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Artículo de método

Modelado de macrófagos asociados al tumor in vitro: el papel de los factores secretados en la dinámica del microambiente tumoral

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DOI:

10.3791/69406

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30 de diciembre de 2025

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1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

En este artículo

Resumen

Este manuscrito presenta un protocolo in vitro para generar células similares a macrófagos asociadas a tumores mediante la exposición de monocitos humanos a medios condicionados de líneas celulares tumorales.

Resumen

Los macrófagos presentan una plasticidad notable, lo que les permite adquirir estados funcionales distintos en respuesta a una variedad de señales ambientales. En los tumores sólidos, suelen constituir la población de células inmunitarias más abundante dentro del microambiente tumoral, donde se les denomina macrófagos asociados al tumulo (TAMs). Los TAM interactúan estrechamente con las células malignas, promoviendo activamente la progresión tumoral, la angiogénesis y la evasión inmunitaria. Las células tumorales pueden reprogramar los macrófagos mediante contacto directo célula-célula y una amplia variedad de factores secretados, moldeando su polarización hacia fenotipos protumorales. Para estudiar estos mecanismos de polarización TAM in vitro, proponemos un método que expone monocitos humanos a factores solubles presentes en medios condicionados por líneas celulares tumorales. Este protocolo permite la generación de macrófagos similares al TAM bajo condiciones controladas, facilitando el análisis de cambios fenotípicos y funcionales inducidos por señales derivadas del tumor. Nuestro enfoque ofrece un modelo reproducible y fisiológicamente relevante para investigar las interacciones tumor-macrófagos, profundiza nuestra comprensión de la reprogramación de macrófagos y apoya la investigación en nuevas estrategias terapéuticas en inmunología e inmunoterapia del cáncer.

Introducción

Los macrófagos son células inmunitarias innatas multifuncionales cuya notable plasticidad les permite adoptar fenotipos diversos en respuesta a señalesambientales 1. Dentro de los tumores sólidos, los macrófagos suelen convertirse en la población de células inmunitarias más abundante y se diferencian en macrófagos asociados al tumulo (TAMs)2. Estas células son reprogramadas activamente por el microambiente tumoral para apoyar el crecimiento tumoral, promover la angiogénesis, facilitar la metástasis y suprimir respuestas inmunitarias antitumorales eficaces. Las células tumorales impulsan esta polarización tanto a través de interacciones directas célula-célula como de un complejo repertorio de factores secretados, incluyendo citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento, que remodelan los programas transcripcionales y funcionales de losmacrófagos 3. Esta interacción dinámica sustenta el papel central de los TAM en la biología del cáncer y destaca la plasticidad de los macrófagos tanto como un desafío como una oportunidad para la intervenciónterapéutica 2.

La relevancia clínica de los TAM se reconoce cada vez más: su abundancia en tumores suele correlacionarse con un mal pronóstico y resistencia a lasterapias 4,5. En consecuencia, losTAMs 6 han surgido como objetivos terapéuticos atractivos. Actualmente, se están investigando estrategias destinadas a bloquear su reclutamiento, inhibir su supervivencia o reprogramarlos hacia fenotipos inflamatorios ytumorcidas 6. Por tanto, comprender los mecanismos por los cuales los factores derivados de tumores polarizan los macrófagos en TAMs es esencial para desarrollar inmunoterapias eficaces. Aunque el bloqueo de puntos de control inmunitario ha mostrado gran éxito en muchos tipos de cáncer, su eficacia sigue siendo limitada en otros7. Combinar terapias dirigidas a células T, como anticuerpos anti-Proteína de Muerte Celular Programada 1 (PD-1) o Anti-Ligando de Muerte Celular Programada 1 (PDL-1), con estrategias de reprogramación de macrófagos puede potenciar la respuesta inmunitaria antitumoral global.

Los modelos experimentales tradicionales para estudiar la biología TAM han incluido modelos de cáncer murino in vivo, que ofrecen un entorno complejo y fisiológicamenterelevante 8. Estos modelos han proporcionado conocimientos fundamentales sobre el reclutamiento y el funcionamiento de los TAM. Sin embargo, diferencias significativas entre especies en la señalización inmunitaria, la biología tumoral y la ontogenia de los macrófagos pueden limitar la traducción directa a enfermedadeshumanas 9,10. Además, la complejidad de los sistemas in vivo dificulta aislar y estudiar vías de señalización específicas o eventos moleculares que impulsan la polarización de los macrófagos.

En cambio, los modelos in vitro ofrecen condiciones más simples y controladas para diseccionar estos mecanismos. El enfoque más utilizado consiste en polarizar macrófagos derivados de monocitos humanos con estímulos definidos: gamma de interferón (IFN) y lipopolisacáridos bacterianos (LPS) para generar macrófagos proinflamatorios (M1), o interleucina 4 (IL-4) e interleucina 10 (IL-10), o dexametasona para obtener varios subtipos de macrófagos antiinflamatorios (M2) 11,12,13,14 . Estos modelos han ayudado a identificar marcadores moleculares y programas de transcripción asociados con estados canónicos de polarización de los macrófagos. No obstante, no logran replicar el complejo entorno multifactorial que los macrófagos encuentran dentro de los tumores, donde la polarización resulta de la influencia simultánea de numerosos mediadores solubles, señales metabólicas e interacciones célula acélula 15,16. Aunque la clasificación clásica M1/M2 sigue siendo útil para describir estados funcionales de los macrófagos, ahora está claro que existen muchas más poblaciones de macrófagos de lo que se pensaba anteriormente. El trabajo del grupo del Dr. Ginhoux y otros, utilizando enfoques transcriptómicos unicelulares, ha demostrado la amplia diversidad de subconjuntos de macrófagos que se encuentran tanto en condiciones fisiológicas como en la enfermedad17,18. Esto pone de manifiesto que los TAMs, aunque a menudo se describen como similares a perfiles similares a M2, no son estrictamente equivalentes a macrófagos diferenciados únicamente con citocinas canónicas; más bien, comparten ciertas características pero también muestran diferencias distintas y dependientes del contexto.

Para cerrar esta brecha, presentamos un protocolo in vitro que modela la polarización tipo TAM exponiendo macrófagos derivados de monocitos humanos a medios condicionados recogidos de líneas celulares tumorales. Este método captura la influencia del secretoma tumoral, una rica mezcla de citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento secretados por las células cancerosas. Así, ofrece un sistema relevante y experimentalmente accesible para investigar la reprogramación fenotípica y transcripcional de los macrófagos en respuesta a factores solubles derivados de tumores. A diferencia de enfoques anteriores en los que los monocitos estaban directamente expuestos a medios condicionados por tumores, este protocolo se centra específicamente en la reprogramación de los macrófagos, reflejando así mejor el comportamiento de los macrófagos residentes dentro del microambientetumoral 19,20. Además, incorpora un panel optimizado y sencillo de marcadores superficiales para evaluar la polarización de los macrófagos mediante citometría de flujo, lo cual es fácil de implementar y puede ampliarse según las necesidades delinvestigador 14,21. Por último, dado que se ha demostrado que el M-CSF prepara monocitos hacia un fenotipo similar alM2 10,15,22,23,24, lo omitimos deliberadamente para asegurar que cualquier polarización observada de los macrófagos resulte específicamente de la exposición a medios condicionados derivados de líneas celulares tumorales.

Este enfoque tiene varias fortalezas: mantiene la reproducibilidad y simplicidad de los sistemas in vitro, utiliza células humanas primarias para una mayor relevancia traslacional y refleja mejor la naturaleza heterogénea y multifactorial del microambiente tumoral que los modelos de citocinasindividuales 25,26,27,28. Además, facilita estudios comparativos de respuestas de macrófagos a medios condicionados de diferentes tipos de tumores o células cancerosas genéticamente modificadas, y sirve como plataforma para probar agentes farmacológicos que pueden alterar la polarización TAM. Más allá de su aplicabilidad general, este método puede adaptarse a diferentes modelos tumorales seleccionando líneas celulares adecuadas o ajustando la proporción de medios condicionados. No obstante, los usuarios deben ser conscientes de que la variabilidad entre donantes sanos y líneas celulares tumorales puede afectar a la reproducibilidad, subrayando la importancia de un diseño experimental cuidadoso y una estandarización.

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Protocolo

Se recogieron muestras de sangre periférica de donantes sanos tras consentimiento informado, conforme a la Declaración de Helsinki. Este protocolo fue aprobado por el Comité de Ética Institucional de la Universidad de Buenos Aires. Consulte la Tabla de Materiales para detalles sobre todos los materiales y reactivos utilizados en este protocolo.

NOTA: Mantener condiciones estériles durante todo el protocolo, trabajando en un gabinete de Bioseguridad nivel 2 (BSL-2), y asegurar la viabilidad celular >90%. Para su eliminación, todos los residuos biológicos deben primero ser desinfectados remojándolos en una solución de hipoclorito de sodio al 10% durante al menos 30 minutos y luego colocados en el recipiente adecuado para la eliminación de riesgos biológicos.

1. Cultivo de líneas celulares tumorales y preparación de medios condicionados

  1. Descongelar la línea celular de cáncer de mama humano (u otro tumor seleccionado) MDA-MB-231 de triple negativo a partir del almacenamiento de nitrógeno líquido. Sumerge inmediatamente los criotubos que contienen líneas celulares en un baño maria a 37 °C y gira suavemente el vial para asegurar un descongelamiento rápido y uniforme. Retira el vial rápidamente cuando esté casi descongelado.
  2. Transfiere las celdas descongeladas a un tubo de centrifugación de 15 mL que contiene 5 mL de solución salina con fosfato tamponado estéril (PBS). Centrifuga la suspensión de celdas a 400 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: El proceso de descongelación debe realizarse rápidamente para preservar la viabilidad celular.
  3. Descarta cuidadosamente el sobrenadante y resuspende rápidamente la pellet celular en 1 mL de medio modificado Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) fresco y completo que contenga alta glucosa (4,5 g/L) con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 4 mM de glutamina y 1 mM de piruvato sódico. Cuenta las células del pellet resuspendido, realizando la siguiente dilución en serie en dos pasos:
    1. Primero prepara una dilución en suspensión 1:5 en un medio DMEM estéril y luego (1:2) con la tinción de viabilidad Trippan Blue para obtener una dilución final de 1:10.
    2. Utiliza un microscopio óptico para contar las células viables dentro del hemocitometro de Neubauer (o cámara de conteo). Cuenta las celdas viables (solo las que excluyen el tinte azul) y determina el número medio de celdas viables por cada gran casilla de esquina.
    3. Calcula la concentración final usando la siguiente fórmula: Celdas/mL = (Promedio de celdas por cuadrado) x (Factor de dilución) x 10.000.
      NOTA: Resuspende las células en un volumen deseado de medio DMEM completo para obtener una concentración final de 1x 105células/mL.
  4. Sembra 2,5 x 105 a 5,0 x 105 celdas en un matraz de cultivo T25 que contenga 5 mL de medio DMEM completo. Mantener el cultivo a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% deCO2 hasta alcanzar la densidad celular requerida para la cosecha.
  5. Al día siguiente de la siembra, comprueba la fijación de las células bajo un microscopio. Si más del 50 % de las células están flotando (lo que indica muerte celular), aspira suavemente el medio antiguo y reemplázalo por 2,5 mL de medio fresco y precalentado.
  6. Monitoriza el crecimiento celular a diario. Cuando el cultivo alcanza aproximadamente el 90% de confluencia (se estima 2,3 x 106 células en un matraz de T25), normalmente en un plazo de 5 días, las células están listas para ser subcultivadas (divididas). Para dividir las celdas en una proporción de 1:8, sigue estos pasos:
    1. Retira el medio gastado usando una pipeta Pasteur estéril.
    2. Enjuaga la monocapa celular una vez con 3 mL de PBS estéril 1x para eliminar el suero residual, que inhibe la tripsina. Aspira y descarta 1x PBS.
    3. Añadir a las células 1 mL de solución de ácido etilendediaminéstetraacético (EDTA) al 0,25% de tripsina y 1 mM e incubar a 37 °C, 5% de CO2 en una incubadora humidificada durante 3 minutos para desprender las células.
      NOTA: El tiempo óptimo de incubación con tripsina/EDTA depende de la línea celular específica y puede necesitar ajustarse. Revisa las células bajo el microscopio después de 3 minutos para asegurarte de que están completamente separadas.
    4. Neutraliza la actividad enzimática añadiendo 3 mL de medio DMEM completo. Inmediatamente después, haz una pipetea suave arriba y abajo para desprender y suspender completamente las células.
  7. Transfiere 3,5 mL de la suspensión de la celda a un tubo cónico de 15 mL y centrifuga durante 5 minutos a 400 x g en RT.
  8. Retirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 1 mL de medio congelante (que debe contener 90% de FBS más 10% de dimetil sulfóxido (DMSO)). Transfiere y alicuota la suspensión celular en crioviales, asegurando una concentración de 5 x 105 células por tubo para uso futuro.
    1. La congelación debe enfriarse gradualmente colocando los cryovials en un recipiente Mr. Frosty (o similar de congelación controlada). Transfiere el recipiente a un congelador a -80°C y deja que las células se congelen toda la noche. Las células pueden mantenerse a -80°C durante unos días, pero luego deben trasladarse a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
      NOTA: Lleva registros detallados de los conductos celulares y utiliza los primeros pasajes para experimentos. Se recomienda usar células con menos de 20 conductos.
  9. Una vez que los nuevos cultivos vuelvan a alcanzar una confluencia del ~90%, aspirar y recoger el sobrenadante en un tubo cónico de 15 mL. Si quieres mantener el cultivo en curso, sustituye el volumen recogido por un medio DMEM nuevo y completo.
    1. Centrifuga el sobrenadante recogido a 400 × g durante 5 minutos a 4 °C para pelletar y eliminar los restos celulares. Conserva el sobrenadante (el medio acondicionado clarificado) y desecha el pellet.
  10. Alicuota el medio acondicionado clarificado en porciones de 1 mL, etiqueta los tubos y guárdalos a -20 °C hasta su uso.
    NOTA: Para el control de calidad, siempre lleva un registro de la fecha de recogida del soporte condicionado y si la alícuota ha sido previamente descongelada. Se recomienda encarecidamente evitar descongelar la misma alicota más de dos veces. Además, utiliza el condicionado dentro del mes siguiente a la fecha de congelación para asegurar su actividad óptima.

2. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

NOTA: Los PBMC se aíslan de 40 mL de sangre periférica anticoagulada con citrato de sodio al 3,8%. El aislamiento se realiza mediante un gradiente de densidad Ficoll-Hipaque (1077) y centrifugación. Todo este protocolo debe realizarse en condiciones estériles en un gabinete BSL2.

  1. Alicuelta la muestra de sangre periférica anticoagulada en un tubo cónico de 15 mL o 50 mL antes del siguiente paso de centrifugación.
  2. Centrifugar muestras de sangre a baja velocidad, 200 × g durante 15 minutos en RT para separar los componentes sanguíneos. Este proceso produce plasma rico en plaquetas (PRP) como capa superior y la fracción celular (glóbulos rojos y blancos) por debajo. Utiliza un ajuste de centrífuga de aceleración: 4 y desaceleración: 2, cuando el máximo sea 5.
  3. Tras la centrifugación, aspira el sobrenadante (la fracción superior), que es el PRP, y transfiere a un nuevo tubo estéril.
    NOTA: Si es necesario para experimentos posteriores, el PRP recolectado puede centrifugarse nuevamente a 600 × g en RT durante 10 minutos (máxima aceleración y desaceleración) para eliminar las plaquetas, y almacenar el plasma sin plaquetas a -20 °C para otros ensayos.
  4. La fracción inferior celular obtenida de la centrifugación inicial en el paso 2 debe diluirse suavemente hasta obtener un volumen final de 2 a 3 veces usando PBS estéril a temperatura ambiente de 1x. Homogeneizar suavemente mediante inversión de la suspensión resultante y utilizarla para la centrifugación con gradiente de densidad de Ficoll-Hipaque.
  5. Dispensa 15 mL de Ficoll-Hipaque a temperatura ambiente en un tubo estéril de 50 mL.
  6. Aplica cuidadosamente y lentamente 30 mL de sangre diluida sobre el Ficoll-Hipaque, asegurando que las dos fases no se mezclen.
  7. Centrifugar el tubo con capas de sangre Ficoll durante 25 minutos a 600 × g en RT. Ajustar la centrífuga sin freno (aceleración: 1; Desaceleración: 0).
  8. Utiliza una pipeta Pasteur estéril para desechar al menos 4 mL de la fracción superior obtenida y evitar derrames. Luego se utiliza la misma pipeta para recuperar el anillo blanco que contiene las PBMC y que se forma entre la fracción superior y la fracción transparente de Ficoll-Hipaque. Evita coleccionar Ficoll con el anillo PBMC.
  9. Transfiere el anillo PBMC del tubo a un tubo centrífugo estéril de 15 mL con al menos 3 mL de PBS 1x.
  10. Llena el tubo de 15 mL con más PBS 1x y centrifuga a 600 × g (aceleración y desaceleración máximas) durante 10 minutos en RT.
  11. Retira el sobrenadante por inversión, llena de nuevo con 1 PBS y centrifuga a 600 × g (máxima aceleración y desaceleración) durante 10 minutos en RT.
  12. Retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet PBMC en 2 a 3 mL de PBS estéril 1x más un 2% de FBS inactivado por calor (1x PBS-2% FBS), luego sube el volumen a 10 mL. Cuenta las células, preparando una suspensión 1:5 de celda diluida en frío estéril 1x PBS y luego (1:2) en azul de tripán al 0,4% para obtener una dilución final de 1:10. Utiliza una cámara celular en un microscopio óptico como se describe en el paso 1.3.2 para el contar.
  13. Reduce la suspensión PBMC a 300 × g durante 5 minutos a 8-10 °C. Resuspender las células en un volumen deseado de 1x PBS-2% FBS estéril y frío para obtener una concentración final de 108 células/mL. Deja estas celdas a 4 °C hasta el siguiente paso.
    NOTA: En este punto, los PBMCs recogidos pueden congelarse en un vial criogénico a 108 células/mL en medio congelante (90% FBS-10% DMSO). Guárdalos a -80 °C en un recipiente Mr. Frosty durante la noche para que las células se congelen lentamente. Al día siguiente, transfiere las células a una caja de almacenamiento y déjalas a -80 °C durante un par de días, o transfieras a un tanque de nitrógeno líquido durante un largo periodo de almacenamiento o continúa con el protocolo.

3. Clasificación de monocitos CD14+ usando perlas magnéticas

NOTA: Los monocitos purificados CD14+ se obtienen de PBMC utilizando un kit de selección magnéticade selección positiva 11 para CD14+ humano. El porcentaje de células CD14+ en PBMC depende del donante, pero puede estimarse en un 10% (entre 5 y 20%). Adapta el número inicial de PBMC y los volúmenes finales de reacción en función del número requerido de monocitos para tu experimento. El volumen mínimo de reacción sugerido es de 100 μL, incluso procesando menos de 1 × 107 PBMC.

  1. Añade 10 μL del cóctel de selección positiva por cada 100 μL de PBMCs, sube y baja pipeteando y mantenlo en hielo durante 15 minutos.
  2. Haz un vórtice en la suspensión de los talones durante 30 segundos antes de usarlos. Luego añade 10 μL de las perlas por cada 100 μL de suspensión PBMC. Mezcla bien y incuba durante 15 minutos sobre hielo.
  3. Añade 1 PBS - 2% FBS - 1 mM EDTA a un volumen final de 2,5 mL, mezcla suavemente la suspensión e inserta el tubo en el imán e incuba durante 5 minutos.
  4. Invierte el imán (sin quitar el tubo) sobre un tubo receptor de descarte durante 2-3 segundos, evitando cualquier movimiento de agitación. Las células positivas permanecerán en el tubo.
  5. Saca el tubo del imán y añade 1x PBS - 2% FBS - 1 mM EDTA sobre las paredes del tubo hasta un volumen final de 2,5 mL.
  6. Vuelve a insertar el tubo en el imán e incubar durante 5 minutos.
  7. Invierte el imán (sin quitar el tubo) sobre un tubo receptor de descarte durante 2-3 segundos, evitando cualquier movimiento de agitación. Saca el tubo del imán y añade 3 mL de 1x PBS-2% FBS sobre las paredes del tubo para recuperar todas las células.
  8. Toma 10 μL para contar el número de células CD14+ en una cámara de Neubauer con un microscopio óptico. Diluye con Trippan Blue 1:2.
    NOTA: Calcule el número de celdas siguiendo esta ecuación: Número de celdas CD14+ = número de células vivas por cuadrante x factor de dilución x 10,000.
  9. Colocar la suspensión de la celda CD14+ en un tubo estéril nuevo de 15 mL y lavar las celdas centrifugando a 600 × g (máxima aceleración y desaceleración) durante 10 minutos a 4 °C.
  10. Resuspender las células CD14+ con medio RPMI 1640 suplementado con un 10% de FBS y un 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) a un volumen conveniente para obtener 2,5 x 106 células/mL para el siguiente paso, teniendo en cuenta el número de células obtenidas.
    NOTA: Mantenga los monocitos CD14+ en hielo hasta el siguiente paso para evitar la unión de estas células a la pared del tubo de plástico.

4. Diferenciación de macrófagos

  1. Placas purificadas monocitos CD14+ en 2,5 x 105 células suspendidas en 250 μL de medio RPMI completo (10% FBS-1% PS) por pozo en una placa tratada con 48 pozos.
    NOTA: También se puede hacer con la mitad de células en una placa tratada con 96 pozos.
  2. Añade agua estéril a los pozos vacíos circundantes para reducir la evaporación durante la incubación de placas.
  3. Incubar las células durante 5 días a 37 °C con un 5% de CO₂ en una incubadora humidificada sin molestar, monitorizando diariamente la morfología, diferenciación y viabilidad.
    NOTA: Aunque se puede añadir M-CSF (25 ng/mL) para diferenciación, confirmamos que nuestro protocolo utiliza solo un 10% de FBS de alta calidad para obtener los macrófagos M0 tras cinco días de cultivo. Recomendamos específicamente evitar el M-CSF debido a su potencial para activar monocitos hacia un fenotipo similar al deM2 10,22.

5. Exposición de macrófagos a medios condicionados y análisis

  1. En el día 5 de diferenciación, retirar suavemente el 50% (125 μL) del medio de cada pozo y reemplazarlo por:
    1. 125 μL de medio completo RPMI fresco (control),
    2. 125 μL de medios condicionados por líneas celulares tumorales (por ejemplo, de MDA-MB-231), o
    3. 125 μL de medio completo DMEM (control para medios acondicionados).
      NOTA: Para la optimización inicial con nuevas líneas celulares tumorales, analiza una variedad de concentraciones de medios condicionados (por ejemplo, 10%, 25% y 50%). Se sugiere este rango para asegurar la viabilidad de los macrófagos y los cambios en la diferenciación. Elige la mayor concentración de medios acondicionados que muestren alta viabilidad de macrófagos.
  2. Continúa la incubación hasta el día 7.
    NOTA: En el día 5 se obtienen macrófagos M0, luego 2 días más de cultivo en presencia de medios condicionados son suficientes para inducir la expresión de marcadores de polarización superficial. Los marcadores de superficie de polarización se determinan mediante citometría de flujo, de forma similar, cuando se utilizan citocinas estandarizadas para generar macrófagos M1o M2 11,14.
  3. Evalúa diariamente la viabilidad y morfología de los macrófagos bajo el microscopio.
    NOTA: Monitoriza la diferenciación de los macrófagos diariamente durante el periodo de cultivo de 7 días. La adherencia celular se utiliza como indicador de un cultivo sano y viable. Una mayor proporción de células fusiformes indica un aumento de la diferenciación y polarización en el grupo de tratamiento de medios condicionados (CM), como se muestra en la Figura 2.

6. Recolectar macrófagos para la evaluación de marcadores de polarización mediante citometría de flujo

NOTA: Opcionalmente, para ampliar aún más la caracterización fenotípica de macrófagos asociados a tumores, aislar ARN para medir la expresión de genes asociados a la polarización (por ejemplo, TGM2, IRF-4 y CXCL10) mediante reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (qPCR) o recoger los supernadantes del cultivo para medir la producción canónica de citocinas (por ejemplo, TNFα, IL-6 e IL-10) mediante un ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA) según lo reportado por nuestro grupo11, 14.

  1. Desecha aspirando suavemente con una pipeta Pasteur estéril o vierte el volumen total del medio de cultivo de cada pozo y añade 200 μL de tampón frío 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA para la extracción celular.
  2. Incuba durante 10 a 15 minutos sobre hielo y luego añade 200 μL de 1x PBS-2% FBS para diluir el tampón EDTA. Recoge los macrófagos pipeteando arriba y abajo (aún en hielo) durante 5 minutos adicionales hasta que todas las células se desprendan.
    NOTA: Este paso es crucial para obtener un buen número de macrófagos viables. Es importante no alargar más el tiempo de exposición a EDTA de lo recomendado para preservar la viabilidad celular. Revisa las células bajo el microscopio tras finalizar el procedimiento para asegurarte de que están completamente desprendidas.
  3. Recoge los macrófagos en un microtubo de 1,5 mL y lávalos con 1 mL de 1x PBS-2% FBS mediante centrifugación a 400 × g durante 5 minutos a 8-10 °C.
  4. Resuspende el pellet de macrófagos con 200 μL de 1x PBS-5% FBS y transfiere a una microplaca de fondo redondeado de 96 pozos para bloquear inespecíficos en RT durante 15 minutos. Centrifuga las celdas a 400 x g durante 5 minutos a 8-10 °C.
  5. Descarta el sobrenadante invirtiendo rápidamente la placa.
  6. Prepara el cóctel adecuado de anticuerpos conjugados directamente en 1x PBS - 2% FBS usando un factor de dilución 1:50 para cada anticuerpo. Tiñe cada muestra con 50 μL del cóctel de anticuerpos e incuba durante 30 minutos en la oscuridad sobre hielo.
    NOTA: Cóctel de anticuerpos: CD11b-PE/Cy7 (200 μg/mL), CD64-AlexaFluor 647 (150 μg/mL), CD163-PerCP/Cy5.5 (200 μg/mL), hladr-pe (40 μg/mL) y CD206-AlexaFluor 488 (400 μg/mL). La concentración de anticuerpos pre-tittered se lista en la Tabla 1; los números de catálogo pueden encontrarse en la Tabla de Materiales.
  7. Lava los macrófagos teñidos añadiendo 150 μL de 1x PBS y centrifuga a 400 × g durante 5 minutos a 8-10 °C.
  8. Descarta el sobrenadante invirtiendo rápidamente la placa.
  9. Para medir la viabilidad celular, añade 100 μL del tinte de viabilidad reparable Zombie Violet (1:1.000 en 1x PBS) e incuba en la oscuridad durante 30 minutos sobre hielo.
  10. Lava las celdas teñidas añadiendo 100 μL de 1x PBS y centrifuga a 400 x g durante 5 minutos a 8-10 °C. Repite el procedimiento de lavado usando 200 μL de 1x PBS.
  11. Soluciona resuspendiendo la pellet celular con 20 μL de paraformaldehído fresco preparado al 1% y incubándolas durante 20 minutos sobre hielo y en la oscuridad.
    NOTA: Se utilizó paraformaldehído al 1% para la fijación, sin permeabilización. Opcional: El componente fijador comercial (del kit de fijador/permeabilización BD) también puede usarse para este paso11.
  12. Lava las pilas añadiendo 180 μL de 1x PBS-2% FBS y centrifuga a 400 x g durante 5 minutos a 8-10 °C. Repite el procedimiento de lavado usando 200 μL de 1x PBS-2% FBS.
  13. Descartar el sobrenadante mediante inversión de placa y volver a suspender el pellet en 200 μL de PBS 1x para llevarlo al equipo de citometría de flujo para su medición.
    NOTA: Si las muestras teñidas y fijas no pueden ser procesadas por citometría de flujo el mismo día, guárdalas a 4 °C y protégelas de la luz. Analiza las muestras lo antes posible en los días siguientes.
  14. Analizar los resultados de la citometría de flujo usando el software FlowJo. La estrategia de gating comienza excluyendo los escombros mediante dispersión hacia adelante y lateral (FSC/SSC). Posteriormente, selecciona macrófagos vivos como células violetas zombis CD11b⁺.
    NOTA: Dado que la autofluorescencia en macrófagos depende del donante, es esencial utilizar controles derivados del mismo donante para cada experimento.

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Resultados

Generamos células similares a macrófagos asociados a tumores (TAM) triple negativas tratando macrófagos derivados de monocitos con medios condicionados (CM) al 50% de la línea celular MDA-MB-231. Los monocitos se separaron de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de seis donantes sanos independientes y se diferenciaron siguiendo nuestro protocolo. La preparación de MC utilizó células MDA-MB-231 con confluencia del 90 % (Figura 1).

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Discusión

El protocolo descrito aquí proporciona un enfoque reproducible y práctico para estudiar la polarización similar a macrófagos asociada a tumores, exponiendo macrófagos derivados de monocitos humanos a medios condicionados por líneas celulares tumorales. Este sistema captura la influencia de factores solubles secretados por las células tumorales, que se sabe desempeñan un papel fundamental en la reprogramación de los macrófagos dentro del microambientetumoral

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

Reconocemos el apoyo financiero proporcionado por la Agencia Nacional para la Promoción de la Ciencia y la Tecnología (ANPCyT-FONCYT) mediante las subvenciones PICT 2021 I-INVI-00034 (a DR), PICT 2021-I-A-00807 (a E.A.C.S.) y PICT 2021-I-A-00716 (a A.E.E.). También agradecemos al Consejo Nacional de Investigación Científica y Técnica (CONICET) por la subvención PIP 2022-0763 y a la Universidad de Buenos Aires por PIDAE 2022, otorgado a A.E.E.

El M.C.L. fue beneficiario de la beca Legado Peruilh de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires y de una beca doctoral ANPCyT-FONCYT. D.R., E.A.C.S. y A.E.E. son investigadores de carrera en CONICET.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alexa Fluor 488 ratón anti-humano   CD206 Clon de anticuerpos 15-2BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.Cat# 321113; RRID:AB_571874
Alexa Fluor 647 clon de anticuerpos antihumanos CD64BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.Cat# 305012; RRID:AB_528867
BD Citofix/CitopermBD en Biociencias, San José, CA, EE. UU.Cat# 554714Kit de fijación/permeabilización
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), glucosa altaGibco y nbsp; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU. & NBSP;Cat# 11965092
Kit de selección positiva EasySep para humanos CD14; Cóctel de selección positiva de EasySep; Nanopartículas magnéticas EasySep; Imán fácil para separacionesSTEMCELL Technologies, Vancouver, CanadáCat# 18058
Citómetro FACS Canto  Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.
Suero fetal bovino, clasificado, Nueva Zelanda y nbsp;Gibco y comercio;   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU. & NBSP;Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Ciencias de la Vida, EE. UU.Cat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism   GraphPad Software Inc.RRID:SCR_002798
Partec CyFlow space citometer Sysmex Partec, Alemania
Clon de anticuerpos HLA-DR anti-PE L243BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.Cat# 307605; RRID:AB_314683
Clon de anticuerpos anti-ratón de rata PE/Cy7 CD11bBioLegend, San Diego, CA, EE. UU.Cat# 101216; RRID:AB_312799
Clon de anticuerpos antihumano CD163 de ratón PerCP/Cy5.5BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.Cat# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 MedioGibco y nbsp; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU. & NBSP;Cat# 11875119
Solución de piruvato de sodioSigma-Aldrich Merck, San Luis, MIS, EE. UU. Cat#  S8636
Tripsina-EDTA (0,25%), fenol rojoGibco y nbsp; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU. & NBSP;Cat# 25200056
Kit de Viabilidad Reparable Zombie VioletBioLegend, San Diego, CA, EE. UU.Gato# 423113

Referencias

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