aspectos de la formación y función de los^{peroxisomas 6}. Estas sondas son lo suficientemente versátiles como, por un lado, proporcionar una lectura cuantitativa de la función del peroxisoma en las células y, por otro, ser utilizadas en ensayos de eficacia traslacional o como diagnóstico para trastornos de^{peroxisomas 6}. La tinción con PeroxiSPY es una técnica rápida, específica y no citotóxica para la detección no invasiva de peroxisomas de células vivas. Aquí describimos cómo teñir peroxisomas en líneas celulares de mamíferos usando sondas de peroxisoma (las sondas también han demostrado tinción peroxisomal específica en embriones de pez cebra, pero no son adecuadas para la tinción de peroxisomas en células de Arabidopsis thaliana ^{de la planta 6}). El tinte se puede lograr en menos de 10 minutos. La sonda puede detectarse durante horas o fijarse mediante un protocolo de fijación de paraformaldehído para una posterior tinción inmunológica.

Protocolo

1. Tinción de células vivas

1. Preparación de cultivo celular para imagen de células vivas (duración: 24 h)
   NOTA: El estudio siguió los protocolos estándar de cultivo celular para todos los experimentos. Las líneas celulares se mantuvieron en DMEM o DMEM/F12 para SH-SY5Y, suplementadas con suero bovino fetal al 10% (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina, a 37 °C y 5% de_CO2. Algunos sistemas de imagen son sensibles a la composición del medio. Si el microscopio detecta la señal del rojo de fenol en el medio, utiliza alternativas libres de rojo de fenol. Además, si el microscopio no está equipado con una cámara de_CO2 , sustituye el medio por uno que contenga HEPES (pH 7,4).
   1. Un día antes del experimento, se dividió las células en una placa de imagen con fondo de cristal para lograr una confluencia del 30-70% al día siguiente.
      NOTA: En este protocolo se usaron placas de 4 pozos de 35 mm.
      1. (Crítico) No uses células hambrientas o estresadas para dividirlas durante el experimento. Asegúrate de que las líneas celulares tengan cambios de nuevo en el medio regularmente (al menos cada 2-3 días) y que se separen antes de alcanzar el 90% de confluencia. El objetivo es tener una línea celular sana para asegurar una tinción uniforme.
         NOTA: Algunas células, por ejemplo, las células madre, requerirán un recubrimiento de vidrio con una capa adecuada, por ejemplo, Matrigel, que no interfiere con la tinción.
2. Preparación del montaje de imágenes (duración: 1h)
   NOTA: La imagen de orgánulos y la dinámica de orgánulos requiere una alta resolución espacial. Para este protocolo, se utilizó un microscopio confocal equipado con un módulo fotomultiplicador GaAsP, una cámara de CO₂ y una unidad de control de temperatura. La imagen se realizó utilizando un modo de escaneo galvanómetro bidireccional con un objetivo CFI Plan Apo Lambda 60x aceite NA 1.42, y se utilizó un láser de 561 nm (50 mW) para la sonda de 555. Usa un láser de 640 nm o equivalente para la sonda de 650. Los peroxisomas se visualizaron en líneas celulares humanas. El tiempo de incubación con las sondas puede variar según las líneas celulares. Se recomienda optimizar el tiempo visualizando las células en diferentes momentos tras la tinción (Figura 2A).
   1. Inicia el sistema confocal. Asegúrate de que el_CO2 y la temperatura (37 °C) estén estabilizados durante 20 minutos antes de comenzar la tinción e introducir las células al microscopio.
      NOTA: (Crítico) Es esencial verificar que las células se mantengan sanas durante todo el experimento mediante inspección visual y que se mantengan el pH y la temperatura del medio. Esto puede lograrse utilizando unidades de control para los parámetros e inspeccionando visualmente el colorado del medio, si se utiliza rojo fenol. Para eso, se pueden usar controladores de temperatura y CO₂ .
   2. Configura el software del microscopio confocal. Inicia el software y enciende el láser de 561 nm para la tinción con sonda de 555. Ajusta los parámetros de adquisición y potencia láser. Este protocolo utiliza un 1% de potencia láser, una ganancia alta alta de 100 y una resolución de 1024 a 1024 píxeles con 3 zoom para obtener imágenes de las células.
3. Tinción con peroxisoma (Duración: 1-5 min)
   1. Pipetear una alícuota de la sonda para una concentración final de trabajo de 1 μM, por ejemplo, para 0,5 mL de medio, y pipetear 0,5 μL de la sonda.
   2. Selecciona el pozo a teñir y etiquétalo por fuera con un rotulador.
   3. Desde el pozo elegido, pipetear todo (0,5 mL) del medio y dispensarlo en un tubo microcentrífuga que contiene la alícuota de la sonda del paso 1.3.1.
      NOTA: Es fundamental eliminar todo el material del pozo en este paso para asegurar una tinción uniforme.
   4. Pipetea arriba y abajo 3 veces para mezclar el medio y la sonda. Aspira la mezcla total en la pipeta.
      NOTA: Se puede usar mezcla por vórtice en lugar de pipeteo.
   5. Dispensa la mezcla de nuevo en el pozo elegido gota a gota, asegurándote de que la pipeta esté en contacto con la pared del pozo. Al volver a añadir la mezcla al pozo, pon en marcha un temporizador de 10 minutos.
   6. Cierra la tapa, añade una gota de aceite de inmersión sobre el objetivo (este protocolo utiliza un objetivo de 60× de aceite) y coloca la placa en el microscopio para la imagen.
      NOTA: Se recomienda optimizar la concentración de la sonda para cada línea celular para asegurar una tinción uniforme. Se recomienda hacer pruebas a 0,25, 0,5, 1 y 2 μM durante 5-20 minutos; las concentraciones más bajas suelen teñir con un fondo más bajo (Figura 2A). Dependiendo de la línea celular y la sensibilidad del detector del microscopio, las células teñidas pueden ser visualizadas desde tan pronto como 5 minutos tras la incorporación de la sonda hasta 24 horas después de la adición. En algunos casos, por ejemplo, al realizar imágenes de células madre, la visualización de células puede realizarse durante más de 180 minutos tras la adición de la sonda sin cambio en la señal. En cualquier momento, el medio puede cambiarse para limpiar la sonda. Esto provocará una pérdida gradual de la tinción en unos 30 minutos para HEK293T células.
4. Imagen confocal de peroxisomas en células vivas (duración: 10 min-3 h)
   1. Una vez que la placa esté posicionada en el microscopio, ajusta el enfoque en las células del pozo que está teñido y comienza la imagen.
   2. Una vez que las células están enfocadas, ajusta la ganancia (HV o sensibilidad del detector) y la potencia del láser siguiendo las directrices estándar de configuración de microscopios confocales.
   3. Encuentra y coloca (Zoom-in) en el grupo de celdas. Después de enfocar las celdas, ajusta los parámetros de adquisición a la calidad de imagen requerida.
      1. Establece los parámetros de imagen para la adquisición de imágenes: 0,5-1% de potencia láser, 100 HV (ganancia) en el software NIS-Elements. Comprueba que la imagen no esté saturada (si lo está, cambia la intensidad y la ganancia).
      2. Selecciona el tamaño del escaneo. Adquiere 1024 imágenes 1024 px, velocidad de escaneo (1/2-1/4), promedio de línea (2), zoom (3) que sea apropiado para la imagen que se está realizando.
         NOTA: Los peroxisomas se desplazan durante la adquisición de imágenes, lo que puede dar lugar a artefactos. Los parámetros recomendados están optimizados para minimizar las trazas de movimiento asegurando la calidad suficiente de las imágenes para su cuantificación. Al crear un time-lapse, asegúrate de que se especifiquen intervalos, duración y bucles antes de iniciar el vídeo. Las sondas son fotográficas.
   4. Adquiere y guarda todas las imágenes con etiquetas accesibles (aquí, se utiliza el formato de software Nikon .nd2 NIS-Elements).

2. Tinción de células fijas

1. Preparación de cultivo celular para imagen de células vivas (duración: 24 h)
   NOTA: Se siguieron los protocolos estándar de cultivo celular para todos los experimentos. Las células Huh7 se mantuvieron en DMEM/F12 suplementadas con 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, a 37 °C y 5% de CO₂.
   1. Un día antes del experimento, divide las células en una placa con cubiertas para lograr una confluencia del 30-70% al día siguiente.
      NOTA: Sembrar 50.000 celdas/pozo en placas de 12 pozos con tapas de 18 mm, o 15.000 celdas/pozo en placas de 24 pozos con tapas de 13 mm.
2. Tinción con peroxisoma (Duración: 1-5 min)
   1. Diluir la sonda con un medio nuevo hasta una concentración final de trabajo de 4 μM en un tubo vacío fotosensible a microcentrífuga, por ejemplo, para 0,5 mL de medio, y pipetear 2 μL de la sonda (solución estándar: 1 mM).
   2. Selecciona el pozo para teñir y etiquétalo por fuera con un rotulador.
   3. Desde el pozo elegido, aspira todo (0,5 mL) del medio y reemplácelo por el medio sonda del paso 2.2.1. Dispensa el medio de sonda en el pozo elegido gota a gota, asegurando que la pipeta esté en contacto con la pared del pozo.
   4. Al volver a añadir la mezcla al pozo, incuba las células a 37 °C durante 10-15 minutos.
      NOTA: A partir de este momento, las celdas son fotosensibles y deben cubrirse con papel de aluminio.
3. Fijación post-tinción y peroxisomas de imagen en células fijas
   1. Después de teñir, retira cuidadosamente el medio y lava las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   2. Aplica solución de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS a temperatura ambiente durante 20 minutos.
   3. Retira cuidadosamente el PFA en un contenedor de residuos específicamente designado. Lava las células una vez con PBS.
      PRECAUCIÓN: La PFA es tóxica y debe eliminarse según la normativa institucional.
   4. Para proceder con la inmunofluorescencia, sigue los pasos siguientes
      1. Añade 0,5% de Triton-X (diluido en PBS) para permeabilizar las células. Déjalo 2,5 minutos.
      2. Retira con cuidado el Tritón-X. Lava las células dos veces, durante 10 minutos con PBS.
      3. Bloquea con solución de albúmina sérica bovina al 5% (BSA) en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
      4. Proceda con el procedimiento estándar de inmunofluorescencia.

Resultados

Las sondas PeroxiSPY están diseñadas para imitar sustratos naturales de peroxisomas: ácidos grasos ramificados y de cadena muy^{larga 5}. Por lo tanto, la tinción resultará en una importación de las sondas de la subfamilia D de unión a la adenosina trifosfato (ATP) desde el citoplasma a los peroxisomas ^5,6,7. Dependiendo del estado metabólico celular, el transporte ABCD dependiente de ATP puede importar las sondas de forma eficiente y rápida, lo que resultará en una alta proporción de peroxisoma a citoplasma de intensidad de fluorescencia (Figura 1A). Pasos críticos para asegurar una alta proporción incluyen evitar la inanición de las células reemplazando regularmente el medio celular y evitando el crecimiento celular en alta confluencia.

Para verificar la especificidad de la tinción con peroxisomas, se recomienda incluir varios controles (Figuras 1B, C). Análisis de colocalización con un marcador peroxisomal de referencia, por ejemplo, un marcador de importación de proteína - GFP-SKL (Figuras 1B,C). Además, si existen líneas celulares deficientes en peroxisomas, por ejemplo, PEX19 KO, la tinción estará ausente en esas células (Figura 1B)^5,8.

Las sondas de peroxisomas pueden utilizarse para medir la densidad de peroxisomas (Figura 1C)^5,9, y se están desarrollando para evaluar la importación de sustratos, la dinámica y las interacciones de los peroxisomas. Para la imagen cuantitativa, es importante estandarizar el procedimiento de tinción, el momento de adquisición de la imagen (por ejemplo, 10-20 minutos después de la tinción), la preparación de la línea celular y los parámetros de adquisición. Algunas líneas celulares requieren optimización de la concentración de la sonda así como del tiempo para mejorar la intensidad de la señal de los peroxisomas en relación con el fondo citosólico; por ejemplo, 250 nM y 20 min funcionan mejor para las células COS-7 (Figura 2A). Las células metabolizan las sondas, lo que conduce a una reducción gradual de la tinción de peroxisomas con el tiempo; sin embargo, la proporción de peroxisoma a citoplasma puede mejorar en 24 horas (Figura 2B). Además, desarrollamos un procedimiento de fijación que permite la co-tinción con anticuerpos y la visualización de los peroxisomas en un momento posterior (Figura 2C,D).

Figura 1: Imagen de células vivas de peroxisomas. (A) Esquema de la tinción. (B) Microscopía confocal de células WT y PEX19 KO HEK293T que sobreexpresan GFP-SKL y se colorean con la sonda peroxisoma roja (1 μM durante 10 minutos). Barras de escala: 1 μm y 10 μm. Se muestra el perfil representativo de intensidad. (C) Microscopía confocal de fibroblastos humanos sobreexpresando GFP-SKL y teñido con PeroxiSPY (1 μM durante 10 minutos). Barras de escala: 1 μm y 10 μm. Se muestra el perfil representativo de intensidad. (D) Microscopía confocal de células SW13 (Corteza Adrenal), SH-SY5Y (Neuroblastos), CCL-136 (Miocitos), HaCat (Ceratinocitos), U2OS (Osteoblastos) y HEK293T (Riñón Embrionario Humano) teñidas con la sonda peroxisoma roja (1 μM durante 10 minutos). Barras de escala: 2 μm y 10 μm. La cuantificación se realizó utilizando Fiyi como se describió^{anteriormente 9} y muestra el número de peroxisomas por micrón cuadrado, media ± SEM, N = 100 células agrupadas a partir de 3 repeticiones biológicas, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, Prueba de Kruskal-Wallis. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Optimización por imagen con peroxisoma y tinción de células fijas. (A) Microscopía confocal de células COS-7 (riñón del mono verde africano) teñidas con la sonda de peroxisoma rojo según el protocolo (1 μM durante 10 minutos; antes de la optimización) y bajo condiciones optimizadas (250 nM durante 20 minutos; después de la optimización). Barra de escala - 10 μm. La intensidad media de píxeles de peroxisomas y citosol se cuantificó usando Fiji y se expresó como una razón. N = 7 celdas (antes de la optimización) y 21 celdas (después de la optimización). Promedio ± SEM, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, prueba de Shapiro-Wilks. (B) Microscopía confocal de HEK293T células teñidas con la sonda de peroxisoma rojo (1 μM) durante 15 minutos y 24 horas. La cuantificación muestra la intensidad de fluorescencia de peroxisomas y citoplasma, así como la proporción de peroxisoma a citoplasma, media ± SEM, N = 680 peroxisomas agrupados a partir de 3 repeticiones biológicas, **** - p < 0,0001, prueba de Shapiro-Wilks. (C) Microscopía confocal de células Huh7 teñidas con sondas de peroxisoma utilizando el protocolo de fijación. Los peroxisomas se coloraron junto con anticuerpo primario anti-PEX14 (1:100 en solución bloqueante, incubación de 1 hora en RT) y anticuerpo secundario (1:1000 en solución bloqueadora, anti-Rabbit Alexa Fluor 488 para cabra, incubación de 1 hora en RT). Se muestran imágenes representativas de confocales. Barras de escala - 10 μm. (D) La cuantificación muestra los cambios en la intensidad de la fluorescencia de los peroxisomas durante la fijación y permeabilización realizados en HEK293T células según el protocolo, media ± SEM, N = 100 células agrupadas a partir de tres repeticiones biológicas, **** - p < 0,0001, prueba de Shapiro-Wilks. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Esta sencilla detección de peroxisomas puede realizarse en menos de 10 minutos en células animales. La tinción con PeroxiSPY permite la visualización, cuantificación y trazado de peroxisomas en células vivas y está disponible en forma de rojo (Tabla de Materiales) y de sonda^{roja lejano 5} (Tabla de Materiales). La tinción proporciona una visualización similar a la de una tinción clásica basada en señal de dirección peroxisoma (PTS1)^{l 10} (Figura 1B) sin necesidad de sobreexpresión. Los fluoróforos son fotoestables y pueden usarse para imágenes de superresolución y adquisición a largo plazo de la dinámica de los peroxisomas en diferentes condiciones^{experimentales 5,9,11}. Además, las sondas son sensibles al funcionamiento de los peroxisomas; por lo tanto, pueden utilizarse para detectar y cuantificar la patología de^{peroxisomas 5} para aplicaciones de investigación y diagnóstico. La tinción con peroxisomas depende del metabolismo de los peroxisomas y de la capacidad de los peroxisomas para importar y oxidar ácidos grasos. Por ello, es importante optimizar la concentración y el momento de las líneas celulares utilizadas. Aquí presentamos un procedimiento estándar que funciona para las líneas celulares que probamos; sin embargo, el momento de la tinción puede extenderse a 24 horas sin pérdida de la relación de intensidad de fluorescencia entre peroxisoma y citoplasma (Figura 2B).

Las sondas se probaron en muchas líneas celulares de mamíferos (Figura 1 y Figura 2) y en células y embriones 5 de pez cebra, mostrando especificidad a peroxisomas y facilidad de uso. Estas sondas no se probaron en otras líneas celulares animales, y las condiciones, así como las concentraciones de las sondas, deberán optimizarse para ellas. Las sondas no tiñen peroxisomas en las células de Arabidopsis thaliana ⁵.

Aquí se discuten algunos problemas y sus respectivas soluciones para la resolución de problemas. Si la proporción peroxisoma/citoplasma es demasiado baja (tinción baja con peroxisoma), asegúrate de que las células estén recién divididas y luego vuelve a dividirlas para la tinción. Usa una confluencia del 30-70% para teñir. Optimiza la concentración de la sonda (una concentración demasiado alta llevará a superar la capacidad de peroxisoma para captar las sondas) y el momento de la medición (por ejemplo, véase la Figura 2A). Utiliza un plato de fondo de cristal de 35 mm (teñir en placas de 96 pozos es más complicado debido a la mezcla de bajo volumen). Asegúrese de que las sondas se añaden al tubo de la microcentrífuga y se mezclen bien con el medio antes de añadirlas a las celdas. Diferentes líneas celulares y condiciones variables influyen en la tinción. Finalmente, lavar la sonda reducirá el fondo; sin embargo, la señal se irá perdiendo gradualmente, reduciendo el tiempo en que se pueden realizar imágenes de forma eficaz.

Si no hay peroxisomas visibles, asegúrate de que la sonda esté mezclada con el medio. Aumenta la concentración de la sonda (por ejemplo, hasta 2 μM). Introduce un marcador peroxisomal adicional para asegurar que los peroxisomas puedan visualizarse. Si hay variación de célula a célula en la tinción, es importante eliminar todo el medio y mezclarlo bien con la alicuota antes de volver a añadir a las células. Esto garantiza una mancha uniforme. Si aún existe variación, es posible que la población celular sea heterogénea en su capacidad de importación de sustratos peroxisomas. La sincronización de las células mediante la división regular ayuda a la tinción uniforme. Si no se detecta señal, comprueba que los ajustes láser en los microscopios sean compatibles con los parámetros de excitación/emisión de la sonda. Si el fondo fuera de la celda es demasiado brillante, lavar las sondas para eliminar ese fondo; sin embargo, la señal se irá perdiendo gradualmente, reduciendo la ventana de tiempo en la que se pueden realizar imágenes de forma eficaz. Además, la fijación puede usarse para reducir el fondo. Si la señal post-fijación es muy débil, comprueba si la señal se pierde tras la adición de Triton-X 100. Este paso puede modificarse o eliminarse dependiendo de la aplicación posterior. Reduce los pasos de lavado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo anti-PEX14	Proteintech	10594-1-AP
Microscopio Confocal	Nikon	A1r	Cualquier microscopio confocal con un objetivo de alto NA, por ejemplo, 60x aceite NA1.4
DMEM	Pan Biotech	P04-03590	Medios de cultivo celular
Placas de imagen con fondo de vidrio	Cellvis	D35C4-20-1.5-N
Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488	ABCAM	AB150081
HEK293T	ATCC	CRL-3216
PeroxiSPY555	Espirocromo	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/	https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
PeroxisPY650	Espirocromo	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/	https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2