Farmacología en red y estudio experimental de células in vitro para explorar el potencial terapéutico de los derivados de la tiazolona en el rabdomiosarcoma

Resumen

Presentamos un estudio que investiga sistemáticamente el potencial terapéutico de los derivados de tiazolona contra el rabdomiosarcoma basado en farmacología de red y química computacional, con validación y evaluación realizadas a través de experimentos celulares in vitro .

Resumen

El rabdomiosarcoma (DR) es un tumor maligno que se origina en rabdomioblastos, que representa una grave amenaza para la salud de niños y adolescentes. Basado en el potencial de los derivados de la tiazolona en una variedad de actividades biológicas, este estudio tiene la intención de explorar sistemáticamente los mecanismos de los derivados de la tiazolona en el tratamiento de la RD mediante la combinación de farmacología de red y experimentos celulares in vitro . A través de la farmacología de la red, se integraron datos de alto rendimiento para predecir los objetivos potenciales de la tiazolona. Además, se utilizó el software AutoDock Vina para calcular la energía de unión del compuesto y la molécula de proteína diana, revelando su vía de señalización relacionada con la RD. Finalmente, los experimentos celulares in vitro verificaron aún más el efecto supresor de tumores de los compuestos. Se utilizó farmacología de red para analizar los objetivos de los derivados de la tiazolona en el tratamiento de la DR, y finalmente se obtuvieron 172 genes diana mediante combinación y deduplicación. Se examinaron cinco dianas proteicas con baja energía de unión mediante acoplamiento entre el compuesto y la molécula de proteína diana, PIK3CD, AKT1, GSK3B, HSP90AB1 e ITGB1. Los resultados de los experimentos de cultivo celular in vitro mostraron que un derivado específico de la tiazolona tenía un efecto inhibidor significativo en las líneas celulares de ER, proporcionando una base científica para el descubrimiento de nuevas dianas y compuestos eficaces para el tratamiento de la ER. Este estudio reveló los mecanismos de los derivados de la tiazolona en el tratamiento de la DR a través de una combinación de farmacología en red y experimentos in vitro y proporcionó una nueva perspectiva para el desarrollo futuro de fármacos y estrategias de tratamiento.

Introducción

Rabdomiosarcoma (DR), un sarcoma de tejido blando pediátrico altamente agresivo que representa una amenaza significativa para la salud pediátrica, con opciones terapéuticas limitadas. Los estudios epidemiológicos indican que, si bien la DR exhibe tasas de incidencia relativamente bajas, su alta malignidad y mal pronóstico presentan desafíos clínicos sustanciales. La DR se clasifica en cuatro subtipos histológicos distintos: embrionario, alveolar, de células fusiformes/esclerosante y pleomórfico, siendo el rabdomiosarcoma embrionario (ERMS) la forma más prevalente ^1,2,3. Las estrategias terapéuticas actuales para los pacientes con EMREC de riesgo bajo recién diagnosticados consisten principalmente en la resección quirúrgica de tumores localizados combinada con fármacos quimioterapéuticos, como vincristina, dactinomicina y ciclofosfamida. Los pacientes de riesgo alto suelen recibir regímenes de quimioterapia multifarmacológica intensificados que incorporan ifosfamida y etopósido ^4,5. Si bien el enfoque multimodal que combina cirugía, quimioterapia y radioterapia ha demostrado eficacia para lograr el control tumoral local y erradicar las micrometástasis⁵, aún quedan desafíos importantes. Los perfiles de toxicidad sustanciales de los agentes quimioterapéuticos actuales, incluida la neurotoxicidad y el daño renal y vesical irreversible⁶, plantean riesgos particulares para los pacientes pediátricos y adolescentes. Además, la heterogeneidad inherente de la DR y su propensión a la recaída subrayan la necesidad crítica de desarrollar agentes terapéuticos más efectivos y dirigidos⁷.

En este contexto, la investigación aquí se centra en una clase de derivados de tiazolona con propiedades farmacológicas distintas. Los derivados de la tiazolona exhiben importantes actividades antiinflamatorias, antioxidantes y reguladoras de la apoptosis⁸, lo que demuestra una amplia actividad biológica y un potencial prometedor para el desarrollo de fármacos ^9,10. Las simulaciones de acoplamiento molecular de Elgubbi et al. revelaron fuertes afinidades de unión de los derivados de tiazolona a objetivos clave como la anhidrasa carbónica humana IX (CA IX), una enzima inducible por hipoxia sobreexpresada en tumores agresivos, lo que sugiere un mecanismo para sus efectos antiproliferativos¹¹. El estudio computacional aclara las interacciones moleculares entre los derivados de la tiazolona y las proteínas asociadas al cáncer. En 2024, El-Helw et al. informaron que los derivados de tiazolona basados en benzoquinolina exhiben una potente actividad contra las líneas celulares cancerosas, y los análogos de tiazoletilina y tiazol demuestran la mayor eficacia¹². Los estudios mecanicistas^10,13 sugieren que estos compuestos alteran la viabilidad de las células tumorales a través de vías duales: (1) inducción de estrés oxidativo a través de la modulación de la vía antioxidante y (2) inhibición directa de la proliferación. Estos hallazgos enfatizaron el amplio perfil farmacológico de las tiazolonas, incluidas las propiedades antiinflamatorias y antimicrobianas. En particular, compuestos como la pioglitazona¹⁴ y la troglitazona¹⁵ se emplean principalmente en el tratamiento de la diabetes tipo 2¹⁶, mientras que los derivados de la 4-tiazolona exhiben efectos antiproliferativos contra las células leucémicas¹⁷ (Figura 1). Estos compuestos no solo demuestran una promesa terapéutica significativa en estudios clínicos, sino que también se dirigen específicamente a múltiples vías de señalización celular, incluida la inhibición de la proliferación de células tumorales, la inducción de la apoptosis y la regulación del ciclo celular. Los mecanismos anticancerígenos de los derivados de la tiazolona involucran varias vías de señalización que dificultan eficazmente el crecimiento y la supervivencia de las células tumorales mediante la modulación de vías críticas, como las vías PI3K/Akt y NF-κB. Además, los derivados de la tiazolona también han exhibido efectos reguladores sobre el microambiente tumoral, incluida la inhibición de la angiogénesis y la modulación de las respuestas inmunes¹⁸. Las acciones mecanicistas multifacéticas de los derivados de la tiazolona los posicionan como candidatos ideales para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer.

En investigaciones anteriores, construimos eficientemente derivados de tiazolona con centros quirales adyacentes a través de una reacción de propargilación asimétrica distal catalizada por cobre. Utilizando ésteres propargílicos y tiazolonas como sustratos, la reacción fue catalizada por CuI en presencia de un ligando de piridina bis(oxazolina) sustituido por fenilo. Al optimizar las condiciones de reacción, logramos una alta eficiencia en la síntesis de estos derivados de tiazolona¹⁹. La farmacología en red, como enfoque de biología de sistemas, revela interacciones complejas entre fármacos, dianas y vías de enfermedad, revolucionando la comprensión y el desarrollo de terapias para enfermedades complejas como el cáncer²⁰. Este estudio tiene como objetivo preliminar revelar el valor terapéutico potencial de los nuevos derivados de la tiazolona en el tratamiento de la DR. A través de la farmacología de red integrada y los experimentos celulares, se identificarán compuestos con actividad superior, que pueden ejercer efectos terapéuticos multiobjetivo al regular coordinadamente cinco objetivos principales, incluidos PIK3CD y AKT1, influyendo así en vías de señalización clave como PI3K-Akt. Se utilizarán simulaciones de acoplamiento molecular y dinámica molecular para demostrar las características de unión entre el compuesto y las proteínas diana. Además, se establecerá un modelo preliminar de relación estructura-actividad, que proporcionará una referencia para la posterior optimización estructural. Este trabajo no solo ofrece nuevas moléculas candidatas para el desarrollo de fármacos para el rabdomiosarcoma, sino que también destaca el papel positivo de las estrategias multidisciplinarias en la exploración de los mecanismos terapéuticos multiobjetivo de los fármacos.

Protocolo

Todos los procedimientos de farmacología en red se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para los métodos de evaluación de farmacología en red²¹. El flujo de trabajo de farmacología de red integral adoptado en este estudio se ilustra esquemáticamente en la Figura 2.

Síntesis de derivados de tiazolona
Los derivados de tiazolona en este estudio se sintetizaron en nuestro trabajo anterior¹⁹, a través de una reacción de propargilación asimétrica remota catalizada por cobre. La reacción utilizó CuI como catalizador y un ligando quiral de Pybox (L1) como núcleo de estereocontrol, en un sistema de base DIPEA y disolvente de metanol a -10 °C durante 48 h, logrando un alto acoplamiento enantioselectivo entre ésteres propargílicos y tiazolonas. El producto objetivo se obtuvo con un rendimiento de hasta 89%, una relación enantiomérica (er) de 97,8:2,2 y una relación diastereomérica (dr) de 17,8:1. Para obtener información detallada sobre los métodos de síntesis de esta serie de compuestos, consulte estudios previos¹⁹. Este método demostró una amplia aplicabilidad del sustrato, acomodando arilo (orto-, meta-, para-sustituyentes), cadenas alifáticas y ésteres propargílicos de anillo fundido, así como varias tiazolonas sustituidas, con rendimientos que oscilan entre el 51% y el 98%. Esta estrategia construye eficientemente marcos de tiazolona de múltiples centros quirales en un proceso de un solo paso por primera vez, proporcionando un enfoque altamente selectivo y sencillo para la síntesis de moléculas de fármacos quirales con importantes aplicaciones potenciales en química medicinal.

Predicción farmacológica de red
Predicción del objetivo del derivado de la tiazolona: Las representaciones estructurales de los derivados de la tiazolona se generaron utilizando el software KingDraw, y los archivos estructurales correspondientes se convirtieron posteriormente en SMILES ID a través del software Open Babel. Para predecir posibles objetivos terapéuticos contra RD, empleamos un enfoque computacional integral utilizando tres bases de datos de predicción de objetivos distintas: SwissTargetPrediction (http://swisstargetprediction.ch/), TargetNet (http://targetnet.scbdd.com) y SuperPred (https://prediction.charite.de). Para el análisis de TargetNet, implementamos un criterio de filtrado estricto seleccionando genes con probabilidad > 0. En la base de datos SuperPred, aplicamos parámetros de selección más rigurosos, conservando solo aquellos genes que exhiben una precisión del modelo > 90% y una probabilidad > 60%, lo que garantiza predicciones objetivo de alta confianza.

Predicción de objetivos de DR: Con base en la base de datos GeneCards (https://www.genecards.org/) y la base de datos OMIM (https://omim.org/), realizamos una búsqueda de rabdomiosarcoma. Para los datos obtenidos de la base de datos GeneCards, filtramos los resultados con una puntuación superior a 20 para obtener genes asociados con rabdomiosarcoma.

Construcción y análisis de redes de interacción proteína-proteína (IBP): Se interceptaron los objetivos potenciales de los derivados de la tiazolona y los genes asociados con la RD. Los objetivos potenciales para el tratamiento del rabdomiosarcoma embrionario humano por derivados de tiazolona se cargaron en la base de datos STRING (https://www.string-db.org/) para el análisis de la relación PPI (interacción proteína-proteína) objetivo de alta confianza. La red PPI se construyó en el software Cytoscape (http://www.cytoscape.org/) y los objetivos principales se examinaron en función de los valores de grado.

Construcción de redes de vías compuestas-enfermedades-dianas: La red de vías farmacológicas-dianas puede ver claramente las dianas de compuestos y enfermedades y las vías implicadas en estas dianas, a fin de identificar posibles dianas y vías clave para la terapia compuesta para la ER. Primero, cree la tabla de red y la tabla de atributos en la hoja de cálculo. El contenido de la tabla de red incluye principalmente la correspondencia entre el compuesto y el objetivo central, la correspondencia entre el objetivo central y la vía involucrada, y la correspondencia entre RD y la vía principal. El contenido de la tabla de atributos es principalmente clasificar y nombrar toda la información de la tabla de red. Después de eso, abra el software Cytoscape, cargue la lista de conexiones en la ubicación de carga, establezca el punto de inicio, el punto final, cargue la tabla de atributos y finalmente modifique la forma de la imagen.

Anotación funcional integrada y análisis farmacológico de red - Enriquecimiento de la ontología genética de la construcción (GO), Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG): El análisis de enriquecimiento de GO y KEGG de objetivos centrales se realizó mediante la base de datos DAVID (https://david.ncifcrf.gov/). De acuerdo con el orden del valor P de pequeño a grande, se seleccionaron los 10 elementos principales en el proceso biológico (BP), el componente celular (CC) y la función molecular (MF) en GO para su análisis, y se analizaron los 20 elementos principales en KEGG, y se crearon los mapas de burbujas GO y KEGG de objetivos centrales basados en la plataforma de microbioinformación en línea.

Acoplamiento molecular: Las proteínas diana principales se seleccionaron de la base de datos PDB (https://www.rcsb.org/) y se descargaron los archivos estructurales de las dianas principales. Inicialmente, las proteínas se deshidrataron utilizando el software PyMol, seguido de la separación de ligandos y receptores. Posteriormente, las proteínas se hidrogenaron mediante el software ADFRSuite y se obtuvieron los parámetros de la caja de cuadrícula para el software de acoplamiento molecular AutoDock. Los archivos pdbqt de derivados de tiazolidinona y proteínas diana centrales se prepararon utilizando el software AutoDock Vina. Luego se realizaron simulaciones de acoplamiento molecular de derivados de tiazolona y proteínas diana centrales. Finalmente, los modelos de acoplamiento molecular se visualizaron utilizando el software PyMol.

Simulación de dinámica molecular: El archivo PDB se convirtió al formato GRO compatible con GROMACS utilizando el campo de fuerza amber99sb-ildn y el modelo de agua TIP3P:
gmx pdb2gmx -f Pro.pdb -o Pro_temp_H.gro -ff amber99sb-ildn -water tip3p -ignh
Se agregó un cuadro límite periódico cúbico con una distancia de 1,2 nm de la proteína:
gmx editconf -f Pro_temp_H.gro -o Pro_temp_H_box.gro -c -d 1.2 -bt cubic
La caja estaba llena de moléculas de agua TIP3P:
gmx solvate -cp Pro_temp_H_box.gro -o Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top
El sistema se neutralizó agregando iones de Na:
gmx grompp -f iones.mdp -c Pro_temp_H_box_water.gro -p topol.top -iones.tpr
gmx genion -s iones.tpr -o Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -neutral
Se realizó minimización de energía:
gmx grompp -f minim.mdp -c Pro_temp_H_box_water_ion.gro -p topol.top -o em.tpr
gmx mdrun -v -deffnm em
Se llevó a cabo el equilibrio NVT:
gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -o nvt.tpr
gmx mdrun -deffnm nvt -v
Se llevó a cabo el equilibrio de la NPT:
gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr
gmx mdrun -deffnm npt -v
Se inició la simulación de dinámica molecular de producción:
gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md_0_1.tpr
gmx mdrun -deffnm md_0_1 -v

Una vez finalizadas las simulaciones, se analizaron las trayectorias resultantes mediante Dinámica Visual Molecular (VMD) y PyMOL, y se realizó el análisis de energía libre de unión entre las proteínas y los ligandos de moléculas pequeñas empleando el programa g_mmpbsa.

Evaluación de los efectos de los fármacos sobre la viabilidad celular de la DR
Las células RD (células embrionarias de rabdomiosarcoma; STR Authenticated) en la fase de crecimiento logarítmico se tripsinizaron para crear una suspensión celular a una concentración de 1 x10⁵ células/ml. Esta suspensión se sembró en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 10⁴ células/pocillo (100 μL por pocillo) y se incubó a 37 °C con 5% de CO₂ para permitir la adhesión celular. Después de la adhesión, el medio se reemplazó con 100 μL de medio sin suero que contenía 1% de FBS, y las células se privaron durante 12 h. Posteriormente, el medio se cambió por 100 μL del medio respectivo que contenía concentraciones variables del compuesto de prueba. Los pocillos de control se trataron con medio que contenía solvente o medio normal, y se incluyeron pocillos en blanco que contenían solo el medio correspondiente sin celdas. Las placas se incubaron a 37 °C con 5% de CO₂ durante 24 h (la duración se determinó mediante experimentos preliminares como óptima para observar el efecto inhibidor máximo de esta clase de compuestos en las células RD. Es decir, el tiempo requerido para que el valor de DO de la densidad celular alcance aproximadamente 1.0.). Posteriormente, se agregaron 10 μL de solución de CCK-8 a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1-4 h adicionales. Finalmente, la absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas. Las células tratadas con solvente sirvieron como grupo de control y los pocillos en blanco se utilizaron para la corrección inicial. La viabilidad celular se calculó en base a las lecturas de absorbancia.

Tasa de supervivencia% = [(grupo control-blanco)-(grupo experimental-blanco)]/(grupo control-blanco) x 100%

Resultados

En este estudio, se utilizaron 13 derivados de tiazolona (compuestos a-m; Figura 3, Figura 4) se sintetizaron previamente¹⁹ para evaluar su actividad inhibitoria contra las células cancerosas (Figura 5). Entre estos compuestos, el compuesto m a 100 μM mostró la mayor tasa de inhibición contra las células RD (Embryonal Rhabdomyosarcoma Cell) (STR Authenticated)²². Los experimentos poste...

Discusión

La farmacología de red se usa comúnmente para predecir y examinar posibles moléculas activas dentro de componentes complejos de la medicina tradicional china, y para dilucidar los mecanismos sinérgicos de acciones de múltiples componentes, múltiples objetivos y múltiples vías en formulaciones a base de hierbas. En este estudio, aplicamos un enfoque de farmacología de red para investigar sistemáticamente el mecanismo potencial de nuestro derivado de tiazolona recién sintetizado contra la ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de ensayo CCK-8	Beyotime Biotechnology Co., Ltd.	C0038	Un kit utilizado para medir la viabilidad y proliferación celular basado en la reducción de una sal de tetrazolio soluble en agua para formar un producto coloreado.
Banca limpia	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd	SW-CJ-1FD	Una estación de trabajo de flujo de aire laminar que proporciona un entorno estéril para manipular cultivos celulares y otros materiales sensibles.
Incubadora CO2	Fuerza de curación	HF90	Se utiliza un entorno controlado por temperatura, humedad y CO2 para mantener condiciones óptimas de crecimiento.
DMEM Glucosa Alta	Cytiva	SH30022.01	Un medio de cultivo celular con alta concentración de glucosa (4,5 g/L), adecuado para una variedad de tipos celulares, incluyendo células de mamíferos de rápido crecimiento.
FBS	YEASEN	40130ES76	Un suplemento común en medios de cultivo celular, que aporta factores esenciales de crecimiento, hormonas y nutrientes para la proliferación celular.
Microscopio invertido	OLIMPO	IX51	Un microscopio diseñado con la lente objetivo situada bajo el escenario, que permite observar cultivos celulares en frascos o placas desde abajo.
Lector de microplacas	Diatek	DR-200Bs	Un instrumento utilizado para detectar eventos biológicos, químicos o físicos en muestras de microplacas midiendo la absorbancia, la fluorescencia o la luminiscencia.
PBS	Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd.	GNM20012	Una solución tampón se utiliza comúnmente en investigación biológica para lavar células, diluir soluciones y mantener la estabilidad del pH.
RD (Célula de Rabdomiosarcoma Embrionario) (STR Autenticada)	Shanghai FuHeng Biotechnology Co., Ltd.	FH0712	La línea celular ha sido autenticada mediante análisis de repetición tándem corta (STR), posee un fondo genético bien definido e una identidad celular clara, asegurando así la fiabilidad y reproducibilidad de los datos experimentales.
RMPI Medio Modificado (1640)	Cytiva	SH30809.01	Un medio de cultivo celular ampliamente utilizado, desarrollado originalmente para células leucocitarias humanas, ahora se aplica a varios tipos celulares de mamíferos.
Tripsina-EDTA	Jinuo Biomedical Technology Co., Ltd.	GNM25200	Una solución utilizada para desprender células adherentes de superficies de cultivo mediante la digestión de proteínas extracelulares y la quelación de iones de calcio.