Method Article

Método rápido de microperlas magnéticas para la purificación eficiente de neutrófilos de baja densidad

DOI:

10.3791/69407

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los neutrófilos de baja densidad (LDN) aumentan significativamente en varias enfermedades. Las LDN generalmente se aíslan mediante clasificación celular. Presentamos un método práctico para obtener LDN pura y viable. Después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre periférica, las células se incuban con microperlas magnéticas y luego las LDN se separan a través de columnas magnéticas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los neutrófilos, leucocitos importantes de la inmunidad innata, se han considerado tradicionalmente una población celular homogénea. Sin embargo, la evidencia reciente ha demostrado que los neutrófilos existen en varias subpoblaciones. Una de esas subpoblaciones son los neutrófilos de baja densidad (LDN). Las LDN se encuentran en pequeñas cantidades en la sangre de individuos sanos, pero su número aumenta significativamente en enfermedades como el lupus eritematoso sistémico, trastornos autoinmunes, cáncer e infecciones. En estos casos, la LDN puede participar en la patogénesis de la enfermedad. La única forma de aislar la LDN es mediante la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre periférica. Sin embargo, después de la centrifugación, las LDN se copurifican con células mononucleares. Por lo tanto, estudiar esta subpoblación de neutrófilos es un desafío. No existe una metodología estándar para separar las LDN de las células mononucleares. Por lo general, las LDN se separan mediante clasificación celular en un citómetro de flujo. Sin embargo, este método requiere largos tiempos de clasificación (horas) para obtener suficientes células puras para estudios funcionales posteriores. Esto afecta seriamente la viabilidad y función de las células. Aquí, proponemos un método práctico para obtener grandes cantidades de LDN puro y viable en poco tiempo. Después de la centrifugación en gradiente de densidad, la fracción celular mononuclear se incuba con microperlas magnéticas anti-CD66b y luego las LDN se separan a través de columnas magnéticas en < 30 min. Las LDN purificadas (células CD66b+ ) se marcan con anticuerpos monoclonales contra CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b y CD98, y se analizan mediante citometría de flujo para su confirmación. Las LDN purificadas son completamente funcionales como lo indica su capacidad para producir especies reactivas de oxígeno y para formar trampas extracelulares de neutrófilos. Este nuevo método de purificación da como resultado LDN con alta pureza (más del 90%) y viabilidad (más del 96%) en un corto período de tiempo. Este método se puede ampliar fácilmente para obtener un gran número de LDN pura para evaluar las funciones de LDN en diferentes enfermedades a través de análisis bioquímicos u otros análisis ómicos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los neutrófilos, los leucocitos predominantes en la sangre humana1, son participantes clave del sistema inmunológico innato. Llegan en grandes cantidades a los tejidos con inflamación o infección2. Allí, los neutrófilos activan varias funciones efectoras, como la fagocitosis 3,4, la degranulación 5,6 y la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET)7. Además, los neutrófilos también participan en la respuesta inmune adaptativa8. La visión clásica de los neutrófilos los considera células homogéneas producidas en la médula ósea con respuestas predeterminadas 9,10. Sin embargo, estudios recientes revelan que los neutrófilos son células heterogéneas con múltiples estados fenotípicos y funcionales tanto en estados sanos como en estados de enfermedad 11,12,13,14,15.

Entre varias subpoblaciones de neutrófilos, los neutrófilos de baja densidad (LDN) han atraído mucho interés debido a sus propiedades intrínsecas y porque aumentan en número en varias enfermedades 16,17,18. Se encontraron LDN en la sangre de pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) en 198619. Se detectaron siguiendo el proceso de separación de leucocitos en un gradiente de densidad 20,21. Después de la centrifugación de sangre o plasma rico en leucocitos en un medio de densidad (por ejemplo, Ficoll-Paque), los monocitos y linfocitos (conocidos como células mononucleares de sangre periférica [PBMC]) forman una banda en la parte superior (baja densidad) del tubo. Los neutrófilos se sedimentan en el fondo del tubo. Entre los PBMC, también se encontraron algunos neutrófilos; estos son LDN (Figura 1). Un pequeño número de LDN está en la sangre de individuos sanos22. Sin embargo, los números de LDN aumentan significativamente en múltiples condiciones de inmunosupresión e inflamación crónica, incluyendo LES23,24,sepsis 25, psoriasis26, asma27, artritis idiopática juvenil28, vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos (ANCA)29, infección por VIH30, malaria31 y tuberculosis32. Aunque el número de LDN aumenta en todas las patologías mencionadas, las LDN se han estudiado principalmente en el contexto del LES17. La LDN de la sangre de pacientes con LES parece tener una mayor capacidad para formar NET33, secretar grandes cantidades de mediadores proinflamatorios34 y activar las células T24. Sin embargo, en otras afecciones, como el cáncer, se informa que las LDN consisten en neutrófilos maduros e inmaduros35, con propiedades supresoras de células T 36,37,38. Del mismo modo, en pacientes con COVID-19, también se informa que las LDN suprimen la proliferación de células T39, pero al contrario del LES, las LDN parecen producir menos NET39. Por lo tanto, el origen, la composición y las propiedades funcionales de la LDN siguen siendo controvertidos.

Debido a que las LDN se encuentran junto con PBMC, estudiarlas es técnicamente complicado. Para explorar completamente las propiedades de LDN en diferentes patologías, es necesario purificarlas. Un procedimiento común de separación de LDN es la clasificación de células fluorescentes 22,40,41,42,43,44,45. Sin embargo, la clasificación celular requiere mucho tiempo para la separación celular. Esto puede conducir a la pérdida de células o a una baja recuperación si el tiempo de clasificación no es suficiente. Además, las células están sometidas a un estrés excesivo, lo que provoca resultados variables mientras se estudia la función de estas células. El tiempo de clasificación prolongado también aumenta el costo de los procedimientos experimentales y requiere personal especializado.

Aquí, presentamos un método rápido y eficiente para obtener un gran número de LDN humanas puras y viables en muy poco tiempo. Después de la centrifugación en gradiente de densidad, las LDN se separan mediante clasificación magnética de células (MACS; Figura 1). La principal ventaja de este método de purificación es que las LDN se separan con alta pureza (más del 90%) y viabilidad (más del 96%). Además, las LDN purificadas son completamente funcionales como lo indica su capacidad para generar especies reactivas de oxígeno (ROS) y liberar NET. Este protocolo se puede implementar fácilmente en cualquier laboratorio interesado en la biología de neutrófilos para separar rápidamente la LDN de la sangre de personas con múltiples enfermedades con el fin de estudiar más a fondo estas células.

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Protocol

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Todos los procedimientos de este protocolo siguen los lineamientos del Comité de Bioética en Investigación en Humanos del Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Todos los participantes dieron su consentimiento informado.

1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y neutrófilos de sangre humana

  1. Obtener aproximadamente 10 ml de sangre de un voluntario adulto sano mediante venopunción. Agregue 10 U/ml de heparina como anticoagulante.
    PRECAUCIÓN: Deseche la aguja en un recipiente para desechar agujas de riesgo biológico. Las jeringas y otros materiales en contacto con la sangre deben colocarse en una bolsa y esterilizarse en autoclave antes de desecharlas.
  2. En un tubo de centrífuga cónico de 15 ml, agregue 2 ml de dextrano T500 al 6% en PBS. Luego agregue 10 ml de sangre drenándola por el costado del tubo. Invierta el tubo un par de veces para mezclar la sangre y el dextrano.
  3. Deje reposar el tubo durante 45 min, mientras los eritrocitos se sedimentan. El plasma rico en leucocitos aparece por encima de la capa de eritrocitos.
  4. En otro tubo de centrífuga de 15 ml, agregue 5 ml de medio de gradiente de densidad. Pipetea con cuidado el plasma, sin tocar los eritrocitos, y colócalo sobre el medio. Se deben formar dos fases separadas.
  5. Centrifugar el tubo a 516 x g durante 20 min a 4 °C. Las células mononucleares (PBMC) forman una banda entre el plasma y las capas medias. Los neutrófilos forman un gránulo en la parte inferior (Figura 1).
  6. Aislamiento de PBMC
    1. Eliminar por aspiración el plasma en la parte superior de la PBMC sin tocar las células. Recolecte las células de la banda entre el plasma y el medio. Asegúrese de aspirar la menor cantidad de medio posible.
    2. Coloque las células en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml. Agregue 20 ml de PBS. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
    3. Aspire con cuidado el sobrenadante y raspe el tubo para separar las células. Agregue 10 ml de PBS frío para volver a suspender las células. Cuente el PBMC usando una cámara de Neubauer.
      NOTA: No utilice una pipeta para volver a suspender las células, ya que esto puede dañarlas.
  7. Aislamiento de neutrófilos
    1. Retire el medio de gradiente de densidad. Separe las células raspando el tubo y agregue 10 ml de PBS frío.
    2. Poner las células en un tubo de centrífuga nuevo de 50 ml y centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante y separar las células como se describe en el paso 1.6.3.
  8. Para eliminar los eritrocitos residuales, agregue 10 ml de solución hipotónica fría (NaCl al 0,2%, BSA al 1%, Hepes a 20 mM, pH = 7,4) y mezcle suavemente durante exactamente 1 min.
  9. Agregue rápidamente 10 ml de solución hipertónica fría (NaCl al 1,6 %, BSA al 1 %, HEPES a 20 mM, pH = 7,4) para que la solución sea isotónica.
  10. Cuente los neutrófilos usando una cámara de Neubauer (pureza > 95%). Peletizar las células centrifugando como en el paso 1.6.2. y resuspenderlos en PBS frío. Mantenga el tubo en hielo.
    NOTA: Se informa que la vida media de los neutrófilos in vitro es de 8 a 12 h 46,47,48. En nuestra experiencia con este protocolo, los neutrófilos mantienen sus funciones durante aproximadamente 6 a 8 h.

2. Purificación de neutrófilos de baja densidad (LDN)

  1. Centrifugar PBMC a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 120 μL de tampón de lavado en frío (1% de BSA en PBS).
  2. Añadir 35 μL de microperlas magnéticas CD66b. Incubar la mezcla en la oscuridad a 4 °C durante 30 min. Mezclar suavemente cada 10 minutos para evitar la agregación celular.
  3. Agregue 1 ml de tampón de lavado en frío. Coloque las células en una microcentrífuga y centrifugue a 400 x g durante 3 min.
  4. Retire el sobrenadante, separe el sedimento celular raspando el tubo y vuelva a suspender las células en 1 ml de tampón de lavado.
  5. Coloque una columna de separación magnética sobre un imán. Agregue 0,5 ml de tampón de lavado a la columna y déjelo pasar a través de la columna.
  6. Transfiera las células (1 ml) a la columna. Deje que el búfer pase a través de la columna gota a gota.
  7. Agregue 0,5 ml de tampón de lavado a la columna y déjelo pasar. Agregue otros 0,5 ml de tampón de lavado a la columna.
  8. Retire la columna del imán y colóquela en un tubo de microcentrífuga. Agregue 1 ml de tampón de lavado a la columna.
  9. Inserte el émbolo en la parte superior de la columna y aplique presión suavemente para eluir las celdas. Retire el émbolo y coloque la columna encima de un nuevo tubo de microcentrífuga.
  10. Agregue otro 1 ml de tampón de lavado. Inserte el émbolo en la parte superior de la columna y aplique presión suavemente para eluir las celdas.
  11. Coloque ambos tubos en una microcentrífuga y gírelos a 800 x g durante 3 min. Finalmente, vuelva a suspender las células (LDN) de ambos tubos en 1 ml de PBS frío. Mantener en hielo.
    NOTA: Los primeros 2 ml de flujo continuo contienen el resto de la PBMC. Estas células se pueden utilizar para otros estudios.

3. Citometría de flujo multicolor

  1. Vuelva a suspender las células purificadas a 1 x 106 celdas/ml en tampón de etiquetado (FBS al 1% en PBS). Agregue 250 μL de células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Agregue los anticuerpos correspondientes contra las moléculas de membrana de neutrófilos (para obtener más detalles, consulte la Tabla de materiales). Incubar las células durante 30 min a 4 °C, protegiéndolas de la luz.
  3. Agregue 1 ml de PBS. Coloque los tubos en una microcentrífuga y gírelos a 800 x g durante 3 min.
  4. Aspire el sobrenadante, rompa el sedimento celular golpeando el tubo y vuelva a suspender las células en 0,5 ml de paraformaldehído al 1%.
  5. Mantener las células a 4 °C protegidas de la luz, hasta que se analicen mediante citometría de flujo. Analice las células mediante citometría de flujo, capturando 10.000 eventos por muestra. Realice la clasificación de celdas como se describió anteriormente22.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es un irritante para la piel y el tracto respiratorio. Asegúrese de no respirar los vapores.

4. Detección de especies reactivas de oxígeno (ROS)

  1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agregue 2,5 x 105 celdas. Coloque los tubos en una microcentrífuga y centrifugue a 800 x g durante 3 min.
  2. Aspire el sobrenadante, raspe el tubo para separar las células y vuelva a suspender las células en 100 μL de 15 μM de dihidrorodamina 123 en PBS.
  3. Incubar las células protegidas de la luz a 37 °C durante 20 min. Agregue 1 ml de PBS.
  4. Coloque los tubos en una microcentrífuga y centrifugue a 800 x g durante 3 min. Aspire el sobrenadante, raspe el tubo para separar las células y vuelva a suspenderlas en 100 μL de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) de 50 nM en PBS.
  5. Incubar las células protegidas de la luz a 37 °C durante 45 min. Agregue 1 ml de PBS.
  6. Coloque los tubos en una microcentrífuga y gírelos a 800 x g durante 3 min. Aspire el sobrenadante, raspe el tubo para separar las células y vuelva a suspenderlas en 0,5 ml de paraformaldehído al 1% en PBS.
  7. Mantenga las células a 4 °C protegidas de la luz hasta que se analicen mediante citometría de flujo. Analice las células mediante citometría de flujo, capturando 10.000 eventos por muestra.

5. Visualización de trampas extracelulares de neutrófilos (NET)

  1. Coloque cubreobjetos en los pocillos de una placa de 12 pocillos y cúbralos con 10 μg/ml de poli-L-lisina. Incubar la placa durante la noche a 4 °C con una agitación suave.
  2. Retire la poli-L-lisina y lave los cubreobjetos con PBS, incubando la placa durante 5 minutos a temperatura ambiente con agitación suave. Lave los cubreobjetos con PBS dos veces más.
  3. Retire el PBS y deje secar los cubreobjetos colocando la placa dentro de una campana de flujo laminar durante 2 h.
  4. Vuelva a suspender LDN a 1 x 106 celdas/ml en medio RPMI-1640 con FBS al 5%. Tome 350 μL (3,5 x 105 células) de la suspensión celular y colóquelos en un pocillo de la placa de 12 pocillos que contiene los cubreobjetos.
  5. Mantener la placa durante 30 min en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C. Agregue 3,5 μL de PMA de 5 μM diluido en PBS a cada pocillo (la concentración final de PMA es de 50 nM).
  6. Mantener la placa durante 4 h en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C. Agregue 350 μL de paraformaldehído al 8% en PBS y mantenga la placa durante la noche en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C.
  7. Coloque una película transparente sobre un soporte de tubos de ensayo como se describió anteriormente49, de modo que se formen pozos en los orificios de los tubos.
  8. Llene cada pocillo con las diversas soluciones para lavar o teñir los cubreobjetos, formando una gran gota. Retire los cubreobjetos y colóquelos boca abajo sobre una gota de agua durante 5 min. De la misma manera, lave los cubreobjetos tres veces más con agua.
  9. Coloque los cubreobjetos boca abajo sobre una gota de tampón de bloqueo (BSA al 5% en PBS) e incube durante 20 min a temperatura ambiente.
  10. Transfiera los cubreobjetos a una gota del anticuerpo primario correspondiente (por ejemplo, antielastasa o anticitrulina) en tampón de bloqueo e incube durante 60 min a temperatura ambiente.
  11. Lava los cubreobjetos 2 veces en 0.01% Tween-20 en PBS. Transfiera los cubreobjetos a una gota del anticuerpo secundario correspondiente en tampón de bloqueo que contenga 150 nM de DAPI e incube durante 60 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
  12. Lava los cubreobjetos 2 veces en 0.01% Tween-20 en PBS. Coloque una gota de medio de montaje antidecoloración en un portaobjetos de vidrio y coloque los cubreobjetos boca abajo.
  13. Selle los cubreobjetos alrededor del perímetro con esmalte de uñas. Guarde las guías montadas a 4 °C, protegidas de la luz. Visualice los NET con un microscopio de fluorescencia.

6. Detección de trampas extracelulares de neutrófilos (NET)

  1. Resuspender las células a 5 x 105 células/ml en Sytox Green de 500 nM, diluido en medio RPMI-1640 con FBS al 5%.
  2. Tome 100 μL (5 x 104 células) de la suspensión celular y colóquelas en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos.
  3. Mantener la placa durante 20 min en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C. Agregue a cada pocillo 20 μL de PMA de 300 nM diluido en medio RPMI-1640 (la concentración final de PMA es de 50 nM).
  4. Transfiera la placa a un lector de microplacas precalentado. Incubar la placa a 35 °C durante 4 h, tomando medidas de fluorescencia desde la parte inferior de la placa cada 5 min (utilizando los filtros de excitación de 485 nm y de emisión de 528 nm).

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Results

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Los neutrófilos de baja densidad (LDN) en individuos sanos representan alrededor del 5% de la PBMC (Figura 2A). El protocolo descrito aquí suele ofrecer LDN pura (> 90%). Las células también se recuperan de manera eficiente (rendimiento de alrededor del 98%) con alta viabilidad (> 95%; Figura 2B). A modo de comparación, las LDN también se purificaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia como se desc...

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Discussion

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En general, se pensaba que los neutrófilos eran células homogéneas. Sin embargo, la evidencia reciente ha demostrado que los neutrófilos podrían existir como células con diferentes estados de activación y / o múltiples fenotipos. Por lo tanto, pueden existir varias subpoblaciones de neutrófilos 13,14,15. Una subpoblación de neutrófilos, los neutrófilos de baja densidad (LDN), ha adquirido un gra...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores afirman que este estudio se llevó a cabo sin ningún vínculo comercial o financiero que pudiera percibirse como un posible conflicto de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a César Díaz-Godínez (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) por su ayuda con la microscopía fluorescente para visualizar los NET. Esta investigación fue apoyada por la subvención PAPIIT IN205523 de la Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), México, y por la subvención CF-2023-I-610 de la Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Innovación (Secihti), México.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Anticuerpo policlonal anticitrulina en conejoAbCamab100932Dilución 1/50
Placa de cultivo tisular de 96 pozosCoprotagonista; Corning, Inc.3596
Anticuerpo IgG1 de ratón Alexa Fluor 488 antihumano CD11bBioLegend3013170,25 & mu; g/mL
Anticuerpo IgM de ratón Alexa Fluor 647 antihumano CD66bBioLegend3051090,05 & mu; g/mL
Anticuerpo anti-ratón IgG (H+L) contra la cabra, Alexa Fluor 488Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-11001Dilución 1/50
Anticuerpo monoclonal IgG1 de ratón contra elastasa de neutrófilosSanta Cruz BiotecnologíaSC-5554910 & micro; g/mL
Anticuerpo de burro anti-IgG de conejo (H+L), Alexa Fluor 555Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-31572Dilución 1/50
Anticuerpo IgG1 antihumano CD62L de ratón APCBioLegend3048090,03 & mu; g/mL
Anticuerpo IgG1 de ratón antihumano CD14 APC/Cianine7BioLegend3671070,25 & mu; g/mL
Attune NxT flow cytometer Thermo Fisher Scientific, Inc.(láseres azules/rojos)
Albúmina sérica bovina (BSA) Fracción VMP Biomedicina810025
Anticuerpo IgG1 de ratón Brilliant Violet 510 antihumano CD33BioLegend3666090,30 & mu; g/mL
DAPICalbiochem/EMD Millipore268298
Dextran T500Farmacosmos A/C5.51005E+11
Dihidrorodamina-123Anaspec, Inc.AS-85711
Clasificador de celdas FACSBecton Dickinson Modelo FACSAria
Suero fetal bovino (FBS)Gibco16000-044
Ficoll-PaqueMerck KGGE 17-1440-03
Anticuerpo IgG1 del ratón anti-humano CD98 del ratón FITCBioLegend3156030,30 & mu; g/mL
FlowJo SoftwareBecton DickinsonVersión 10, 2019
Microscopio invertido de fluorescenciaOlimpoModelo IX-70
HeparinaInhepar - PiSA Farmaceutica36601495000 UI/mL
HepesSigma AldrichH7006
Microperlas de quimerismo CD66b de MACSprepMiltenyi Biotec130-111-552
ImánMiltenyi Biotec130-042-102
Columna de separación magnéticaMiltenyi Biotec130-042-201
MicrocentrífugaEppendorfModelo 5415C
Lector de microplacasBioTek InstrumentsSinergia de modelos HT
ParaformaldehídoSigma Aldrich158127
Anticuerpo IgG1 de ratón anti-PE en el ratón CD10BioLegend3122030,05 & mu; g/mL
Anticuerpo IgG2a de ratón anti-PEBD Pharmingen550868Dilución 1/40
Anticuerpo IgG1 de ratón antihumano CD15 PE/Cianano5BioLegend3230130,25 & mu; g/mL
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma AldrichP8139
poli-L-lisinaSigma AldrichP2658
Centrífuga refrigeradaEppendorfModelo 5702R
Medio de cultivo tisular RPMI-1640Gibco23400-021
SYTOX GreenMolecular Probes, Inc.S-7020
Preadolescente-20 y nbsp;Sigma AldrichP2287
VectashieldLaboratorios VectorH-1000

References

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