Modelado de la metástasis cerebral: análisis estandarizado de la colonización metastásica y los patrones histológicos de crecimiento mediante inyección intracortical estereotáctica

Resumen

La técnica de inyección intracraneal estereotáctica permite la implantación precisa y localizada de células tumorales en la corteza del ratón, convirtiéndose en un modelo potente para estudiar la colonización metastásica del cerebro.

Resumen

Las metástasis cerebrales son una complicación común y devastadora de tumores sólidos avanzados, frecuentemente asociada con un mal pronóstico, deterioro neurológico y reducción de la calidad de vida. La incidencia de fallo del sistema nervioso central (SNC) y muerte neurológica está aumentando rápidamente, pero los mecanismos que impulsan las etapas finales de la metástasis cerebral, como la diseminación secundaria, la recolonización y la contribución del patrón histológico de crecimiento (HGP) como posible parámetro sustituto, siguen siendo poco comprendidos.

El modelo estandarizado de inyección intracortical estereotáctica permite la implantación precisa y reproducible de células tumorales, o poblaciones mixtas que incluyen componentes estromales o inmunitarios, directamente en la corteza cerebral del ratón. Este protocolo también apoya la creación de un archivo de tejidos preclínico, ofreciendo una plataforma robusta para investigar aspectos esenciales de la colonización del SNC, como: crecimiento metastásico, dinámicas de crecimiento específicas de HGP y mecanismos fisiopatológicos que contribuyen al fallo neurológico. Además, este modelo soporta pruebas farmacológicas en un contexto clínicamente relevante y reproducible.

A diferencia de los métodos de inyección sistémica (por ejemplo, vena caudal o intracardíaca), que están optimizados para estudiar los primeros pasos metastásicos pero resultan en tasas variables y a menudo bajas de colonización cerebral, el modelo estereotáctico asegura un crecimiento metastásico consistente y específico del cerebro y permite la investigación de las etapas avanzadas de la metástasis del SNC. En comparación con sistemas ex vivo como organoides o cultivos de cortes cerebrales, el modelo estereotáctico in vivo preserva la vascularización, la señalización sistémica y toda la complejidad del paisaje inmunológico cerebral, apoyando estudios a largo plazo sobre la progresión tumoral y la respuesta terapéutica.

Al proporcionar una plataforma reproducible y clínicamente relevante, nuestro modelo mejora la capacidad del campo para identificar marcadores pronósticos, explorar estrategias terapéuticas y comprender los mecanismos de la metástasis cerebral en etapas avanzadas.

Introducción

Las metástasis cerebrales son una complicación común y devastadora en pacientes con tumores sólidos, frecuentemente asociada a un mal pronóstico, un deterioro neurológico significativo y una reducción de la calidad^{de vida 1,2,3}. En particular, la insuficiencia del sistema nervioso central (SNC) y la muerte neurológica se han convertido en desenlaces cada vez más frecuentes en cánceres como el de pulmón, mama y ^melanoma 4,5,6,7. La insuficiencia del SNC en el contexto de las metástasis cerebrales puede deberse a diversos mecanismos, incluyendo el efecto de masa local, el edema peritumoral, la hemorragia intracraneal y la diseminación meníngea, que pueden actuar de forma independiente o sinérgica para finalmente provocar la muerte^{neurológica 8}.

A pesar de su importancia clínica, los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a la insuficiencia del SNC y las etapas finales de la progresión metastásica siguen siendo poco comprendidos. Procesos como la difusión alternativa, la diseminación secundaria y la recolonización rara vez son el foco de una investigación^{dedicada 8}. Tanto los estudios clínicos como preclínicos suelen limitar sus análisis a criterios como el número de metástasis cerebrales, el tamaño o la supervivencia global (SO), pasando así por alto conocimientos mecanicistas críticos y las verdaderas causas del deterioro y la muerte neurológica.

En este contexto, nosotros y otros hemos identificado patrones de crecimiento histológico (HGP) distintos en metástasis cerebrales que se correlacionan con los resultados^{clínicos 9,10,11}. Se han descrito tres HGPs principales: i) no infiltrativo, caracterizado por un borde tumoral bien delimitado a menudo rodeado por un borde astrocítico reactivo; ii) infiltrativo epitelial, donde grupos de células tumorales se infiltran en el parénquima cerebral adyacente sin contención astrocítica; y iii) infiltrativo difuso, caracterizado por una infiltración generalizada de células tumorales individuales o pequeños grupos, causando una astrogliosis^{extensa 10,12}.

Clínicamente, los HGPs infiltrativos se asocian con un pronóstico significativamente peor en comparación con los patrones no infiltrativos ^9,10,11. Además, las HGP parecen reflejar aspectos clave de la dinámica del crecimiento tumoral y los mecanismos que conducen a la muerte neurológica. Mientras que las metástasis no infiltrativas suelen expandirse como una sola lesión y restringir las estructuras vitales en el cerebro, las lesiones infiltrativas muestran diseminación secundaria (partiendo de la lesión existente y no del tumor primario) dentro del SNC, contribuyendo a daños generalizados y destrucción completa de órganos (datos no publicados). Las lesiones infiltrativas también pueden volver a colonizar las meninges, contribuyendo a la metástasis meníngea y complicando aún más el curso de la enfermedad^10,13. A pesar de su relevancia clínica, los HGPs de las metástasis cerebrales y las etapas finales de la colonización del SNC, incluyendo la diseminación secundaria y la recolonización del mismo órgano, siguen siendo poco estudiados, en gran parte debido a la falta de modelos experimentales adecuados.

Para cubrir esta brecha, presentamos un modelo de inyección intracraneal estereotáctica que permite la implantación precisa y reproducible de células tumorales o mezclas celulares que comprenden células tumorales y uno o más tipos celulares no tumorales en la corteza cerebral de ratones experimentales. Este modelo supera las limitaciones clave de los modelos de metástasis sistémica y ofrece una plataforma robusta para investigar aspectos esenciales de la colonización del SNC, como: interacciones tumor-célula inmune durante la^{colonización 14}, el impacto de mezclas celulares^{pretratadas 15}, el crecimiento^{metastásico 16}, la dinámica de crecimiento específica de HGP y los mecanismos fisiopatológicos que contribuyen al fallo neurológico (datos no publicados). Además, este modelo soporta pruebas farmacológicas en un contexto reproducible y clínicamente^{relevante 14,15}.

Este protocolo ofrece un marco metodológico detallado para implementar el modelo de inyección estereotáxica para estudiar las HGPs en metástasis cerebrales. También apoya el desarrollo de un archivo de muestras preclínicas estructurado y una biblioteca digital de tejidos para la investigación sistemática de la biología de la colonización del SNC en etapas avanzadas. Nuestro objetivo es permitir la identificación de biomarcadores pronósticos y potencialmente predictivos, contribuir al desarrollo de estrategias terapéuticas mejoradas y mejorar nuestra capacidad para predecir las respuestas agudas y crónicas del parénquima cerebral y del sistema inmunitario. A través de este enfoque, buscamos proporcionar una plataforma estandarizada para un estudio sistemático de la colonización del SNC y la progresión metastásica.

Protocolo

Todos los procedimientos animales descritos en este protocolo se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y fueron aprobados por el Gobierno de Baja Franconia (número de permiso: RUF-55.2.2-2532-2-1678). Este protocolo está diseñado para la inyección intracortical estereotáxica de células tumorales en ratones adultos singénicos (de 10 a 12 semanas) como modelo para la colonización metastásica del cerebro. Cualquier alteración del protocolo debe discutirse con el responsable designado para el bienestar animal.

1. Procedimientos preoperatorios

1. Aclimatación de animales
   NOTA: Los ratones deben estar aclimatados al menos 7 días antes del inicio de los procedimientos experimentales.
   1. Alojar animales experimentales en grupos bajo condiciones estándar de laboratorio (22 ± 2 °C, 50-60% de humedad relativa, ciclo de luz y oscuridad de 12 horas) con acceso ad libitum a alimento y agua.
   2. Para promover el bienestar y reducir el estrés, proporciona enriquecimiento ambiental en forma de material anidante, refugios y bloques para roer.
   3. Manipula a los animales una vez al día (3-5 minutos por sesión) durante el periodo de aclimatación para familiarizarlos con el contacto humano. Además, realiza procedimientos simulados que simulan aspectos clave de la próxima cirugía, incluyendo pesaje y exposición al sistema de anestesia, sin realizar ninguna intervención invasiva. Estas sesiones tienen como objetivo habituar a los animales al entorno procedimental y minimizar la variabilidad relacionada con el estrés.
2. Examen físico (chequeo médico prequirúrgico)
   NOTA: Antes de la inyección de células tumorales, todos los animales deben someterse a un examen físico y neurológico exhaustivo para descartar cualquier anomalía previa no relacionada con el estudio. Los animales que presenten déficits o anomalías deben ser excluidos del estudio. El examen físico puede realizarse el día antes de la inyección.
   1. Realizar una inspección física completa que evalúe la salud general, incluyendo el estado del pelaje, postura, respiración, forma de caminar, peso corporal y comportamiento general.
   2. Evalúa la función neurológica utilizando la prueba de alambre colgante para evaluar la fuerza de agarre y la coordinación. Para realizar la prueba de alambre colgante, suspende un cable horizontal (aproximadamente 2 mm de diámetro) entre dos soportes, con plataformas de escape situadas en los extremos, a unos 30 cm sobre una superficie acolchada. Coloca al ratón en el centro del cable y deja que lo agarre con las patas delanteras. Suelta el ratón y empieza a cronometrar inmediatamente. Termina la prueba cuando el ratón llegue a una de las plataformas o caiga. Considera un ratón exitoso si llega a la plataforma en menos de 60 s; Registrar como fallo si cae o no llega a la plataforma dentro de este límite de tiempo.
3. Preparación de estaciones de trabajo
   1. El día de la cirugía (día 0), instala cuatro estaciones de trabajo dedicadas como se describe a continuación para garantizar un flujo de trabajo eficiente y mantener la técnica estéril durante todo el procedimiento.
      NOTA: Utiliza materiales quirúrgicos estériles (subcapas, compresas de gasa, suturas, etc.) e instrumentos quirúrgicos autoclave (bisturí, fórceps, tijeras, espátula, etc.).
      1. Estación de trabajo #1 - Preparación animal preoperatoria: Utiliza esta estación para pesar los ratones, preparar la solución anestésica y administrar la anestesia. Prepara una superficie limpia que contenga una báscula, dos jaulas con cama (designa una para ratones anestesiados), una jeringuilla de 1 mL llena de solución anestésica y pomada para los ojos.
      2. Estación de trabajo #2 - Configuración previa y postoperatoria: Utiliza esta estación para realizar la incisión en el cuero cabelludo, sellar el cráneo y suturar la herida. Prepara una superficie limpia que contenga un bisturí, una jeringuilla de 10 mL con 0,9% de NaCl, cera ósea, una espátula, material para sutura, pinzas y tijeras, hisopos de algodón, desinfectante (70% etanol), una jeringuilla de 1 mL con analgésicos y una almohadilla térmica o una plataforma de calentamiento similar.
      3. Estación de trabajo #3 - Preparación de células tumorales: Utiliza esta estación para preparar la solución de células tumorales antes de la inoculación. Preparar una superficie limpia que contenga una nevera con una jeringuilla Hamilton de 10 μL y un tubo Eppendorf con suspensión celular en medio de matriz extracelular (ECM), una pipeta con puntas de 100 μL para la resuspensión de células, y tres vasos para limpiar la jeringuilla Hamilton tras la inoculación con células tumorales que contenga agua destilada, 70% etanol y 0,9% NaCl.
      4. Estación de trabajo #4 - Inyección estereotáctica: Utiliza esta estación para realizar la inyección estereotáctica de células tumorales en la corteza cerebral. Prepara una superficie limpia que contenga el marco estereotáctico para animales pequeños, un taladro dental de precisión, pinzas grandes y hisopos de algodón.
4. Preparación de la suspensión de células tumorales
   NOTA: Todos los procedimientos para la preparación de la suspensión de células tumorales deben realizarse en un armario certificado de seguridad biológica (capucha de Clase II) utilizando el equipo de protección individual (EPP) adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes y protección ocular, para garantizar la esterilidad y proteger al personal de posibles riesgos biológicos.
   1. Tripsiniza las células usando 1 mL de tripsina 1x EDTA.
      NOTA: Se recomienda utilizar células tumorales en la fase de crecimiento exponencial.
   2. Determinar el recuento celular con precisión utilizando un método de conteo adecuado (por ejemplo, hemocitómetro o contador celular automatizado).
   3. Preparar una suspensión celular que contenga 1 x 10³ células en 3 μL de medio ECM por animal. Utiliza una mezcla 2:1 de ECM y medio de cultivo estándar que contenga un 10% de FCS y otros suplementos según corresponda. Aumenta el volumen de suspensión y el número de células según el número de animales (por ejemplo, para 10 ratones, preparar 10 × 10^{3 células} en medio ECM de 30 μL).
      NOTA: El número de células inyectadas debe ajustarse cuidadosamente para cada línea celular.
   4. Mantén la suspensión de la célula en hielo hasta la inyección, durante un máximo de 2 horas.

2. Procedimientos intraoperatorios

1. Anestesia de ratón
   1. Pesa cada ratón usando una báscula de precisión y calcula el volumen requerido de anestesia en función del peso corporal.
   2. Administrar el volumen calculado del anestésico intraperitonealmente.
      NOTA: Utiliza un régimen anestésico que cubra todo el procedimiento (aproximadamente 2 horas). Por ejemplo: ketamina al 10% (clorhidrato de ketamina, 100 mg/mL; 100 mg/kg de peso corporal) combinada con Domitor (clorhidrato de medetomidina, 1 mg/mL; 0,25 mg/kg de peso corporal), o un protocolo equivalente.
   3. Una vez confirmada la profundidad adecuada de anestesia, coloque al ratón sobre una almohadilla térmica precalentada (mantenida a 37-38 °C) para apoyar la termorregulación y aplique pomada ocular para proteger la córnea de la sequedad.
      NOTA: Confirma la profundidad suficiente de anestesia pellizcando suavemente la pata trasera con pinzas. Procede con la cirugía solo si no se observa reflejo de abstinencia.
2. Preparación del cuero cabelludo e incisión
   1. Administrar lidocaína preoperatoriamente para administrar anestesia local en el lugar de la incisión. Utilice una solución de lidocaína al 1% (5 mg/mL) e inyecte aproximadamente entre 0,05 y 0,1 mL subcutáneamente a lo largo de la línea de incisión prevista. Deja al menos 2-3 minutos para que la anestesia haga efecto antes de proceder con la incisión del cuero cabelludo.
   2. Desinfecta a fondo el cuero cabelludo usando una solución a base de yodo.
   3. Estira la piel hasta que se estira y realiza una incisión media de unos 3-4 mm a lo largo del cráneo usando un bisturí estéril.
   4. Usando el mismo bisturí, raspa suavemente el periosteo para exponer la superficie del cráneo.
3. Configuración del marco estereotáctico, identificación de coordenadas y craneotomía
   1. Asegura la cabeza del ratón en el marco estereotáctico usando barras para los oídos.
   2. Utilizando el brazo estereotáctico, localice el Bregma (la intersección de las suturas coronal y sagital del cráneo) y luego mueve el brazo estereotáctico 2 mm anterior y 1 mm lateral (derecho) hasta el lugar de inyección objetivo en la corteza frontal indicado en la Figura 1B y márcalo con un marcador quirúrgico.
      NOTA: Si hay un vaso sanguíneo en el lugar de inyección previsto, la ubicación puede ajustarse hasta 0,5 mm para evitar hemorragias.
   3. Perfora cuidadosamente el cráneo usando un taladro dental de precisión, cuidando de no penetrar en la duramadre.
   4. Confirma la apertura sondeando suavemente con pinzas estériles para sentir la ruptura.
4. Inyección de células tumorales
   NOTA: Trabaja rápido durante este paso, ya que la ECM comienza a solidificarse a temperatura ambiente, lo que puede interferir con la precisión y consistencia de la inyección.
   1. Resuspende completamente la suspensión de células tumorales pipeteando arriba y abajo para asegurar una distribución uniforme.
      NOTA: Evita el vórtice para evitar la formación de burbujas de aire.
   2. Carga 3 μL de la suspensión de la celda en una jeringuilla Hamilton de 10 μL y colócala en el marco estereotáctico usando el soporte correspondiente.
   3. Coloca cuidadosamente la aguja de la jeringuilla sobre el orificio de la muela.
      NOTA: Asegúrate de que el bisel de la aguja esté orientado hacia la izquierda para mejorar la reproducibilidad durante la inyección.
   4. Introduce la aguja verticalmente en el tejido cerebral hasta una profundidad de 3,5 mm. Una vez alcanzada esta profundidad, retira lentamente la aguja 0,5 mm para ayudar a evitar el reflujo de la suspensión celular durante y después de la inyección.
   5. Inyecta lentamente los 3 μL de suspensión de células tumorales durante un periodo de 1 minuto. Después de administrar todo el volumen, mantén la aguja en su sitio durante 2 minutos adicionales para que las células y la ECM se asienten y minimiza el riesgo de reflujo.
   6. Retira cuidadosamente la jeringuilla y saca el ratón del marco estereotáctico.
5. Suturas y recuperación tras la anestesia
   1. Enjuaga suavemente el cráneo con una solución estéril de NaCl al 0,9%.
   2. Seca y sella el orificio de la rebala con cera ósea.
   3. Cierra la incisión del cuero cabelludo usando 3 o 4 suturas, asegurándote de que cada sutura esté atada con tres nudos apretados cerca de los bordes de la herida para una cicatrización adecuada.
   4. Marca las orejas del ratón con un patrón de perforador adecuado correspondiente al número de identificación designado.
   5. Reaplica la pomada para los ojos si es necesario para evitar el sequeo corneal durante la recuperación. Inmediatamente después, devuelve al ratón a una almohadilla térmica precalentada (mantenida a 37-38 °C) para apoyar la termorregulación y facilitar una recuperación suave de la anestesia.
      NOTA: Se recomienda alojar los ratones individualmente durante la recuperación para evitar lesiones por interacciones entre animales despiertos y en recuperación.
   6. Limpia y desinfecta a fondo la jeringuilla Hamilton enjuagando la aguja y el barril tres veces consecutivamente: primero con agua destilada, luego con etanol al 70% y finalmente con una solución estéril de NaCl al 0,9%.
   7. Después de limpiar, guarda la jeringuilla Hamilton en hielo hasta su próximo uso.

3. Procedimientos postoperatorios

1. Analgesia postoperatoria
   1. Administrar analgésicos por vía subcutánea mientras el ratón aún está bajo anestesia para asegurar un alivio inmediato del dolor postoperatorio.
      NOTA: Utiliza analgésicos adecuados para este tipo de procedimiento. Por ejemplo, Carprofeno a 10 mg/kg de peso corporal.
   2. Una vez que el ratón esté completamente despierto y haya recuperado su función motora normal, transfiere a una jaula limpia con cama fresca. Monitoriza brevemente al animal para detectar comportamientos normales y patrones respiratorios.
   3. Tras la recuperación completa, administra analgesia con agua potable (por ejemplo, metamizol a 200 mg/kg de peso corporal) durante al menos 24 horas tras la cirugía.
      NOTA: Para fomentar la ingesta de agua, endulza el agua con un 0,5% de sacarosa. Envuelve las botellas en papel de aluminio para proteger la solución de la luz y cámbialas a diario. Etiqueta cada botella para controlar la ingesta de analgésicos. Si no se consumen analgésicos por agua potable o si se observan signos de dolor, administra Carprofeno (10 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea cada 12 horas hasta la recuperación completa.
2. Monitorización de ratones
   1. Vigila de cerca todos los ratones cada 24 horas durante las primeras 48 horas tras la cirugía, evaluando la función motora y el comportamiento. Desde el día 3, monitorea a los ratones al menos cada 3 días, incluyendo las medidas de peso corporal.
   2. Si se observan signos de malestar o comportamiento anormal (por ejemplo, actividad motora alterada, comportamiento inusual), realice la prueba del alambre colgante, como se ha descrito anteriormente. Si el ratón pasa la prueba, sigue monitorizando y repite la prueba día sí, día no.
   3. Eutanasiar a los ratones inmediatamente (véase la Sección 3.4) al alcanzar uno de los criterios humanos predefinidos: pérdida de peso > 20% respecto al peso corporal inicial (día 0), incumplimiento de la prueba de alambre colgante o malestar moderado sostenido de hasta 48 horas.
3. Tratamiento terapéutico (opcional)
   1. Tras la recuperación postoperatoria completa, puede iniciarse un régimen terapéutico dependiendo del diseño experimental. Si este es el caso, define claramente el momento de inicio del tratamiento en el protocolo del estudio y adapta el plan de seguimiento para reflejar los efectos esperados y los posibles efectos secundarios de la intervención terapéutica.
      NOTA: El tratamiento no debe comenzar hasta que los animales muestren un comportamiento normal, peso estable y no haya signos de malestar postoperatorio.
4. Eutanasia y recogida de tejidos
   NOTA: Los ratones deben ser eutanasiados inmediatamente al cumplir los objetivos humanos predefinidos o en los momentos experimentales designados, según lo requieran los objetivos específicos de la investigación.
   1. Anestesiar al ratón usando un método adecuado (véase el paso 2.1.2).
   2. Abrir la cavidad torácica y realizar perfusión transcárdica con 10-20 mL de NaCl estéril al 0,9% helado, seguido de 10-20 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% helado.
      NOTA: Si se requiere tejido fresco para aplicaciones posteriores (por ejemplo, aislamiento de ARN o FACS), omite el paso de perfusión de PFA.
   3. Recoge el cerebro y otros órganos de interés.
      NOTA: Los órganos pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido, fijarse en formalina para el procesamiento del FFPE o usarse directamente para análisis posteriores.
5. Análisis postmortem estructurado
   NOTA: Para confirmar el crecimiento metastásico y caracterizar las características histopatológicas asociadas, se debe realizar un análisis postmortem del tejido cerebral utilizando muestras nativas (frescas congeladas) y fijas (FFPE).
   1. Disección tisular
      1. Diseccionar el cerebro a nivel del lugar de inyección, como se indica en el esquema proporcionado en la Figura 1C.
      2. Conserva la porción anterior para el procesamiento fresco congelado (FF). Divide esta porción en hemisferios inyectados (i.) y no inyectados (n.i.).
      3. Conservar la parte central para la fijación de formol y la incrustación de parafina (FFPE).
      4. Descarta la parte posterior, incluyendo el cerebelo y el tronco encefálico.
   2. Procesamiento de muestras
      1. Congela la porción anterior en nitrógeno líquido y almacena muestras de FF a -80 °C hasta su uso adicional.
      2. Fija la parte central en 5-7 mL de PFA al 4% a temperatura ambiente durante 48 horas antes del procesamiento del FFPE.
         NOTA: La fijación de PFA debe realizarse en una campana extractora química usando el EPI adecuado para evitar la exposición a gases tóxicos.
   3. Cuantificación de la carga metastásica (muestras FF)
      1. Aislar el ARN total utilizando un kit de extracción o protocolo adecuado optimizado para tejido cerebral.
         NOTA: El aislamiento de ARN debe realizarse en un gabinete de seguridad biológica utilizando el EPP adecuado para evitar la contaminación y la exposición a reactivos peligrosos.
      2. Realiza PCR cuantitativa (qPCR) utilizando un marcador específico de células tumorales, como Ck8.
         NOTA: Se pueden evaluar objetivos adicionales (por ejemplo, marcadores inmunitarios o de células estromales) seleccionando marcadores génicos apropiados. La secuenciación de ARN (RNA-seq) puede utilizarse como alternativa para el análisis a nivel de transcriptoma.
      3. Calcula la carga tumoral relativa normalizando el gen de interés (GOI, por ejemplo, Ck8) a un gen de mantenimiento (HK).
   4. Análisis histológico (muestras FFPE)
      1. Incrustar tejido fijado con formalina en parafina.
      2. Seccionar muestras en rodajas de 3 μm de grosor usando un microtomo.
         NOTA: El uso de microtomos debe ser realizado por personal capacitado con EPI adecuado, utilizando el protector de cuchilla cuando no se corta y desechando las hojas en recipientes para afilados para garantizar su seguridad.
      3. Realizar la tinción estándar de hematoxilina y eosina (H&E) e inmunohistoquímica (IHC) utilizando anticuerpos relevantes, como Ck8 (células tumorales), Cd3 (células T), Iba1 (microglías/macrófagos) y Gfap (astrocitos).
         NOTA: Los procedimientos de H&E e IHC deben realizarse en un área bien ventilada o en una campana extractora para garantizar la seguridad y prevenir la exposición a productos químicos.
      4. Escanea digitalmente todas las láminas teñidas usando un escáner de diapositivas de alta resolución para construir una biblioteca digital de tejidos.
      5. Evalúa el patrón histológico de crecimiento (HGP) de la metástasis cerebral siguiendo el protocolo publicado^10,12.

Resultados

El protocolo de inyección estereotáctica (Figura 1) puede aplicarse tanto a modelos singénicos como a xenoinjertos murinos, incluyendo cepas salvajes o genéticamente modificadas, dependiendo de la cuestión científica. Se puede utilizar cualquier línea celular adecuada capaz de crecer en el cerebro. Ejemplos de líneas celulares de tumores murinos que pueden colonizar el cerebro incluyen, pero no se limitan a, las células tumorales de mama 4T1 y 410.4, las células de cáncer colorrectal CMT93 y la línea celular de melanoma B16-F10. El tiempo que requieren las células tumorales para establecer metástasis en el cerebro varía según la línea celular, desde unos pocos días hasta varias semanas, y la penetrancia también es variable. Recomendamos usar un modelo con ~70% de penetrancia, lo que significa que al menos 7 de cada 10 animales desarrollan metástasis en un periodo experimental máximo de 20 semanas (Figura 2A). Cada línea celular debe optimizarse individualmente y el número de células inyectadas cuidadosamente titulado.

Como ejemplo, comparamos dos modelos sinténicos de metástasis cerebral de cáncer de mama estrechamente relacionados: 410.4 y su derivado 4T1. A pesar de su similitud genética¹⁷, estas líneas celulares muestran comportamientos metastásicos y patrones de crecimiento en el cerebro marcadamente^diferentes. Aunque ambos alcanzan una carga metastásica similar (Figura 2B), cada uno presenta un curso temporal único (Figura 2C) y HGPs claramente distintos (Figura 2D). Para evaluar y comparar sistemáticamente la eficiencia de la colonización entre diferentes líneas celulares, desarrollamos el Índice de Colonización, una fórmula matemática que integra el número de células inyectadas, el tiempo medio de supervivencia y el éxito de la colonización (Figura 2E-G).

Al realizar la inyección estereotáctica por primera vez o probar una nueva línea celular, es esencial evaluar cuidadosamente los patrones de crecimiento y comparar los resultados entre animales, cirugías y experimentadores para garantizar su reproducibilidad. Un paso crítico es la inyección de células tumorales, durante la cual puede producirse una fuga de la suspensión celular. Esto puede resultar en una localización tumoral engañosa, especialmente la siembra iatrogénica de células tumorales en el cráneo y/o las meninges, lo que puede llevar a una metástasis meníngea falsamente positiva que no representa una verdadera colonización intracerebral con posterior diseminación meníngea secundaria. Estos escenarios se ilustran en la Figura 3.

Figura 1: Procedimientos previos, intra y postoperatorios para la inyección estereotáxica intracortical-celular de células tumorales en ratones. Resumen esquemático del procedimiento. (A) La fase preoperatoria incluye la aclimatación animal, la evaluación de salud, la preparación del sitio quirúrgico y la suspensión de células tumorales. (B) La fase intraoperatoria implica inducción de anestesia, incisión en el cuero cabelludo, colocación en el marco estereotáctico, craneotomía precisa, inyección de células tumorales en la corteza cerebral usando coordenadas estereotácticas, cierre de heridas y recuperación tras anestesia. (C) La fase postoperatoria comprende la administración de analgésicos, el seguimiento rutinario para evaluar la recuperación postquirúrgica, el estado general de salud y el desarrollo de síntomas neurológicos (prueba de alambre colgante), seguida de la eutanasia y la extracción de órganos. Se incluye un análisis postmortem estructurado para evaluar la carga metastásica en tejido fresco congelado (FF) mediante qPCR y para evaluar patrones histológicos de crecimiento en muestras de FFPE a partir de una biblioteca digital de portaobjetos. Las etapas clave del procedimiento se ilustran secuencialmente para enfatizar el tiempo y el flujo de trabajo quirúrgico. Imagen creada en BioRender. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Resultados representativos del crecimiento metastásico en modelos murinos de metástasis cerebral tras la inyección estereotáxica de células de cáncer de mama 4T1 y 410.4. (A) Imágenes macroscópicas que muestran la ausencia de crecimiento tumoral en ratones Balb/C control inyectados con ECM (Control) y la presencia de lesiones metastásicas visibles en ratones inyectados con suspensiones de células tumorales en ECM (Met). (B) Cuantificación de la carga metastásica en ratones control inyectados por ECM (CTRL) y ratones con metástasis cerebrales derivadas de células de cáncer de mama 4T1 y 410.4. La carga metastásica se evaluó mediante qPCR utilizando Ck8 como marcador tumoral, con Gapdh y Pgk1 como genes de mantenimiento (HK). Los datos se presentan como valores medios con puntos de datos individuales. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (n = 5; ****P < 0,0001). (C) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier comparando la supervivencia global (OS) de ratones inyectados estereotácticamente solo con ECM (control, negro), 4T1 (naranja) o 410,4 (azul) células tumorales. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) (4T1 vs 410,4; n = 10; ***P < 0,001). (D) Imágenes histológicas representativas de metástasis cerebrales derivadas de células 4T1 y 410.4, que ilustran diferencias en los patrones de crecimiento, incluyendo HGPs epiteliales infiltrativos de cohorte y de cadena similar, respectivamente. Las secciones tisulares se tiñeron con un anticuerpo anticitoqueratina 8. (E) Análisis comparativo de la eficiencia de la colonización utilizando el Índice de Colonización (IC). Se muestran los valores de IC 4T1 (naranja) y 410,4 (azul). (F) Fórmula utilizada para calcular el IC. (G) Tabla que resume los parámetros incluidos en el IC para ambos modelos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Ejemplos representativos de resultados exitosos y subóptimos de inyección estereotáxica. (A,C) Imágenes macroscópicas que muestran crecimiento metastásico en diferentes ubicaciones: (A) crecimiento tumoral en el cráneo y meninges resultantes de una inyección incorrecta y fuga de células tumorales, y (C) metástasis parénquimatosa exitosa tras una inyección intracortical adecuada. (B,D) Las secciones histológicas correspondientes confirman (B) crecimiento tumoral intrameníngeo con infiltración posterior en el parénquima cerebral, y (D) diseminación secundaria a las meninges desde una metástasis parénquimase establecida. Las secciones tisulares se tiñeron con un anticuerpo anticitoqueratina 8. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

La técnica de inyección intracraneal estereotáctica permite la entrega precisa y localizada de células tumorales o mezclas celulares directamente en la corteza cerebral de ratones experimentales. Cuando se combina con un análisis postmortem estructurado, este modelo es especialmente valioso para estudiar las etapas avanzadas de la metástasis cerebral, incluyendo el crecimiento metastásico, la diseminación intraorgánica secundaria y la posible causa de la muerte. En cambio, los métodos de inyección sistémica (por ejemplo, inyección en vena caudal o intracardíaca) son más adecuados para investigar los primeros pasos de la cascada metastásica, como la supervivencia de células tumorales en la circulación, extravasación y siembra en órganos distantes. Sin embargo, estos enfoques no son específicos del cerebro y suelen resultar en tasas bajas e inconsistentes de colonización^cerebral 18,19,20.

Los modelos sistémicos también muestran una alta variabilidad biológica, especialmente en cuanto a qué regiones cerebrales se ven afectadas, lo que dificulta los estudios terapéuticos y requiere grandes cohortes animales. Además, los animales suelen desarrollar metástasis extracraneales, lo que puede llevar a la suspensión temprana del^{ensayo 19}. Estas limitaciones reducen significativamente su utilidad para estudiar metástasis cerebrales en etapas avanzadas. Además, la diseminación secundaria y la recolonización son particularmente difíciles de investigar utilizando modelos sistémicos, ya que distinguir entre diseminación primaria (originada en el tumor primario) y secundaria (que surge de una metástasis ya establecida) es casi imposible. Además, un análisis postmortem estructurado, especialmente para evaluar el crecimiento macro-metastásico y los HGPs de las metástasis cerebrales, está limitado en estos contextos.

En comparación con sistemas ex vivo, como los organoides derivados del paciente (PDOs) y los organotípicos cortes cerebrales (co)cultivos 21,22,23,24, la inyección estereotáctica ofrece varias ventajas críticas. Aunque los modelos ex vivo preservan aspectos de la arquitectura cerebral nativa y pueden incluir células inmunitarias residentes e infiltradas de pacientes o donantes, carecen de vascularización, señalización sistémica y toda la complejidad del microambiente tumoral in vivo, especialmente la infiltración adicional de células T u otras células inmunitarias derivadas de la sangre o la médula^{ósea 23}. Estas limitaciones limitan su aplicación a estudios a corto plazo y entornos simplificados, como el cribado de drogas o ensayos básicos de interacción célula-cerebro metastásica. En cambio, el enfoque estereotáctico apoya estudios a largo plazo sobre la progresión tumoral, la respuesta inmune y la intervención terapéutica dentro de un organismo vivo e intacto. Es importante destacar que la evaluación de los síntomas neurológicos como un punto final humano permite una medida clínicamente relevante del inicio macrometastásico. Esto hace que el modelo refleje aún más el curso de la enfermedad humana, lo cual es especialmente valioso en la investigación traslacional. Aunque implica el uso de animales, planteando consideraciones éticas abordadas por la adhesión a las 3R (Reemplazo, Reducción y Refinamiento), este modelo actualmente no puede ser completamente reemplazado por alternativas ex vivo. Su capacidad para replicar el contexto fisiológico completo de la metástasis cerebral la hace indispensable para avanzar en nuestra comprensión de la dinámica metastásica y la fisiopatología específica del SNC.

A pesar de sus numerosas ventajas, el modelo de inyección estereotáctica presenta algunas limitaciones que deben considerarse. Una preocupación clave es la posible fuga de la suspensión de células tumorales durante la inyección, lo que puede provocar patrones de crecimiento engañosos. En particular, la adhesión no intencionada de las células tumorales a las meninges puede conducir a una metástasis^{meníngea iatrogénica 8}, que no refleja con precisión el curso natural de la diseminación metastásica en esta línea celular en particular. Para garantizar la fiabilidad de los datos, los patrones de crecimiento de una línea celular tumoral determinada deben compararse de forma consistente entre animales, procedimientos quirúrgicos y experimentadores. Para minimizar la fuga de células tumorales, proponemos utilizar matriz extracelular (ECM), ya que su consistencia gelatinosa y su capacidad para solidificarse a temperatura corporal la convierten en una herramienta útil. Sin embargo, la ECM también presenta desafíos, incluyendo la necesidad de un manejo rápido durante la inyección para evitar una solidificación prematura. Otra consideración en nuestro protocolo es que las células tumorales se inyectan en una mezcla de ECM y medios que contienen suero. Aunque la FBS potencia el enjerto de las células tumorales al suministrar nutrientes que normalmente están limitados en el cerebro, también puede favorecer la inflamación. Si esto es una preocupación, se pueden utilizar medios sin suero o soluciones salinas balanceadas (por ejemplo, HBSS o PBS) como alternativas.

Además, la inyección estereotáctica es técnicamente más exigente que otros métodos, como la inyección intravenosa (vía intravenosa). Requiere formación específica para garantizar la reproducibilidad, y el procedimiento es significativamente más lento, con una duración típica de 15-30 minutos por animal frente a las 3-5 minutos de las inyecciones intravenosas. Esta mayor duración limita el número de animales que pueden ser procesados por sesión, lo que puede suponer un reto para estudios terapéuticos que requieren grandes cohortes para alcanzar poder estadístico. Sin embargo, esta limitación puede abordarse eficazmente distribuyendo las inyecciones durante varios días, lo que no solo aumenta la flexibilidad experimental y la viabilidad, sino que también introduce una valiosa variabilidad biológica, reflejando diferencias más realistas entre individuos tanto en el comportamiento de las células tumorales como en la respuesta del huésped.

Finalmente, es importante señalar que este modelo omite etapas anteriores de la cascada metastásica, como se ha discutido anteriormente. El modelo experimental adecuado debe seleccionarse en función de la pregunta de investigación y la fase específica de la metástasis que se estudia. Para investigar la colonización cerebral en etapas avanzadas, la inyección intracortical estereotáctica sigue siendo el estándar de oro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alicates de punzón orejas de animales	LabArt
Bepanthen® Pomada para ojos y nariz	Bayer Vital GmbH	1578675
Cera ósea	B.Braun	210434
Hisopos de algodón	Hartmann	143213
Extracto de membrana basal de Cultrex (ECM)	B& D	3432-005-01
Desinfectante	B.Braun	107190
Broca	Bilaney Consultants GmbH	D #76
Tijeras para ojos	Hermle	501
Jeringuilla Hamilton (10µ Volumen L)	VWR	5491135
Almohadilla térmica y	Intergastro	258122
Ensayo de Nase/Barra de Dientes para ratón (900/1430)	Bilaney Consultants GmbH	DKI 926-B
Tijeras de ojo Noyes	Hermle	545
Paur 60 y grados; Consejo non noptore Mouse Ear Bars	Bilaney Consultants GmbH	DKI 922
Bisturí	PFM Medicina AG	17027
Pinzas estándar de Semkin	Hermle	710
Sutura de poliamida Seralon (DR-009, USP 7/0, EP 0.5)	Serag-Wiessner GmbH	V0053491
Taladro Estereotaxico -Jacobs Chuck-18000 rpm	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1471-200-CE-A
Estereotaxia sin adaptador Rat	Bilaney Consultants GmbH	DKI 963 % 920
Corredor de jeringuilla para 5 y 10µ I Hamilton	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1772-F1
Portaagujas TC Mayo-Heear 160mm	Hermle	6425