Un aislamiento secuencial optimizado de criptas y células estromales mesenquimalesas a partir de tejido intestinal porcino

Summary

Este estudio proporciona un protocolo paso a paso para el aislamiento secuencial de criptas intestinales y células estromales mesenquimales intestinales (iMSCs) a partir de tejido jeyual porcina. El método genera monocapas enteroides 2D y iMSCs adecuados para desarrollar modelos de cocultivo epitelial-estromal reproducibles y fisiológicamente relevantes, con el fin de investigar la diafonía celular durante la homeostasis y regeneración intestinal.

Abstract

El epitelio intestinal interactúa estrechamente con las células estromales mesenquimales intestinales subyacentes (iMSCs) para regular el desarrollo, la homeostasis y la regeneración. Sin embargo, los métodos estandarizados para aislar secuencialmente tanto fracciones epiteliales como estromales del tejido porcino son limitados. Este protocolo describe un proceso optimizado por etapas para aislar criptas e iMSCs del mismo segmento jejunal de lechones. El método utiliza un tampón de disociación basado en ácido etilendidiaminetetraacético/ditiotreitol (EDTA/DTT) para liberar criptas, seguido de la digestión con colagênas/dispasa de la matriz extracelular para aislar los iMSC. Este enfoque minimiza las variaciones espaciales en las células aisladas. Las criptas aisladas se cultivaron con éxito y formaron monocapas enteroides bidimensionales (2D) en expansión típicas sobre placas recubiertas de hidrogel de colágeno. Los iMSC cultivados se adhierieron a frascos de cultivo y expresaron marcadores estromales como el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα) y el grupo de diferenciación 81 (CD81), determinados por inmunotinción. En conjunto, este protocolo de aislamiento optimizado produce tanto células epiteliales como estromales del mismo segmento jejunal de lechón, proporcionando una base reproducible para futuras investigaciones que involucren organoides intestinales y sistemas de co-cultivo de iMSC para dilucidar mecanismos que controlan las interacciones epitelial-estromales en cerdos, un modelo traduccionalmente relevante para replicar la fisiología humana y avanzar en las ciencias animales.

Introduction

El epitelio intestinal es un tejido dinámico que experimenta una renovación y diferenciación continuas para mantener la homeostasis intestinal y facilitar la regeneración tras lesiones mucosas ^1,2. Las células epiteliales intestinales se originan a partir de células madre intestinales (ISCs), e interactúan con diversos factores^{microambientales} 3,4,5,6,7,8. Los compartimentos subepiteliales, principalmente la lámina propia y la mucosa muscular, consisten en diversas poblaciones celulares de diferentes^{linajes 9}. Entre estas poblaciones celulares, las células estromales mesenquimales intestinales (iMSCs), incluidos fibroblastos y miofibroblastos, producen factores tróficos y de crecimiento que modulan el tallo, proliferación y diferenciación de los ISC para regular la homeostasis epitelial^{y la} regeneración 6,7,10,11.

Para estudiar estas interacciones celulares, estudios recientes han desarrollado enfoques novedosos para desentrañar posibles mecanismos de acción que impulsan la diafonía entre células epiteliales intestinales y iMSC. Los sistemas de cocultivo que combinan organoides con células estromales o inmunitarias han avanzado nuestra comprensión de las interacciones celulares epiteliales-subepiteliales durante el desarrollo, la regeneración, el cribado de fármacos y la modelización de^enfermedades 12,13,14,15,16,17. Sin embargo, la mayoría de los estudios de cocultivo de organoides han utilizado tejidos murinos, que a menudo no logran imitar eficazmente la fisiología humana y los fenotipos de enfermedades, limitando su relevancia traslacional^{clínica 18}.

En la mayoría de los protocolos de aislamiento intestinal murino, las células epiteliales y estromales se obtienen de segmentos de tejido separados, lo que puede proporcionar muestras que reflejan características ligeramente diferentes, lo que podría afectar la reproducibilidad en los^{experimentos 19,20}. Actualmente, no existen protocolos estandarizados y optimizados para aislar criptas intestinales porcinas y iMSCs a partir de la misma muestra de tejido. Además, las limitaciones prácticas para obtener muestras intestinales humanas adecuadas han llevado a muchos investigadores a confiar en tipos celulares desajustados de diferentes órganos (como enteroides humanos con fibroblastos cutáneos) para evaluar la diafonía celular epitelial-mesenquimal, lo que puede confundir la interpretación de datos 21,22,23.

Aunque un protocolo de biopsia intestinal humana publicado recientemente aisló criptas y se obtuvieron fibroblastos por crecimiento a partir del tejido residual empobrecido en epitelio, faltan enfoques estandarizados comparables en^{cerdos 24}. Los cerdos se utilizan como modelo animal adecuado para la investigación traslacional debido a su semejanza anatómica y fisiológica con los^humanos 2,18,25,26,27,28,29. Por lo tanto, este método presenta un protocolo de aislamiento secuencial que recupera criptas intestinales e iMSCs del mismo segmento jejunal porcino basándose en la estructura fisiológica, anatómica y morfológica del^{intestino 4,30}. El procedimiento proporciona un marco reproducible para aislar tanto criptas como iMSCs, adecuado para futuros estudios de co-cultivo intestinal porcina.

Protocol

Se disecó un segmento de 5 cm del yeyuno proximal extirpado de lechones de 21 días alojados en la instalación porcina de la Universidad de Maryland, College Park. El procedimiento (R-JUN-22-30) utilizado para sacrificar al lechón siguió las directrices de las políticas de cuidado y uso animal aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la universidad. Antes de proceder con los pasos de aislamiento, el esquema del protocolo se presenta en la Figura 1, y la lista de reactivos y equipos utilizados para el aislamiento secuencial de las criptas intestinales porcinas y los iMSCs se proporciona en la Tabla de Materiales.

1. Etapa de preparación previa al aislamiento

1. Prepare 30 mL de tampón de lavado por segmento de tejido de 5 cm en tubos cónicos de 50 mL.
2. Ajusta el volumen en función del número de muestras de tejido recogidas.
   NOTA: Consulta la Tabla 1 para la composición del buffer de lavado. Todos los pasos de preparación tisular y aislamiento celular se realizan sobre un banco.

2. Etapa de preparación del tejido intestinal

1. Colocar el tejido intestinal extirpado en los 30 mL de tampón de lavado en tubos cónicos de 50 mL.
   NOTA: Los pañuelos extirpados pueden colocarse en un buffer de lavado en frío durante una hora antes de su uso.
2. Enjuaga el pañuelo 3× con un tampón de lavado frío usando una jeringuilla de 21 g para eliminar el contenido luminal.
3. Coloque el tejido sobre una superficie esterilizada de espuma de poliestireno y retire cuidadosamente el tejido mesentérico y adiposo de la serosa.
4. Disecciona el tejido longitudinalmente usando una cuchilla quirúrgica para abrir la luz (Figura 2A).
5. Transfiere el tejido parcialmente limpiado y disecado a un tampón de lavado fresco y lávate dos veces, o hasta que el tampón se despeje.
6. Coloca el papel en el tampón de lavado en una placa de Petri de 100 mm y córtalo en trozos de 10-15 mm usando una hoja quirúrgica nueva (Figuras 2B, C). Este paso aumenta la superficie expuesta al buffer de digestión.
7. Transfiere el tejido picado a un nuevo tubo cónico de 50 mL.
8. Lava suavemente con un tampón de lavado y deja que el tejido picado se asiente por gravedad durante aproximadamente 30 segundos (Figura 2D).
9. Aspira suavemente el sobrenadante, dejando solo el tampón suficiente para cubrir los fragmentos de tejido en el tubo cónico.
10. Etapa de disociación epitelial
    1. Añade 30 mL de tampón de disociación epitelial precalentado (Tabla 2) e incuba durante 20-30 minutos a 37 °C en un baño de perlas estáticas o en un baño de agua agitante a aproximadamente 9 × g.
    2. Sacude suavemente el tubo cada 15 minutos para aumentar la liberación de las criptas desde la membrana epitelial.
    3. Deja que el tejido se asiente y aspira suavemente el sobrenadante con una pipeta serológica, dejando solo el tampón suficiente para cubrir el tejido asentado en el tubo cónico.
    4. Añade 30 mL de tampón de lavado fresco al tejido sedimentado y agita vigorosamente para liberar las vellosidades, criptas y restos (Figura 3A). Deja que los restos de tejido se asienten y luego decanta suavemente el sobrenadante del tampón de lavado, que contiene los segmentos de cripta suspendidos, a través de un colador celular de 100 μm en un nuevo tubo cónico de 50 mL.
       1. Repite el proceso de añadir un tampón de lavado fresco al tejido restante y decantar tres veces (3×). Pipete 10 μL de tampón de lavado que contiene las criptas en una placa de Petri de 100 mm y examina la densidad de la cripta bajo un microscopio estereoscópico.
          NOTA: Mantén cada buffer de lavado conteniendo criptas después de cada lavado.
    5. Tras el tercer lavado, el tampón de lavado que contiene las criptas debería quedar limpio con un mínimo de residuos (Figura 3B).
       NOTA: Conserva los restos de tejido con la matriz extracelular (ECM) en el tubo cónico para el posterior procesamiento de aislamiento de iMSC.
    6. Centrifuga la suspensión de la cripta a 150 × g durante 2 minutos a temperatura ambiente para pelletar los fragmentos de la cripta.
    7. Aspira y vuelve a suspender el pellet de cripta en un medio de cultivo epitelial.
    8. Centrifugar las criptas resuspendidas de nuevo a 150 × g durante 2 minutos para recoger el fragmento de la cripta.
    9. Añadir medio de cultivo epitelial para resuspender las criptas y hacer una pipeta 5× usando una punta de pipeta de 1.000 μL.
    10. Siembra aproximadamente 100 criptas resuspendidas sobre placas prepreparadas de colágeno tipo 1 recubiertas con hidrogel de 6 pozos para cultivar y expandir las criptas en monocapas enteroides bidimensionales (2D).
        NOTA: Revisa la preparación en placa recubierta de colágeno en la Tabla 3. La concentración final de colágeno tipo 1 debe ser de 1,0 mg/mL. Evita blindar criptas excesivamente densas o fragmentos de escombros para evitar la contaminación por levaduras o hongos. El antibiótico-antimicótico (anti-anti-anti) en el tampón de lavado y el medio de cultivo debe proporcionar protección.
    11. Examinar las células bajo un microscopio de contraste de fase invertido antes de incubarlas a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO₂ .
    12. Sustituye el medio de cultivo en un plazo de 12 horas tras la siembra para eliminar los restos flotantes y reducir la contaminación bacteriana.
    13. Cultivar los enteroides usando un medio de cultivo epitelial (Tabla 4) y reemplazar el medio día sí y día no hasta alrededor del día 8, cuando las monocapas 2D expandidas alcanzan el ≥85 % de confluencia para la subcultura.
11. Etapa de disociación de la matriz extracelular
    NOTA: Continúa el proceso de aislamiento con los fragmentos de tejido restantes que contienen la matriz extracelular en el tubo cónico (Figura 3C y Figura 4A).
    NOTA: Aunque el EDTA en el tampón de disociación epitelial puede inhibir la actividad de la colagénasa, los tres pasos de lavado anteriores eliminan todo el EDTA y la DTT. Por tanto, la actividad de la colagenasa no debería verse afectada en el proceso posterior.
    1. Picar el tejido restante en trozos pequeños antes de proceder a aislar las iMSCs en la lámina propia.
    2. Añadir 25 mL de buffer de digestión extracelular (Tabla 5) al tejido e incubar en un baño de perlas estáticas durante 15-20 minutos a 37 °C (Figura 4B).
    3. Sacude vigorosamente tras la incubación.
       NOTA: El sobrenadante se vuelve turbio con menos fragmentos de tejido flotantes. Pipetear 10 μL del sobrenadante bajo un microscopio invertido para examinar la densidad de los iMSCs en el sobrenadante. Continúa incubando el tejido en el baño de perlas durante 15 minutos adicionales si la densidad observada de iMSC es baja.
    4. Decantar suavemente el sobrenadante (inmediatamente después de agitar vigorosamente en el paso 2.2.3) a través de un colador de células de 100 μm hacia un nuevo tubo cónico para minimizar los residuos.
    5. Centrifuga la suspensión de la celda a 280 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente para pelletar los iMSC.
    6. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender los iMSCs en un medio de cultivo mesenquimaloso (véase el medio de cultivo iMSC en la Tabla 6).
    7. Centrifuga de nuevo los iMSCs resuspendidos a 280 × g durante 5 minutos para lavar el buffer de disociación.
    8. Aspirar y volver a suspender los iMSCs en un medio de cultivo mesenquimal.
    9. Emplatar los iMSCs en un matraz de cultivo T75 aproximadamente a 5 × 10⁵ celdas por matraz.
       NOTA: Asegúrese de que las células revestidas cubran aproximadamente el 60% de la superficie del matraz, ya que las células mesenquimales requieren una densidad de siembra moderada a alta para un crecimiento óptimo.
    10. Sustituye el medio de cultivo en un plazo de 12 horas tras el emplacado para eliminar el exceso de residuos y evitar la contaminación bacteriana.
    11. Examina células similares a fibroblastos bajo un microscopio de contraste de fase invertido en el segundo día tras la siembra.
        NOTA: Cambia el medio de cultivo mesenquimalo día sí, día no. Los iMSC deberían alcanzar aproximadamente el 85 % de confluencia y estar listos para la subcultura al día 4.

3. Ensayo inmunocitoquímico

1. Cultivar aproximadamente 5.000 iMSC por pozo en una placa de 96 pozos con medio de cultivo mesenquimaloso durante 2-3 días hasta que las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia.
2. Aspira suavemente el medio y enjuaga los iMSCs cultivados dos veces con 100 μL de 1× PBS/pozo a temperatura^{ambiente 31}. Todas las referencias a los kits de inmunotinción se proporcionan en la Tabla de Materiales.
3. Añadir 100 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% por pozo para fijar los iMSCs cultivados e incubar en una mesa estática a temperatura ambiente durante 30 minutos.
4. Lava dos veces los iMSC fijos cultivados con 100 μL de 0,1% Tween-20/PBS (PBST) durante 5 minutos cada uno, y luego permeabiliza con 100 μL de 0,5% Triton X-100/PBS durante 30 minutos.
5. Añadir 100 μL de albúmina sérica bovina (BSA)/PBST al 5% por pozo para bloquear la unión inespecífica en las células fijas.
   NOTA: Deje a temperatura ambiente durante 1 hora antes de lavar dos veces con 100 μL de PBST durante 5 minutos cada uno.
6. Añadir 100 μL de anticuerpos primarios diluidos (1:250; es decir, 1 μL de anticuerpo primario en 250 μL de diluyente de anticuerpos) a cada pozo e incubar las células durante la noche a 4 °C. Los anticuerpos principales utilizados son PDGFRα y CD81.
   NOTA: Incluye pozos de control negativos añadiendo solo diluyente de anticuerpos sin anticuerpos primarios.
7. El segundo día, lava dos veces los anticuerpos primarios con 100 μL de PBST durante 5 minutos cada uno.
8. Diluir los anticuerpos secundarios en 1× PBS utilizando las siguientes proporciones: Alexa Fluor Plus 555 (1 μL:100 μL), Alexa Fluor Plus 647 (1 μL:100 μL) y DAPI (1 μL:800 μL).
9. Contrateñe las células con los anticuerpos secundarios diluidos a temperatura ambiente durante 1 hora.
10. Lava las células dos veces con 1× PBS durante 5 minutos cada una.
11. Añade 100 μL de medio de montaje por pozo, cubre la placa, envuélvela con papel de aluminio y guarda a 4 °C hasta 6 meses hasta la imagen fluorescente.

4. Aislamiento de ARN y ensayo qPCR

1. Extraer ARNm total de iMSCs cultivados en matrazas T75 utilizando la técnica de separación de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo.
   NOTA: Determinar la concentración y pureza del ARN usando un espectrofotómetro.
2. Transcribir inversamente el ARNm total en ADNc para usarlo como plantilla para el ensayo cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (qRT-PCR) para verificar las gráficas de amplificación para el cebador seleccionado del gen Sus scrofa, GAPDH (directo: ATCCTGGGCTACACTGAGGAC; reverse: AAGTGTCGTTGAGGGCAATG), según se informó en estudios^{previos 2,28}.

Results

Durante la disociación epitelial, el ácido etilendediaminetetraacético (EDTA) quela los iones calcio para interrumpir las adherencias célula-célula dependientes del calcio, mientras que el ditiotreitol (DTT) corta enlaces disulfuro en las glicoproteínas mucinas para facilitar la mucolis. Así, el uso combinado de un compuesto quelante (EDTA) y un agente reductor (DTT) permite la liberación efectiva de criptas desde la membrana epitelial sin alterar la estructura de la matriz extracelular (ECM⁾

Discussion

Aislar criptas intestinales e iMSCs del mismo segmento jejunal porcino ofrece un enfoque novedoso para preservar las características celulares y funcionales específicas de cada segmento tisular. Esto es crucial porque los tejidos intestinales presentan identidades regionales y espaciales, como se demostró en estudios porcinos^previos 2,36,37,38. Estudios previos...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5M EDTA	Promega	PR-V4231
Buffer 1 M HEPES	ThermoFisher	15630080	Para la preparación de placas de hidrogel de colágeno
Puntas de pipeta de 1000 uL	Alkali Scientific FT1000	104027-530
10 veces PBS	Invitrogen	AM9624	Para la preparación de placas de hidrogel de colágeno
1N hidróxido de sodio	Termodinámica	SS266-1	Para la preparación de placas de hidrogel de colágeno
1x HBSS	ThermoFisher	14025092
1X PBS	Hyclone	SH30256FS
4 % de paraformaldehído (PFA)	ThermoFisher	AAJ61899AK
Tubos cónicos de 50 mL	ThermoFisher	12-565-271
Placas de 6 pozos	Fisherbrand	FB012927
Solución de bicarbonato sódico al 7,5%	Corning	MT25035CI	Para la preparación de placas de hidrogel de colágeno
Advance DMEM/F12	Gibco y nbsp;	12634-010
Alexa fluor plus 647	Invitrogen	A32728	Anticuerpo secundario
Alexa plus 555 - A32732	Invitrogen	A32732	Anticuerpo secundario
Papel de aluminio	Reynolds	https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
ANTI-ANTI	Gibco	15240096
B27	ThermoFisher	12587010
BSA	Fisherbrand	BP1600-100
CD81	Proteinintech	66866-1-ig	Anticuerpo primario
Agua de calidad para cultivo celular	Hyclone	SH30529FS	Para la preparación de placas de hidrogel de colágeno
Colágeno, Tipo 1	Corning	356236	Para la preparación de placas de hidrogel de colágeno
Colagenasa IV	Gibco	17104019
Placa de Petri de Corning de 100 mm	Corning	07-202-011
Medios de criopreservación de células Cryostor	Tecnologías de células madre	7930
criovial para células y nbsp;	Fisherbrand	1050026
Diluyente de anticuerpos Dako	Dako/Agilent	Número de pieza: S302283-2	Diluyente primario de anticuerpos
Soportes de montaje fluorescentes Dako	Dako/Agilent	Número de pieza: S302380-2
DAPI	Promocell/VWR	10180-470	Tinción por ADN
Dispasa II	Roche	4942078001
DMEM, glucosa alta	Corning	MT10013CV
DTT	Sigma	646563
EGF	Peprotech	315-09
FBS (HI)	Avantor	1300-500H
Gastrin	Anaspec	AS-64149
Gentamicina	MP Biomedicina	ICN1676045
GlutaMax	ThermoFisher	35050061
HEPES	ThermoFisher	15630-080
Microscrrope fluorescente invertido	Nikon	ECLIPSE Ti2	Imagen fluorescente
Microscopio de contraste de fase invertido	Nikon	Eclipse TS100	Para imágenes de células cultivadas
Kit avanzado de síntesis de ADNcDNA iScript	Bio-Rad	1725038	Kit RT-PCR
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725122	Kit qPCR
Medios condicionales LWRN	ATCC	CRL-3276	Los medios de LWRN se prepararon internamente según el procedimiento del ATCC
N-acetil cisteína	Biografía de MP	194603
Espectrofotómetro Nanodrop 2000	ThermoFisher	ND 2000
Nicotinamida	Sigma	N0636-100G
Placas ópticas de 384 pozos con código de barras	Biosistemas Aplicados	4483285	Kit qPCR
PDGFRα	Abcam	ab230457	Anticuerpo primario
Prostaglandina E2 (PGE2)	Química de las Islas Caimán & nbsp;	14010
QuantStudio 5	Biosistema Aplicado	A28570	Instrumento qPCR
SB202190	Laboratorios LC	S-1700
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ745
Matraz T 75	Fisherbrand	FB012937
Triton X100	Fisherbrand	PI85111
Reactivo Trizol	Invitrogen	15596026
Preadolescente de 20 años, detergente 100% no iónico	Bio-rad	1706531
Y27632	ApexBio	A3008-200