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Artículo de método

Inmunotinción de montura completa de ovarios fetales y neonatales de ratón

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DOI:

10.3791/69455

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28 de abril de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método para el inmunomarcaje de montajes completos de ovarios de ratón en desarrollo, con aplicaciones a otros tejidos pequeños.

Resumen

La reserva ovárica consiste en los ovocitos disponibles para la reproducción femenina y se encuentran en folículos primordiales, cada uno con un ovocito rodeado por varias células de granulosa. Los ovocitos comienzan como células germinales primordiales que se forman fuera de la gónada y migran al ovario en desarrollo durante el desarrollo embrionario. Una vez que llegan al ovario, se convierten en oogonia y se dividen por mitosis, con citocinesis incompleta, formando grupos de células interconectadas llamados quistes germinales. Mientras están en quistes, las células entran en meiosis y se convierten en ovocitos. En el ratón, dos días antes del nacimiento, los quistes comienzan a descomponerse y cada ovocito se empaqueta en un folículo primordial. Solo algunos ovocitos sobreviven durante este proceso, el resto sufre apoptosis. La regulación de la descomposición de los quistes y la formación de folículos primordiales solo se entiende parcialmente, e identificar las moléculas implicadas es crucial para comprender este proceso. La inmunotinción de montajes completos de ovarios de ratón en desarrollo puede utilizarse para determinar la localización de moléculas reguladoras potenciales y evaluar los efectos sobre la formación de folículos primordiales debido a mutaciones u otros cambios moleculares mediante marcadores de ovocitos y células somáticas. Los ovarios se extraen de ratones fetales o neonatales, se fijan en formaldehído y se bloquean. Los ovarios se exponen entonces a anticuerpos contra una proteína de interés, seguidos por anticuerpos secundarios conjugados a una etiqueta fluorescente que detectan los anticuerpos primarios. Finalmente, los ovarios se montan y examinan mediante microscopía confocal. Este procedimiento puede detectar múltiples proteínas de interés y puede aplicarse a otros tejidos pequeños, como los testículos fetales de ratón.

Introducción

La inmunotinción de montaje completo combinada con imagen confocal es un método potente para analizar la expresión proteica y la morfología celular en tejidos pequeños sinseccionar 1. En este método, primero se extraen, fijan y bloquean los tejidos, y luego se exponen a anticuerpos contra proteínas de interés. Los anticuerpos se conjugan directamente con fluoróforos o se marcan con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos que reconocen los anticuerpos primarios. El tejido se incuba entonces con el tinte fluorescente 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar los núcleos celulares. Este paso es importante para proporcionar orientación espacial al obtener imágenes del tejido. Finalmente, el tejido se monta y se visualiza mediante microscopía confocal. Otra técnica utilizada para estudiar la morfología tisular consiste en incrustar el tejido en parafina, seccionar y marcar con colorantes como la hematoxilina y la eosina o con anticuerpos. Alternativamente, se pueden preparar secciones congeladas y tintarlas inmunológicamente. Desafortunadamente, ambas técnicas implican seccionamiento, lo que resulta en la pérdida de información tridimensional. Aunque las secciones seriadas pueden ayudar, el análisis es tedioso e implica ver un gran número de secciones. Por tanto, el método de montaje completo es ventajoso ya que preserva la estructura tridimensional del tejido que puede visualizarse mediante la sección óptica.

El desarrollo de células germinales primordiales (PGC) en ovocitos y el ensamblaje de los ovocitos en folículos primordiales son esenciales para la fertilidad femenina. Las PGC se forman de forma extraembrionaria y deben migrar al ovario durante el desarrollo embrionario. Una vez que las PGC llegan al ovario, comenzando aproximadamente en el día embrionario (E) 10,5 en el ratón, se clasifican como oogonia2. Los oogonia sufren mitosis pero con citocinesis incompleta, formando grupos interconectados de células llamados quistesgerminales 3. Los oogonia entran en meiosis a partir de E 13.5 para convertirse en ovocitos y progresar a través de la profase I hasta la etapa diplotena. A medida que los ovocitos se desarrollan, los quistes se descomponen, permitiendo que cada ovocito esté rodeado por una capa de células de granulosa, formando folículos primordiales, cada uno con un ovocito 4 retenido por diploteno. Se produce una gran pérdida de ovocitos coincidiendo con la descomposición de quistes, y se cree que esto es importante para el control de calidad durante la formación de folículos primordiales. El número de ovocitos retenidos por diploteno en los folículos primordiales constituye la reserva ovárica de ovocitos disponibles para la reproducción y está directamente relacionado con la fertilidad. Si la formación del folículo se ve interrumpida, esto podría provocar una reserva ovárica más reducida, limitando la esperanza de vida reproductiva femenina.

Se utilizó la inmunotinción de montaje completo para identificar y analizar la expresión de proteínas durante el desarrollo de ovocitos embrionarios, fetales y neonatales. Las moléculas examinadas incluyen MSY2, SYCP3, ESR1, ESR2, CYP19A1, 3βHSD, KIT y STAT3 5,6,7,8,9. Esta técnica también se ha utilizado ampliamente para descubrir cómo se regula la formación primordial del folículo. Se cultivaron ovarios fetales o neonatales y se expusieron a moléculas de señalización o inhibidores. Los ovocitos en ovarios cultivados sufren formación foliculosa primordial similar a la 10 in vivo. El cultivo de ovarios se ha utilizado con éxito para examinar la señalización de la hormonaesteroidea 6,10,11,KIT 8 y PI3K12 durante esta etapa del desarrollo del ovario. Tras el cultivo, se emplea inmunotinción de montaje completo utilizando anticuerpos contra la helicasa DEAD box 4 (DDX4, también conocida como homólogo vaso de ratón (MVH)), una proteína expresada en el citoplasma de los ovocitos. A continuación, los ovarios se examinan mediante microscopía confocal para evaluar la formación de folículos primordiales.

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Protocolo

Todos los procedimientos con ratones fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Syracuse (IACUC). El siguiente protocolo es para marcar los ovarios de ratón neonatales en los días postnatales 1–5 (véase la Figura 1 para el esquema). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Extracción y reparación de ovarios

  1. Eutanasia a ratones neonatales C57BL/6 siguiendo la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" de los Institutos Nacionales de Salud y los protocolos de animales aprobados por IACUC. Diseccionar ovarios en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    NOTA: Para este procedimiento, los ratones neonatales fueron eutanasiados por decapitación según lo aprobado en nuestro protocolo animal IACUC. Machos y hembras de la cepa C57BL/6 pueden distinguirse en neonatos por la presencia de una pequeña mancha oscura entre las aberturas anogenitales en machos. Para diseccionar los ovarios, primero corta el estómago y saca los intestinos. Luego, abre el abdomen con una incisión en la línea media de la cola y después realiza dos cortes horizontales. Localiza los ovarios bajo cada riñón, aísla cada ovario y limpia el exceso de tejido.
  2. Coloque los ovarios directamente en 600 μL 5,3% de paraformaldehído (PFA; PFA de grado EM al 16% diluido en 1x PBS) (fijar) en un tubo microfuge a temperatura ambiente (RT). Incubar los ovarios fijos en un nutator durante la noche (O/N) a 4 °C.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico. Úsalo en una campana extractora o en una zona bien ventilada. Lleva guantes, protección ocular y ropa protectora para evitar el contacto visual y de piel. Eliminarlo como residuos peligrosos.
  3. Retira, fija y lava los ovarios dos veces en 1 mL de Triton X-100 al 0,1% en 1 PBS (PT) rápidamente, luego una vez cada 1 mL de PT en nutator durante al menos 30 minutos en RT. Incuba en 1 mL de PT + 5% de BSA (bloque) durante al menos 30 minutos en RT en nutator o guarda a 4 °C durante hasta 2 semanas.

2. Incubación con anticuerpos primarios y secundarios

  1. Incubar con anticuerpo primario diluido en 500 μl de PT + 5% BSA O/N a 4 °C en nutator. Lava tres veces en 1 mL de PT + 1% de BSA, 30 minutos en RT con nutator.
    NOTA: La dilución depende del anticuerpo. Los datos representativos que se muestran aquí están etiquetados con DDX4 diluido 1:200. Se pueden usar anticuerpos contra dos proteínas diferentes al mismo tiempo siempre que los anticuerpos primarios se produzcan en dos especies distintas y no se produzca un secundario en la especie que reconoce el otro secundario (no uses anti-ratón-Alexa 488 ni anti-cabra para burro-Alexa 568).
  2. Durante la incubación de ovarios con anticuerpo primario, incubar el anticuerpo secundario diluido con una pizca de polvo embrionario en 500 μL PT + 5% BSA O/N a 4 °C sobre nutator (cubierto con papel de aluminio) para reducir la unión inespecífica del anticuerpo secundario. Centrifuga el anticuerpo secundario a 6000 x g durante 30 segundos para recoger el polvo residual en el fondo. Asegúrate de no extraer este residuo al transferir el secundario al tubo de muestra.
    NOTA: La dilución depende del anticuerpo. Los datos representativos que se muestran aquí están etiquetados con anti-conejo para cabra Alexa 488 diluida 1:200.
  3. Incubar con anticuerpo secundario fluorescente preabsorbido (fabricado en el paso 2.2) durante 2–4 horas en RT en nutator. Cúbrelo con papel de aluminio a partir de ahora. Lava tres veces en 1 mL de PT + 1% de BSA, durante 30 minutos en RT con un nutator.

3. Marcar núcleos con DAPI y montar ovarios sobre una lámina

  1. Incubar en DAPI 1:1000 en PBS durante 90 minutos en RT. Lavar una vez con 1 mL de PBS 1x.
  2. Transfiere los ovarios a una lámina de microscopio utilizando una punta ancha de micropipeta de 200 μL. Retira el exceso de PBS con aguja o jeringuilla. Añade 3 gotas de medio de montaje en los ovarios.
  3. Aplica suavemente una funda de cobertura sobre los ovarios, asegurando que el soporte de montaje se extienda por los bordes de la funda. Sella los bordes del abrigo con esmalte de uñas y deja que se seque, luego guarda a -20 °C.

4. Preparación del polvo embrionario

  1. Homogeneizar ~ E 12,5–E 14,5 embriones de ratón en un volumen mínimo de 1x PBS helado. Añade 4 volúmenes de acetona bien fría, mezcla y incuba sobre hielo durante 30 minutos.
    PRECAUCIÓN: La acetona es inflamable y irrita tanto ojos como piel. Úsalo en una campana extractora o en una zona bien ventilada. Lleva guantes, protección ocular y ropa protectora para evitar el contacto visual y de piel. Eliminarlo como residuos peligrosos.
  2. Centrifuga a 10.000 x g durante 10 minutos, quita el sobrenadante y luego lava el pellet con acetona bien fría y vuelve a centrifugar.
  3. Extiende el pellet sobre una hoja de papel filtro, colócalo en una bandeja de plástico y deja secar el O/N en una campana química. Muele hasta obtener un polvo fino, deja que se seque completamente al aire y guárdalo a -20 °C.

5. Análisis de la expresión proteica mediante microscopía confocal

  1. Después de marcar la proteína de interés, visualízala mediante microscopía confocal. Para examinar la expresión de proteínas, normalmente utilizamos 3–4 animales (6–8 ovarios) y tomamos varias imágenes de cada ovario.
    NOTA: Las imágenes descritas en la sección de resultados representativos se obtuvieron con un microscopio confocal de disco giratorio o un microscopio láser confocal de barrido. Los parámetros utilizados se describen en la sección de resultados representativos y variarán según el microscopio utilizado.

6. Análisis de la formación y desarrollo del folículo primordial mediante microscopía confocal

  1. Después de marcar los ovarios para un marcador citoplasmático de ovocitos como DDX4, para cada ovario, asigna aleatoriamente dos áreas o "núcleos" para su visualización.
    NOTA: Un núcleo consta de 4 secciones ópticas principales que miden 212 × 212 μm, cada una separada por una profundidad de 15–20 μm. Las 4 secciones ópticas abarcan tanto la corteza como la médula para asegurar que todas las regiones del ovario sean evaluadas. Para cada ovario, habrá 2 núcleos con 4 secciones ópticas, para un total de 8 secciones (véase la Figura 2).
  2. Después de obtener imágenes de la sección óptica principal para su análisis, toma una pila en Z de 5 imágenes arriba y 5 imágenes debajo de la sección principal, cada una separada por 1 μm. Para cada sección principal, cuenta el número total de ovocitos en la sección
  3. Luego, para cada ovocito en la sección principal, determina si está asociado a otro ovocito o no examinando la sección principal y también la pila de secciones para determinar si los ovocitos en la sección principal estaban asociados con ovocitos por encima o por debajo del plano de enfoque. Por último, para cada ovocito, determina en qué etapa del desarrollo del folículo se encuentra (primordial, primaria o secundaria).
    NOTA: Se recomienda analizar al menos 4 animales (8 ovarios) para obtener datos estadísticamente significativos.

7. Uso de yoduro de propidio como marcador nuclear alternativo

  1. Tras el paso 2.3, incubar durante 30 minutos en 0,1 mg/ml RNasa A (10 μL de 10 mg/ml en 1 mL de PT + 1% de BSA). Retirar la RNasa A e incubar en 10 μg/mL yoduro propidio (10 μL de 1 mg/mL en 1 mL de PT + 1% de BSA) durante 20 minutos en RT con un nutator. Cubre el tubo con papel de aluminio a partir de este punto.
    PRECAUCIÓN: El propidium ioduro es tóxico y mutagénico. Úsalo en una campana extractora o en una zona bien ventilada. Lleva guantes, protección ocular y ropa protectora para evitar el contacto visual y de piel. Eliminarlo como residuos peligrosos.
    NOTA: Toto-3 también puede usarse como marcador nuclear.
  2. Retira yoduro de propidio y lava durante 30 minutos con 1 mL de PT + 1% de BSA. Salta el paso 3.1 (tinción DAPI).

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Resultados

Se muestran los resultados típicos del método de inmunotinción descrito aquí. Las imágenes de las Figuras 3, 4, 5 y 6 se tomaron con un microscopio confocal de disco giratorio utilizando un objetivo de aceite de 40x, NA 1,3, con un tiempo de exposición entre 100 y 250 ms y potencia láser entre 0,01 y 0,1%. En la Figura 3, l...

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Discusión

Este informe describe un método para marcar ovarios enteros con fluorescencia en busca de proteínas de interés. Este procedimiento se ha utilizado ampliamente para determinar la expresión de proteínas durante la formación del folículo primordial y también para caracterizar cambios en la formación del folículo bajo diferentes condiciones 4,5,6,7,8,9,10,11.<...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Las imágenes se realizaron en el Blatt Imaging Center de la Universidad de Syracuse. Las imágenes de la Figura 7 se obtuvieron de un Zeiss LSM980 con Airyscan2 soportado por el NIH S10 OD026946-01A1. Este trabajo fue financiado por las subvenciones R03 HD102016 y R21 HD112756 del NIH (a MEP).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
anti-Human VASA (hecho en cabra)R& DAF2030
anti-DDX4/MVH (fabricado en conejo)Abcamab13840
anti-GCNA1/TRA98 (fabricado en rata)Abcamab82527
Albúmina sérica bovina (BSA)FisherBP-1600
Portaportas 22 x 22 #1.5Warner Instruments64-0721
DAPI (polvo)Sigma AldrichD-9542preparar una solución de 5 mg/ml en dH2O
Alcance de disección
Alexa 568 anti-Cabra de burroInvitrogenA11057
Alexa 488 anti-Mouse de burroInvitrogenA21202
Alexa 568 anti-Conejo de burroInvitrogenA10042
Anti-Conejo Alexa 647 de BurroInvitrogenA31573
Alexa 488 anti-Rata de burroInvitrogenA21208
Proof de etanol 200Pharmco111000200
Tijeras Finas - AfiladasHerramientas Científicas Fines14060-09para trabajos finos para eliminar el ovario y recortar el exceso de tejido
Pinza (Pinza Dumont, Estilo 5)Ciencia de la Microscopía Electrónica72705-01 (0209-5-PO)
Alexa 488 anti-Conejo de CabraInvitrogenA11008
Tubos microcentrífugas 1,5 mLTermo Científica3451PK
Portaobjetos de microscopioFisherbrand12-550-123
Mezclador de nutaciónLabNetS0500
Paraformaldehído 16%Ciencia de la Microscopía Electrónica15710
Placas de Petri de 100 x 15 mmFabricación de bioplastos940-10774
Solución salina tamponada con fosfato 1X(Fisher) S271-1;                   (Sigma) P9541-500G; (Fisher) BP332-500; (Fisher) P285-500800 mL MQ H2O                            80 g NaCl                                        2.0 de KCl                                                14,4 g Na2HPO4                  2,4 g KH2PO4                  Ajustar el pH a 7,4 con HCl; volumen final 1 L Luego diluir de 10X a 1X para su uso
PortaalfileresHerramientas Científicas Fines26016-12para sujetar la aguja recta doblada en una ligera curva
Puntas del filtro de pipetaOneTip(10uL) 1121-3810;                           (20 uL) 1120-1810;                   (200 uL) 1120-8810;         (1000 uL XL) 1122-1830
Puntas de pipetaOneTIp(10 uL) 1111-3800;                   (200 uL) 1111-1800;         (1250 uL) 1112-1820
Pipetas 0.2-2, 2-20, 20-200, 100-1000Gilson(0.1-2 uL) F144054M;       (2-20 uL) F144056M;     (20-200 uL) F144058M;       (100-1000 uL) F144059M
Yoduro de propidio, 1mg/ml en dH2OInvitrogenP3566
Polvo RNasa ASigma AldrichRG513-50mgpreparar una solución de 10 mg/ml en acetato sódico de 0,1 M (pH 5,2). Calienta a 100 oC durante 15 minutos. Enfría a RT y ajusta el pH añadiendo 0,1 volumen de 1 M Tris-Cl (pH 7,4)
Aguja rectaaguja recta doblada en forma de curva para seccionar el exceso de tejido del ovario
Triton X-100Termo CientíficaX100-100ML
Jeringuilla de tuberculina 28G x 1/2Tyco/Healthcare Kendall Monoject1180128012
VectashieldLabratorios vectorialesH-1900
Tijeras WagnerHerramientas Científicas Fines14068-12Para decapitaciones y cortes mayores
Punta de pipeta de ánima ancha 20 ulLabCon1026-965-008-9

Referencias

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