Artículo de método

Un enfoque comparativo para estudios cuantitativos de recuento celular en cerebros de mamíferos muy diferentes

DOI:

10.3791/69446

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16 de enero de 2026

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1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, 2Department of Veterinary Sciences, University of Turin, 3Department of Anthropology and Center for the Advanced Study of Human Paleobiology, The George Washington University

En este artículo

Resumen

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Las neurociencias modernas necesitan explorar las diferencias entre muchas especies, incluidos los roedores de laboratorio y los humanos. Sin embargo, surgen dificultades técnicas cuando se trata de mamíferos de cerebro grande. Este enfoque aborda la variación interespecie de poblaciones neuronales en mamíferos muy diferentes, produciendo resultados comparables que se pueden mapear para revelar patrones evolutivos.

Resumen

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La mayoría de los estudios neurobiológicos se realizan en roedores de laboratorio. A pesar de las muchas similitudes entre cerebros de mamíferos, también existen diferencias importantes que pueden ser engañosas en la traducción. Se han encontrado diferencias notables entre especies en la plasticidad cerebral, especialmente en la neurogénesis. Diferentes procesos neurogénicos pueden prevalecer debido a compensaciones evolutivas, mostrando variaciones entre estructuras cerebrales y mamíferos y desplazando el potencial de plasticidad en especies divergentes, como ratones y humanos. Comparar especies tan diferentes plantea múltiples cuestiones: los estudios comparativos encuentran dificultades técnicas cuando se involucran cerebros de gran tamaño; El uso de enfoques experimentales heterogéneos por diferentes laboratorios puede limitar la comparación de resultados; La heterogeneidad puede estar relacionada con diferentes procesos temporales de neurodesarrollo entre mamíferos, añadiendo así variables a la comparación.

Para abordar estas limitaciones, se estableció un enfoque para estudiar la variación interespecie de una población de neuronas corticales inmaduras de capa II en mamíferos que difieren ampliamente en tamaño cerebral, girencefalia, nicho socioecológico y edad. A pesar de algunas variables que no pueden estandarizarse completamente, se propone un método que combine la reducción de la heterogeneidad en los cerebros recolectores y el establecimiento de estructuras anatómicas comunes como puntos de referencia para realizar el recuento celular en los niveles cerebrales correspondientes. Los datos obtenidos (por ejemplo, densidades celulares) pueden mapearse en árboles filogenéticos para revelar patrones evolutivos y analizarse en busca de covarianza con características neuroanatómicas (por ejemplo, tamaño cerebral, área superficial cortical). Este enfoque ha demostrado una notable variación en el número de neuronas corticales inmaduras entre grupos filogenéticos y ha descubierto la covariación con el tamaño cerebral. El método también puede utilizarse para cuantificar diferencias a través de distintas etapas de desarrollo en la misma especie y puede extenderse a otros mamíferos diversos y procesos biológicos para mapear resultados comparables que permitan una cuantificación más precisa de diferentes poblaciones celulares en cerebros adultos para apoyar la plasticidad.

Introducción

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La investigación en neurociencia utiliza principalmente ratones y ratas endogámicos para trasladar los resultados a los humanos. A pesar de las numerosas similitudes moleculares, celulares e incluso anatómicas, también existen importantes diferencias entre especies, que pueden ser engañosas para la interpretación de los datospreclínicos 1,2. Aunque se necesitan estudios comparativos, se ven obstaculizados por dificultades técnicas y prácticas cuando se involucran cerebros de gran tamaño (por ejemplo, desde una media de 0,5 g en ratones hasta 1300 g en humanos; Figura 1A). Además, los enfoques experimentales heterogéneos de diferentes laboratorios pueden limitar la comparación de resultados, especialmente los análisis cuantitativos, generando a veces controversias. Este es el caso de la plasticidad estructural cerebral, con especial referencia a los procesosneurogénicos 3,4,5, un tema de interés para comprender la neuroplasticidad del desarrollo y la reparacióncerebral 6,7.

Descubrimientos recientes en el campo de la plasticidad cerebral sugieren fuertemente que durante la evolución surgieron diferencias sustanciales en la ocurrencia, tasa y localización anatómica de diferentes tipos de procesosneurogénicos. Un ejemplo es la evidente disminución de la neurogénesis impulsada por células madre que ocurre en mamíferos adultos de cerebro grande en comparación con roedoresde laboratorio 5,9,10, probablemente vinculada a diferentes expansiones de regiones cerebrales y funciones como adaptación a presionesecológicas 7,8, así como a diferentes cursos temporales delneurodesarrollo 11,12. La tasa de neurogénesis parece diferir notablemente entre ratones y humanos, lo que plantea la cuestión de la traducción13.

Por otro lado, se ha hipotetizado un tipo novedoso de "neurogénesis sin división" representado por neuronas bloqueadas en la maduración detenida (las llamadas neuronas inmaduraso latentes 14,15,16,17,18,19) que aumentará de especies de cerebro pequeño a especies de cerebro grande 20,21. Curiosamente, la población de neuronas inmaduras independiente de células madre se aloja en la corteza cerebral (un sitio de cognición de alto orden en las especies girocefálicas22,23) y lejos de los sitios neurogénicos canónicos, que están mayormente vinculados a la olfacción y la navegación espacial, que mantienen gran importancia en las especies lisencefálicas 7,8. Estas diferencias entre estructuras cerebrales y especies de mamíferos van más allá del mero interés comparativo, ya que pueden ser relevantes en la traducción al desplazar el potencial de plasticidad en ratones y humanos. Por estas razones, es crucial evaluar de manera "comparable" hasta qué punto las diferencias representan una variación filogenética entre mamíferos muy distintos, con especial referencia a roedores y primates de laboratorio.

Se describe un enfoque recientemente establecido para estudiar la variación interespecie de una población de neuronas corticales inmaduras de capa II (cINs) en mamíferos que difieren ampliamente en tamaño cerebral, girencefalia y nichosocioecológico 22,24,25. Este método se basa en tres principios: i) considerar varias especies (diversas) de mamíferos para ser procesadas en paralelo usando los mismos procedimientos; ii) minimizar variables que no pueden estandarizarse completamente en cerebros muy diferentes (procedimiento de fijación, intervalo postmortem, edad) y abordar la especificidad de los anticuerpos para inmunocitoquímica utilizando características ampliamente compartidas de la población celular estudiada como controles positivos internos; y iii) establecer estructuras anatómicas correspondientes como puntos de referencia para realizar el recuento celular sobre los niveles cerebrales correspondientes de diferentes especies (Figura 1B y Figura 2). Los datos obtenidos (por ejemplo, densidades celulares) contando células identificadas con el marcador bien establecido doublecortin (DCX 15,17,26) pueden mapearse en árboles filogenéticos para revelar patrones evolutivos y analizarse en cuanto a covarianza con diferentes parámetros, como el tamaño cerebral, la girencefalia y la superficie cortical.

Figura 1
Figura 1: Procesamiento de cerebros de mamíferos muy diferentes para evaluar la distribución y cantidad de cINs en el manto cortical. (A) Los mamíferos pertenecientes a diferentes especies y órdenes se caracterizan por tamaños cerebrales muy distintos y grados de expansión girencefálica y cortical. Iconos cerebrales reproducidos con licencia BioRender. (B) Secciones coronales representativas teñidas de azul Toluidina cortadas en cerebros de tamaños muy diferentes y extensión del manto cortical. Se utilizan secciones en serie teñidas histológicamente (corte criostatario, coronal, de 40 μm de espesor) para identificar las principales estructuras neuroanatómicas en cada especie animal (véase la Figura 3); Fíjate en las notables diferencias en el tamaño del cerebro y el perímetro cortical. Los iconos animales del panel A han sido reproducidos con permiso de La Rosa et al.22. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Finalmente, dado que todos los procesos plásticos generalmente sufren una reducción progresiva con el aumento de la edad27,28, otro problema en la neuroplasticidad comparativa es evaluar los diferentes cursos temporales de dicha reducción, que pueden estar relacionados con distintos procesos temporales de los procesos neurodesarrollativos enmamíferos 12,29,30. De hecho, la existencia de especies de maduración rápida (ratones) frente a especies de maduración lenta (primates) es otra razón por la que el sistema modelo más común, el ratón de laboratorio, está limitado a la hora de resolver desafíos en las ciencias biomédicas. El método descrito aquí también puede ser útil para considerar poblaciones celulares en diferentes edades a lo largo de la vida de cada especie y luego comparar las tendencias resultantes entre especies. Se encontraron variaciones filogenéticas en la densidad de cIN, así como diferencias en su persistencia a lo largo de las edades, entre mamíferos de cerebro pequeño y cerebrogrande 22,28.

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Protocolo

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Todos los procedimientos animales cumplieron con las normativas nacionales e institucionales pertinentes. Los tejidos de ratón se obtuvieron del Instituto de Neurociencia Cavalieri Ottolenghi (NICO), Orbassano, Italia, bajo autorización del Ministerio de Salud italiano (RRID: MGI:3696370), cortesía de Serena Bovetti y Charles River Laboratories. Los tejidos desnudos de rata topo se recogieron en la Queen Mary University of London (Reino Unido) inmediatamente después de la eutanasia, según el Anexo 1 de la Ley de Procedimientos Científicos de Animales de 1986. Los experimentos con conejos siguieron la Directiva 86/609/UE del Consejo de las Comunidades Europeas y la legislación italiana (DL.vo 116/92), con la aprobación del Ministerio de Sanidad italiano (autorización 66/99-A). Los cerebros de oveja y caballo se obtuvieron post mortem de un matadero comercial bajo la Directiva 86/609/CEE y supervisión veterinaria continua. Los cerebros de perros fueron suministrados postmortem por MarshallBio Laboratories (Lyon, Francia) con las autorizaciones necesarias; Los cerebros de gatos se recogieron postmortem en la Universidad de Padova durante necropsias diagnósticas rutinarias con el consentimiento del dueño. Todos los procedimientos seguían la legislación de la UE e Italia. Las muestras de chimpancés se manejaron según los principios internacionales del Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias Médicas (CIOMS) y bajo el permiso A5761-01 de la Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH-OLAW) (para detalles sobre cada especie animal y experimento, véase la Tabla Suplementaria 1 y las Referencias 22,25).

1. Coleccionar cerebros

  1. Recoge cerebros directamente o de otras instituciones y bancos de tejidos, pero considera solo todo el hemisferio. Estableció con las instituciones el mejor procedimiento para extraer cerebros de la especie animal, con el objetivo de reducir el daño al hemisferio y asegurar el mínimo intervalo postmortem (PMI, véase NOTA más abajo) y una inmersión rápida en solución fijadora tras la extracción.
    NOTA: Dependiendo de la sensibilidad del anticuerpo de interés, ten en cuenta el PMI. Dada la alta sensibilidad de la doble cortina (DCX) a la degradación, se recogen muestras con un PMI de 0 a 1 h (excepto el chimpancé, que tiene hasta 14 h PMI, que sin embargo no alteró la calidad de la tinción, Tabla suplementaria 1).
  2. Dada la alta variabilidad de la esperanza de vida del animal, predetermina los grupos de edad que se recogerán entre los diferentes mamíferos considerados para el estudio, para obtener datos comparables.
    1. Para este diseño de estudio y para establecer grupos de edad comparables, analiza información de dos bases de datos sobre historia y diversidad animal: AnAge, una base de datos curada sobre envejecimiento y historia de vida en animales, y Animal Diversity Web, una base de datos en línea sobre historia natural animal, distribución, clasificación y biología de conservación.
    2. Dividir la esperanza de vida animal en cuatro etapas (una prepuberal y tres postpuberal, a saber, "adulto"), comenzando por la clasificación de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria (AVMA) para las etapas de vida enperros 31, en las que la esperanza de vida se dividió en seis etapas: cachorro, junior, adulto, maduro, senior y geriátrico.
    3. Compactando las etapas senior y geriátrica, y las etapas adulta y madura, aplica esta terminología: prepuberal, joven-adulto, mediana edad y senior/22 años.

2. Fijación y procesamiento del tejido cerebral

NOTA: Los procedimientos de fijación pueden ser diferentes dependiendo del tamaño cerebral y de las preocupaciones éticas respecto a algunas especies animales (la mayoría de los primates o caballos de cerebro grande no pueden ser perfundidos y deben fijarse mediante inmersión en la solución fijadora tras la extracción).

  1. Mantén el cerebro completamente sumergido en la solución fijadora (se recomienda 4% de paraformaldehído o 10% de formalina).
    NOTA: El tiempo de fijación varía según el tamaño del cerebro (por ejemplo, 3 semanas para el cerebro canino; 3 meses para el cerebro equino, Tabla Suplementaria 1). Evita pasar poco o demasiado tiempo en la solución fijativa para mantener la integridad del antígeno de interés.
  2. Corta el hemisferio cerebral preferido en rodajas iguales (1-1,5 cm de grosor) usando una regla (para realizar un corte recto) y un cuchillo de apuñalamiento.
  3. Sumergir las rebanadas cerebrales en un tampón de fosfato (PB) 0,1 M (28,49 g de fosfato de sodio dibásico y 7,8 g de fosfato de sodio monobásico disueltos en agua destilada, pH 7,4) y mantenlas bajo suave agitación en un agitador durante 24 horas. Si es necesario (véase NOTA más abajo), descarte la solución y reemplácela por una nueva de PB 0,1 M, pH 7,4 al día siguiente.
    NOTA: El volumen y número de lavados en PB 0,1 M varían según el tamaño del cerebro (por ejemplo, 30 min para el cerebro de ratón, 3 días para el cerebro de caballo). Asegúrate de que los cerebros estén completamente inmersos en PB 0,1 M y que ya no estén presentes los residuos de formol, sangre y tejido para detener el lavado.
  4. Crioprotege las rodajas sumergiéndolas en soluciones de sacarosa con concentración que aumenta gradualmente (10%, 20%, hasta 30%) en PB 0,1 M, pH 7,4, y mantenlas bajo una suave agitación en un agitador.
    NOTA: El volumen de soluciones de sacarosa varía según el tamaño del cerebro. Asegúrate de que los cerebros estén completamente inmersos en soluciones de sacarosa y que se hundan por completo antes de moverlos a una concentración aumentada de sacarosa.

3. Corte de criostato en hemisferio completo

  1. Elimina las meninges de las rodajas del cerebro usando pinzas curvas para evitar problemas durante el corte.
  2. Coloca las rebanadas en moldes de incrustación llenos de compuesto de temperatura óptima de corte (OCT). Si la rebanada no llena el molde de incrustación, corta un trozo cuadrado de Parafilm ligeramente más grande que el corte cerebral y añade medio OCT al centro de la pieza, luego coloca la rodaja encima del OCT.
  3. Congela la rodaja por inmersión en 300 mL de isopentano frío con nitrógeno líquido a -50 °C hasta que el medio OCT se vuelva completamente blanco. Las rodajas de cerebro pueden mantenerse a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo hasta la sección.
  4. Antes de seccionar, mantén la sección cerebral a -20 °C durante al menos 5 horas para permitir que el tejido alcance lenta y homogéneamente la misma temperatura que el criostato.
  5. Corta la corta en secciones coronales en serie de 40 μm de grosor usando un crióstato, manteniendo un rango de temperatura interior de -20 °C a -25 °C.
  6. Recoger secciones flotantes en placas de 12 pozos y almacenarlas en una solución crioprotectora (150 mL de glicerol, 150 mL de etilenglicol, 150 mL de agua destilada y 50 mL de tampón F [1,682 g de fosfato monobásico dihidratado y 0,385 g de hidróxido de sodio disuelto en agua destilada, pH 7,4]) (1 mL/pozo, o más para cubrir completamente las secciones en el caso de cerebros grandes) a -20 °C hasta la tinción.
    NOTA: Las rebanadas de hemisferio entero varían según el tamaño del cerebro. Los cerebros más grandes (por ejemplo, chimpancés, caballos) deben dividirse en dos bloques iguales (dorsal y ventral) para ser procesados en el criostato. En este caso, las secciones flotantes pueden recogerse en dos placas de 6 pozos. Una alternativa es seccionar hemisferios de especies de cerebro grande con un microtomo deslizante, lo que permite bloques de mayor tamaño.

Figura 2
Figura 2: Procesar cerebros muy diferentes siguiendo el mismo procedimiento y lidiando con variables que no pueden estandarizarse. En el método descrito anteriormente, todos los procedimientos que pueden estandarizarse se realizan de la misma manera (fijación general, corte de secciones coronales seriadas del mismo grosor en todo el hemisferio, procedimientos inmunocitoquímicos generales, recuento celular). Figura creada con BioRender (https://app.biorender.com/). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Tinción histológica

  1. Elige secciones coronales seriadas (1 de 12). Para obtener este espacio, se extraen todas las secciones de un pozo de la placa de 12 pozos. Utilízalos para obtener una representación completa de todo el hemisferio y como referencia para seleccionar secciones coronales en diferentes niveles cerebrales comparables entre las distintas especies estudiadas (véase la sección 5). Móntalas en portaobjetos gelatinizados al 1%. Déjalos secar unas horas.
  2. Prepara las siguientes soluciones (150 mL/solución): etanol 50%, 70%, 96%, 100%, xilol y azul de toluidina.
  3. Protocolo de tinción: Colocar las láminas en concentraciones crecientes de etanol (50%-100%), 1 minuto cada una al 50%-70%, 2 minutos cada una al 96%-100%, y luego transfiera a la solución de xilol durante 1 minuto.
  4. Colocar las láminas en orden inverso: solución de xilo durante 1 minuto y luego concentraciones disminuyentes de soluciones de etanol (100%-50%), 2 minutos cada una al 100%-96%, 1 min cada una al 70%-50%.
  5. Coloca los portaobjetos en 150 mL de H2Odestilado (2 min).
  6. Coloca las láminas en la solución de tinte azul de toluidina (5-10 minutos). Tras este paso, las secciones teñidas aparecen de un azul oscuro.
    NOTA: El tiempo que se mantienen las secciones en las soluciones para la tinción histológica puede variar según la especie. Prueba las secciones cerebrales de la especie de interés para establecer el protocolo óptimo de tinción.
  7. Enjuaga las láminas con 150 mL de H2Odestilado durante 1 minuto.
  8. Procede con el paso de diferenciación colocando las láminas en concentraciones crecientes de etanol (70%-100%) durante 1 minuto al 70%, 2 minutos cada una al 96%-100%, y luego transfiere a la solución de xilol durante 1 minuto y 30 segundos. Durante estos pasos, las secciones cambiarán de un azul oscuro a un azul celeste.
  9. Asegúrate de que las secciones sigan húmedas desde el último paso de xilol antes de deslizar la tapa usando medio de montaje (si se secan, enjuágalas en solución de xilol durante 5 segundos). Luego deja que los portaobjetos se sequen unos días.

5. Selección de niveles cerebrales y tinción inmunohistoquímica

  1. Utilizando las secciones teñidas histológicamente obtenidas en la sección 4 como referencia, identificar los niveles cerebrales según características neuroanatómicas específicas: Nivel 1 (L1) - desde la apertura anterior del ventrículo lateral hasta L2; Nivel 2 (L2) - desde el inicio anterior de la cápsula interna hasta L3; Nivel 3 (L3) - desde el inicio anterior de la amígdala hasta L4; Nivel 4 (L4) - desde el cierre posterior del ventrículo lateral hasta una extensión equivalente a la de L2 (mismo número de secciones seriadas de 40 μm de grosor; Figura 3).
    NOTA: Las referencias neuroanatómicas mencionadas anteriormente tienen como objetivo permitir la comparación de las cortezas cerebrales pertenecientes a cerebros de tamaños muy diferentes y a la girencefalia. Dependiendo de la región cerebral de interés, las características anatómicas utilizadas como referencia pueden cambiar.
  2. Elige tres secciones coronales equidistantes de cada nivel cerebral.
    NOTA: El volumen de cada buffer utilizado en los siguientes pasos varía según el tamaño del cerebro (por ejemplo, 0,5 mL/pozo para secciones de ratón, 1,5 mL/pozo para secciones de caballos). Asegúrate de que las secciones flotantes estén completamente cubiertas por cada buffer.
  3. Lava las secciones tres veces en PBS 0,01 M, pH 7,4, durante 5 minutos cada una.
  4. Incubar secciones en una solución bloqueadora de peroxidasa endógena (0,6% H2O2, 1% Triton X-100 en 0,01 M PBS, pH 7,4; 20 min) o realizar la recuperación de antígenos usando ácido cítrico (10 mM de ácido cítrico en agua destilada suplementado con 0,05% Tween 20, pH 6,0), 5 min a 90 °C.
    NOTA: Dependiendo del procedimiento/tiempo de fijación y del antígeno de interés, puede ser necesaria una extracción de antígeno para obtener una tinción óptima (el tampón, la temperatura, el pH y el tiempo de incubación pueden variar según el antígeno de interés).
  5. Lava las secciones de nuevo en PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 lavados de 5 minutos).
  6. Incubar secciones en solución bloqueante (albúmina sérica bovina (BSA) al 1-5%, suero normal, 1-1,5% Triton X-100 en 0,01 M PBS, pH 7,4; 90 min en RT).
  7. Incubar secciones con solución primaria de anticuerpos (1-5% BSA, 2-3% suero normal, 1-1,5% Triton X-100, anticuerpo primario en 0,01 M PBS, pH 7,4; 48 h a 4 °C bajo suave agitación).
    NOTA: Los anticuerpos contra el antígeno de interés pueden dar resultados diferentes en cuanto a calidad de la tinción cuando se usan en distintas regiones cerebrales y en distintas especies26. Se necesita una comparación entre un conjunto de anticuerpos de diferentes fabricantes para elegir la herramienta óptima a utilizar en las distintas especies consideradas para el estudio (para reducir la variabilidad entre muestras).
  8. Repite el paso de lavado descrito en el paso 5.3.
  9. Incubar secciones con solución secundaria de anticuerpos biotinilados (1-5% BSA, 2-3% suero normal, 1-1,5% Triton X-100, anticuerpo biotinilado secundario en 0,01 M PBS, pH 7,4; 2 h en RT).
    NOTA: El método del complejo avidina-biotina peroxidasa se utiliza para el recuento celular en Neurolucida (véase sección 6), ya que proporciona un precipitado denso y duradero, permitiendo así enfocar a través del grosor de la sección durante el contar. También se pueden utilizar inmunofluorescencias y análisis confocales para realizar doble o triple inmunotinción para caracterizar mejor las células (para los protocolos, véase Ref.22,25,32).
  10. Prepara el complejo avidina-biotina-peroxidasa usando el kit disponible.
    NOTA: Preparar la solución del complejo avidina-biotina peroxidasa en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (que proporciona un pH estable para la formación del complejo) al menos 1 hora antes de su uso, para permitir la formación compleja.
  11. Lava las secciones dos veces en PBS 0,01 M, pH 7,4 (2 x 5 min) y una vez en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (5 min).
    NOTA: Dado que el complejo avidina-biotina-peroxidasa está en solución con Tris-HCl 0,05M, el enjuague con Tris-HCl 0,05 M permite la habituación del tejido a la solución.
  12. Incubar secciones en el complejo avidina-biotina-peroxidasa (1 h en RT).
  13. Lava las secciones en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (3 x 5 lavados de 5 minutos).
  14. Bajo una campana extractora, incubar secciones en una solución de tinción 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (H2O2, DAB en Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5) hasta obtener la tinción óptima. Durante este paso, las secciones pasan de un color transparente a un color marrón/burdeos.
    NOTA: El tiempo para obtener la tinción óptima varía según la especie analizada (por ejemplo, para DCX, 2-5 minutos para secciones de ratón, 20-30 minutos para secciones de caballos). Revisa las manchas de las secciones cada 2 minutos para evitar que se sobremanchen.
  15. Lava las secciones en PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 lavados min).
  16. Monta secciones sobre un corredero, una vez seco, cúbrelo con un cubrimanes usando un medio de montaje y deja que los deslizadores se sequen durante unos días.

Figura 3
Figura 3: Establecimiento de niveles neuroanatómicos cerebrales para el estudio de la distribución y cantidad de neuronas inmaduras de DCX+ en la corteza cerebral. Cuatro estructuras neuroanatómicas correspondientes (inicio anterior del ventrículo lateral [nivel 1, L1]; inicio anterior de la cápsula interna [L2]; inicio anterior de la amígdala [L3]); cierre posterior del ventrículo lateral [L4]; indicados por círculos rojos) se consideraron que establecían cuatro "niveles cerebrales" anteriores a posteriores correspondientes en todos los mamíferos considerados, para estudiar el número de cIN dentro de la corteza cerebral de manera "comparable". (R) Se da un ejemplo para roedores de laboratorio (ratón, izquierda) y primates (chimpancé, derecha). Se consideran tres secciones coronales de cada nivel cerebral (para un total de 12 secciones; puntas de flecha rojas) para el recuento celular en todo el perímetro de la capa II de cada sección coronal (NOTA: todas las secciones contienen neocorteza, aunque solo algunas también contendrán paleocorteza). Este enfoque pretende permitir que los análisis se realicen sobre niveles neuroanatómicos correspondientes en cerebros de tamaños muy variados. (B) Se da un ejemplo para la identificación del primer nivel (L1) en secciones teñidas histológicamente de especies de mamíferos muy diferentes. Iconos de cerebro y animal creados con BioRender. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

6. Conteo de celdas

  1. Abre el software Neurolucida en la estación de trabajo y coloca la lámina bajo el microscopio con el objetivo seleccionado para el recuento celular.
    NOTA: Para los conteos de celdas DCX+, se utilizó un objetivo de 20x.
  2. A baja ampliación (por ejemplo, 4x), dibuja el contorno de la capa cortical II usando la herramienta de línea de contorno a mano alzada en el menú Trazado del software, para obtener el perímetro de longitud (tanto paleocorteza como neocorteza).
  3. Selecciona los símbolos preferidos para contar celdas en la barra de herramientas Marcadores, que aparecen en la parte izquierda de la pantalla. Para este análisis, se cuentan diferencialmente dos células diferentes en cada región de interés (paleocorteza, neocorteza) según su morfología (correspondientes a diferentes estados de maduración: tipo 1, con un soma pequeño y forma bipolar, diámetro soma de 3-9 μm; tipo 2, con un soma mayor y una arborización dendrítica compleja, diámetro soma de 9-18 μm).
    NOTA: Para este análisis, se seleccionan dos símbolos/tipos de celda diferentes para cada región de interés en la Barra de Herramientas de Marcadores. Dividir el diámetro del soma en diferentes rangos es crucial para categorizar meticulosamente las células sin una morfología clara, que puede estar en un estado intermedio de maduración. Para evitar el sobreconteo, las células cortadas en la superficie superior de la sección quedan excluidas del análisis.
  4. Recoge los datos para el análisis filogenético de tres regiones diferentes: paleocorteza, neocorteza y corteza cerebral (esta última obtenida añadiendo datos de la paleocorteza y neocorteza).
  5. Recoge en un archivo de hoja de cálculo el perímetro cortical de la capa dos (mm), visible en la barra de herramientas de Medidas de Contorno del software.
  6. En la misma hoja de cálculo, recopila el número de células tipo 1 y tipo 2 (visibles en la barra de herramientas de Marcadores) y el número total de células (obtenidas sumando células tipo 1 y tipo 2) en cada región cerebral y el nivel cerebral considerado (tres secciones/nivel, un total de 12 secciones/muestra).
  7. Utiliza estos datos para obtener, para cada sección de cada región, la densidad lineal de celdas (número de celdas/mm) y el porcentaje de celdas tipo 1 y tipo 2 (número de celdas tipo 1/tipo 2 dividido por el número total de celdas y multiplicado por 100).
  8. Calcula el valor mediano de densidad (usando la función mediana en la hoja de cálculo) de las 12 secciones consideradas/muestra, para representar gráficamente la densidad lineal de celdas. Utiliza la mediana como medida central porque la muestra por grupo es relativamente pequeña (4 animales/grupo), y algunos grupos presentan distribuciones asimétricas (la mediana está menos influenciada por los valores extremos).
  9. Calcula el porcentaje de celdas tipo 1 y 2 en cada muestra (usando la fórmula descrita anteriormente) y luego obtén el valor medio de los porcentajes entre los cuatro especímenes considerados/especie (usando la función Promedio en la hoja de cálculo). Posteriormente, se utiliza la densidad celular lineal para realizar análisis filogenéticos (véase la sección 7), y se utiliza el total de células contadas en cada sección coronal para estimar el número total de neuronas/hemisferios inmaduros.
  10. Utiliza la herramienta de contorno a mano alzada en Neurolucida Software para dibujar una línea a lo largo del diámetro del soma perpendicular a su eje principal. Al realizar este paso, calcula la longitud de diámetro de al menos 100 células DCX-positivas (DCX+) seleccionadas aleatoriamente de ambos tipos en cada especie (25 células/muestra) en cada región cerebral, para obtener el rango de diámetro del soma de las células tipo 1 y tipo 2.

7. Análisis filogenéticos: generación de árboles filogenéticos

  1. Crea una lista de las especies analizadas en Notepad usando sus nombres científicos y luego súbela al sitio https://timetree.org/.
    NOTA: Los nombres científicos pueden consultarse utilizando el sitio: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
  2. Exporta el archivo de árbol obtenido haciendo clic en el botón de ir a Newick file .

8. Análisis filogenéticos: Integración de datos de conteo en el árbol filogenético

  1. En columnas separadas de una hoja de datos, enumera todas las especies analizadas y los datos correspondientes con los que se correlacionan (en este caso: densidad celular DCX+ de la corteza entera, densidad celular DCX+ del neocórtex y densidad celular DCX+ del paleocórtex). Si hay varios individuos disponibles por especie, calcular la media de la densidad mediana para los parámetros seleccionados.
  2. Descarga el software del Proyecto Mesquite (https://www.mesquiteproject.org/) para fusionar el árbol filogenético con los datos de conteo.
    NOTA: Este software requiere que Java ya esté presente en el ordenador.
  3. Abre el archivo de Newick que Timetree había guardado anteriormente haciendo clic en Abrir archivo. Luego, selecciona la opción de archivo Simple Newick/Phylip Treefile . Trata el archivo como texto y guárdalo como ".nex".
  4. En la nueva página que se abre, selecciona Taxa&Árboles seguido de Nuevas Tres Ventanas, y selecciona Con Árboles desde Fuente. En la ventana emergente, selecciona Árbol Almacenado y pulsa Aceptar. Se mostrará una nueva pestaña llamada Árboles Importados .
  5. Modifica gráficamente el árbol filogenético (por ejemplo, fuente, tamaño, ramas proporcionales a la longitud) en la sección de Display .
  6. Añade una nueva pestaña en Mesquite, seleccionando Añadir seguido de Nueva Matriz de Caracteres y elige el número de caracteres (para este estudio, número = 3, que corresponde a las tres densidades de celdas DCX+). Trata los caracteres como datos continuos.
    NOTA: Los caracteres representan los datos que se correlacionan con el árbol filogenético.
  7. Copia en esta pestaña recién creada los datos que se correlacionarán con el árbol filogenético (pt. 6.4) y guárdalos.
  8. En la pestaña Árboles importados, selecciona Análisis:Árbol y Rastrear Historial de Caracteres para realizar un análisis de Estados Ancestrales Parsimonia .
  9. Guarda el archivo como PDF.

9. Análisis filogenéticos: Correlación entre tamaño cerebral y densidades celulares DCX+

  1. En la hoja de datos creada anteriormente, añade una columna con el tamaño del cerebro de cada especie.
  2. Calcula el logaritmo natural de las densidades celulares DCX+ y del tamaño cerebral.
  3. Lanza el paquete de software estadístico preferido (https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html) y realiza una regresión lineal sencilla
  4. Descarga los archivos de resultados y guarda los residuos como nuevas columnas en la hoja de datos.
    NOTA: Los residuos representan la desviación de los puntos de datos respecto a la línea de regresión.
  5. En la hoja de datos, selecciona la columna de residuos y la columna que contiene los nombres de las especies. Luego, ve a insertar y elige el gráfico histograma para mostrar gráficamente los residuos.

10. Análisis filogenéticos: Extensión neocortical y correlación de densidad celular neocortical DCX+

  1. En la hoja de datos creada previamente, añade una columna con los datos de superficie de la capa neocortical II de cada una de las especies y calcula los logaritmos naturales.
  2. En el software estadístico, se realiza una regresión lineal simple utilizando los valores del área superficial logarítmica neocortical de capa II como variable X y la densidad celular DCX+ de neocorteza logarítmica como variable Y.
  3. Descarga los archivos obtenidos y guarda los residuos en una nueva columna de la hoja de datos, donde el gráfico residual puede hacerse como en el paso 9.5.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células DCX+ en la corteza cerebral de todas las especies estudiadas comparten consistentemente una serie de características que indican la existencia de una población bien conservada de neuronas indiferenciadas (Figura 4A). En resumen, están: (i) están dispuestos topográficamente para formar una monocapa a lo largo de la capa cortical II; (ii) mostrar los subtipos morfológicos descritos para diferentes etapas de maduración en neuronas inmaduras, (a) con una gran prevalencia de células p...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método descrito aquí proporciona datos cuantitativos comparables cuando se consideran especies diversas que difieren ampliamente en tamaños cerebrales y neuroanatomía. Puede utilizarse para evaluar la consistencia de las poblaciones celulares en todo el cerebro de diversos mamíferos, así como para seguir su desarrollo en una sola especie a lo largo de las etapas posteriores, desde el posnatal hasta el envejecimiento. Parte de la suposición de que un número relativamente alto de cerebr...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Matteo Piumatti y Chiara La Rosa por haber contribuido a definir el protocolo aquí reportado para las neuronas corticales inmaduras. El trabajo contó con el apoyo de la Fondazione CRT - Cassa di Risparmio di Torino (subvención RF=2022.0618) a LB; PRIN2022 (concesión 2022LB4X3N) a LB; Fundación Nacional de Ciencias (subvenciones EF-2021785, DRL-2219759) y los Institutos Nacionales de Salud (subvenciones NS092988, AG067419) a CCS.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10% formalinaSigma-AldrichHT501128
2-metilbutano y nbsp;Sigma-Aldrich320404Isopentane
3,3′-Diaminobenzidina tetrahidrocloruro hidratadoSigma-AldrichD5637
4% de paraformaldehídoSigma-Aldrich441244
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA9647
Ácido cítrico y nbsp;SigmaC0759
Montante DPX para histologíaSigma-Aldrich  06522
EtanolMerck1.00983
EtilenglicolSigma-Aldrich102466
GlicerolSigma-AldrichG7893
Solución de peróxido de hidrógenoSigma-AldrichH1009
Killik - Complejo O.C.T.Bio-óptica  05-9801
Software de mesquiteProyecto MesquiteMesquite versión 3.81 (build 955)
Neo-mountSigma-Aldrich1.09016
Fosfato tamponado (PB)nanaHechos a medida
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)nanaHechos a medida
Hidróxido de sodioRiedel-de Haen6213
Dihidrato de fosfato sódicoSigma-Aldrich71645
Fosfato de sodio monobásico dihidratoSigma-Aldrich71500
SacarosaSigma-AldrichS9378
Azul ToluidinaSigma-Aldrich89640
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787
Preadolescentes 20Sigma-AldrichP9416
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Peroxidasa (Estándar)Laboratorios VectorPK-6100
Xylol Sigma-Aldrich247642

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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