Purificación eficiente de polipéptidos similares a la elastina (ELPs) de E. coli mediante un método de extracción y precipitación a base de disolventes orgánicos

Summary

Este protocolo describe un método rápido y reproducible de extracción y precipitación a base de disolventes orgánicos para purificar polipéptidos similares a la elastina (ELP) de Escherichia coli, proporcionando una alternativa potencialmente escalable a los métodos convencionales de purificación de ELP.

Abstract

Los polipéptidos similares a elastina (ELP) son biopolímeros diseñados construidos a partir de secuencias repetitivas de pentapeptídeos que imitan motivos encontrados en la tropoelastina de mamíferos. Sus características únicas los convierten en candidatos ideales para una amplia variedad de aplicaciones biomédicas, que van desde la administración de fármacos y genes hasta la ingeniería tisular y la imagen molecular dirigida. Los enfoques convencionales de purificación a partir de la expresión de Escherichia coli (E. coli) pueden ser ineficaces para la ELP debido a la formación de cuerpos de inclusión. Otros métodos, como el ciclo inverso de transición (ITC), utilizan las propiedades de menor temperatura crítica de solución (LCST) del ELP para separarlo de contaminantes como los lipopolisacáridos (LPS), pero normalmente requieren múltiples pasos de calentamiento y refrigeración que son lentos y pueden resultar en bajas recuperaciones dependiendo de la secuencia, concentración y peso molecular del constructo ELP. Para afrontar estos desafíos, hemos desarrollado un flujo de trabajo de extracción-precipitación a base de disolventes orgánicos que aprovecha la hidrofobia intrínseca de la ELP para permitir una purificación rápida, robusta y ampliamente aplicable directamente a partir de pellets de células de E. coli. Este método utiliza disolventes orgánicos polares para ayudar en la ruptura celular y solubilizar selectivamente el ELP en un solo paso. Un paso de precipitación posterior elimina eficazmente disolventes orgánicos residuales, impurezas de bajo peso molecular y endotoxinas, produciendo ELP altamente puro con niveles de LPS inferiores a 1 EU/mL en menos de 3 horas. Los datos de microscopía de fuerza atómica sugieren que las proteínas de fusión ELP-purificadas de esta manera pueden autoensamblarse en estructuras similares a micelas inversas que mantienen la función de la proteína de fusión. Este método de purificación rápida ofrece a los investigadores una forma sencilla y potencialmente escalable de purificar el ELP, creando nuevas posibilidades para utilizar el ELP y sus proteínas de fusión como bloques flexibles para aplicaciones materiales y biomédicas.

Introduction

Los polipéptidos similares a elastina (ELPs) son biopolímeros compuestos por motivos repetitivos (VPGXG)ⁿ 1,2,3,4,5,6,7,8,9. El residuo invitado X en la unidad pentapeptídica puede ser cualquier aminoácido que no sea la prolina. Las variaciones en X pueden utilizarse para ajustar la hidrofobicidad, el comportamiento de transición térmica y las características funcionales del constructo ELP para crear materiales modulares biocompatibles que han sido ampliamente explorados en diversas aplicaciones^biomédicas 10,11,12.

Aunque la síntesis química puede utilizarse para producir péptidos cortos, es poco adecuada para ELPs de alto peso molecular ni para mantener la funcionalidad de proteínas de fusión^13,14. Por razones como estas, los ELP suelen expresarse de forma recombinante en E. coli, lo que permite una producción definida por secuencia en grandes cantidades. Sin embargo, este enfoque también puede traer desafíos. Durante su expresión en E. coli, los ELPs a menudo se acumulan dentro de cuerpos de inclusión densos, lo que requiere estrategias de recuperación eficientes para extraer la proteína^{funcional 15}. Además, la expresión bacteriana introduce biomoléculas no deseadas como proteínas de la célula huésped, ácidos nucleicos y lipopolisacáridos (endotoxinas) que deben separarse del ELP durante la purificación. Las estrategias tradicionales de solubilización usando detergentes (por ejemplo, dodecilo sulfato de sodio (SDS) o Triton X-100) o agentes caotrópicos como la urea han tenido un éxito limitado para nuestras secuencias de fusión ELP. En nuestra experiencia, Triton y la urea no lograron extraer los ELP de la fase de pellets, mientras que el SDS permitió la solubilización parcial pero interfería con la purificación de afinidad aguas abajo y era difícil eliminarlo completamente de la secuencia ELP hidrofóbica.

Hasta la fecha, el ciclo inverso de transición (ITC) sigue siendo el método de purificación más utilizado para los ELP. Esta técnica aprovecha su comportamiento LCST para precipitar selectivamente y resolubilizar el ELP a través de gradientes de temperatura y sal¹⁶. Sin embargo, con proteínas de menor peso molecular, la ITC es un proceso de varios pasos que consume mucho tiempo y que no es adecuado para ELPs atrapados en cuerpos de inclusión, requiriendo múltiples ciclos ITC que pueden provocar pérdida de proteínas en cada^{paso 7,16}.

Para superar estas limitaciones, adoptamos un flujo de trabajo de extracción y precipitación a base de disolventes orgánicos. Aunque Yakhnin et al. demostraron por primera vez una estrategia de partición impulsada por hidrofobicidad para la purificación de GFP usando gradientes de etanol y sal en^1998-17, el novedoso método que desarrollamos emplea mezclas de disolventes orgánicos para extraer directamente proteínas de fusión ELP de células de E. coli ⁷. Sweet et al. y Darji et al. adaptaron este enfoque a fusiones ELP, demostrando que la extracción con disolventes orgánicos permite una recuperación rápida de ELPs funcionales manteniendo la integridad estructural y la bioactividad ^8,9. Este enfoque utiliza sonicación y disolventes orgánicos para lisar células bacterianas y extraer ELPs en una sola operación, mientras precipita la mayoría de las proteínas hospedadoras y ácidos nucleicos. La recuperación de la fase orgánica rica en ELP, seguida de una precipitación rápida para aislar los ELP de disolventes e impurezas solubilizadas, produce ELPs altamente puros. Este enfoque también es capaz de obtener ELP puro a partir de pellets de E. coli con niveles de endotoxina inferiores a 1 EU/mL en menos de tres^{horas 7,8}.

Los estudios realizados hasta la fecha muestran que este método es capaz de purificar constructos ELP y proteínas de fusión ELP con diferentes pesos moleculares y puntos isoeléctricos, sin múltiples ciclos ITC ni pasos de solubilización (Figura 1). La microscopía de fuerza atómica (AFM) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM) sugieren que las proteínas de fusión ELP-purificadas de esta manera forman estructuras similares a micelas inversas (Figura 2), ayudando así a preservar la estructura y función de los dominios de fusión ELP durante la extracción con disolventes orgánicos. Este flujo de trabajo optimizado permite una purificación ELP más rápida y fiable para diversas aplicaciones^{biomédicas 7,8}. Cabe destacar que Aayush et al. informaron que los constructos ELP purificados por este método conservaban la función de unión al receptor del factor de crecimiento^{epidérmico 18}, lo que subrayaba que este método no solo produce material ELP puro, sino que también mantiene la actividad del dominio proteico de fusión.

Como demostración adicional de la utilidad de este método para aislar una fusión ELP-enzima, describimos un método detallado a base de disolvente orgánico para purificar un constructo ELP-Inteína-Corimasa mutasa 2 (ELP-I-Cm2) (Figura 3). Este método puede ser útil para la purificación rápida de otros ELP para aplicaciones de administración de fármacos y nanomateriales.

Protocol

1. Preparación de materiales

1. Cepa bacteriana: Utilizar células químicamente competentes de Escherichia coli BL21(DE3) como hospedadora de expresión.
   NOTA: Fueron seleccionados debido a su alta eficiencia en la transformación y su idoneidad para la producción de proteínas recombinantes.
2. Plásmido de expresión: Utilizar vector pET21(+) que codifica la proteína de fusión ELP-I-Cm2 con resistencia a la^{ampicilina 9}. Compra el vector plásmido de addgene. Inserta el gen Cm2 usando el sitio BsrG I al final de la inteína.
   NOTA: La secuencia de ADN plasmídico para esta proteína se proporciona en el Archivo Suplementario 1.
3. Medios de cultivo: preparación de medios Terrific Broth (TB) para medios de 1200 mL
   1. Prepara el medio (Parte 1) añadiendo 16 g de triptona, 32 g de extracto de levadura, 16 g de prolina, 6,8 mL de glicerol a 1100 mL de agua ultrapura. Mezcla bien para disolver todos los componentes. Ajusta el volumen final a 1200 mL usando agua ultrapura.
   2. Prepara el tampón de fosfato potásico (Parte 2) mezclando 23,1 g de_{KH 2}PO₄ y 125,4 g de K₂HPO₄, y luego lleva el volumen a 1 L con agua ultrapura.
   3. Autoclave de los componentes (Partes 1 y 2) por separado. Después del autoclave, ensambla el medio dividiendo la base de TB en cuatro alicuotas de 300 mL. Añadir 33 mL de tampón de fosfato a cada alicota en condiciones estériles.
4. Aditivos para la expresión
   1. IPTG: Realizar inducción usando IPTG a una concentración final de 1,2 mM (por ejemplo, añadir 396 μL de 1 M de IPTG a un cultivo de 330 mL).
   2. Antibiótico: Añadir ampicilina a una concentración final de 100 μg/mL para asegurar la selección de plásmidos.
5. Tampón de lisis (pH 8,5): Prepare el tampón de lisis con 10 mM de Tris Base y 22 mM de ácido etilendediaminetetraacético (EDTA). Ajusta el pH a 8,5 usando HCl o NaOH según sea necesario.
6. Disolventes orgánicos para extracción
   1. Emplear una variedad de disolventes orgánicos (Tabla 1) para extraer la proteína de fusión ELP-I-Cm2 de cuerpos de inclusión. Analizar estos disolventes tanto individualmente como en combinaciones binarias (1:1 vol: vol) para evaluar la eficiencia y la pureza del ELP.
      NOTA: Todos los disolventes utilizados eran de grado HPLC, excepto acetonitrilo (grado Optima), etanol (grado USP) y 1-Butanol (99% de pureza).
      PRECAUCIÓN: Todos los disolventes mencionados anteriormente son volátiles e inflamables. Deben manipularse dentro de una campana extractora química utilizando el EPI adecuado (bata de laboratorio, guantes de nitrilo y protección ocular). Muchos tipos de plásticos no son compatibles con disolventes orgánicos. Se recomienda ampliamente la vajilla plástica de polipropileno para experimentos de extracción-precipitación con disolventes orgánicos; De lo contrario, los plásticos que se van a utilizar deben analizarse sin una muestra valiosa para asegurar que son adecuados para su uso. La eliminación de los residuos disolventes debe seguir los procedimientos establecidos en las políticas institucionales correspondientes sobre residuos peligrosos.

2. Lisis y preparación celular (Figura 4A)

1. Resuspensión: Pesa 1 g de pellet celular y vuelve a suspenderlo en 4 mL de tampón de lisis recién preparado. Agita el vórtice suavemente hasta que el pellet esté completamente disperso y mezclado con el buffer.
2. Lisis enzimática: Añadir ~5 mg de lisozima para ayudar en la digestión de la pared celular. Deja que la suspensión incube a 4 °C durante 1 hora. Esto facilita la digestión enzimática parcial para potenciar la lisis celular.
3. Sonicación: Tras la incubación, sonica la muestra para completar la lisis celular y cizallar el ADN genómico. Utiliza ráfagas cortas de sonicación con sonda micropunta (dispositivo de 350 W, nivel de potencia 3) con intervalos para evitar sobrecalentamiento (por ejemplo, 5 s encendido/10 s apagado, repetido según sea necesario). Sonica las muestras sobre hielo y aplica la energía ultrasónica hasta obtener un lisado uniforme libre de partículas visibles, normalmente durante unos 5-8 minutos.
   NOTA: Una vez completada la sonicación, almacenar una aalícuota de 100 μL de la muestra (o del lizado) para el análisis de expresión ELP y así monitorizar el progreso de la purificación antes y después de los pasos de extracción y precipitación.
4. Centrifugación y análisis de expresión.
   1. Clarifica el lisado mediante centrifugación a 10.000 g durante 10 minutos a 20 °C, luego separa cuidadosamente el sobrenadante (fracción soluble) del pellet (fracción insoluble/cuerpo de inclusión).
   2. Evaluar la expresión de ELP en ambas fracciones mediante SDS-PAGE: extraer una alitería (por ejemplo, 10-20 μL) del sobrenadante y resuspender una masa equivalente de pellets en el tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) al mismo volumen; mezcla cada uno con 4 veces el buffer de Laemmli hasta un último 1x, calienta a 95 °C durante 5 minutos y carga cantidades iguales para permitir la comparación directa.
   3. Si el ELP objetivo es predominantemente soluble, procede a la extracción con disolvente orgánico utilizando el sobrenadante clarificado. Si es predominantemente insoluble (cuerpos de inclusión), descartar el sobrenadante y continuar con el flujo de trabajo de cuerpo de inclusión (lavado/solubilización y extracción) procesando el pellet mediante extracción con disolvente orgánico.
5. Lavado y secado de pellets (solo para ELP en cuerpos de inclusión): Invierte los tubos de la centrífuga para permitir el drenaje asistido por gravedad de cualquier tampón de lisis residual. Una vez que el líquido visible se haya drenado (~1-2 minutos), deja secar el pellet al aire a temperatura ambiente durante 5-10 minutos, asegurándote de que no tenga exceso de humedad antes de pasar a la extracción orgánica.

3. Extracción orgánica (Figura 4B)

NOTA: Cada ELP tiene su propia condición de disolvente preferente para obtener extracciones de alta pureza (por ejemplo, rendimiento en CA en la Figura 1). Por lo tanto, debe probarse un cribado inicial de 28 disolventes orgánicos y sus combinaciones, y analizar los aislados por PAGE para identificar las condiciones óptimas de eficiencia de solubilización para el constructo de interés.

1. Cribado de disolventes. Analizar los disolventes individuales mostrados en el paso 1.6 y sus mezclas binarias de disolventes 1:1 (v/v). Evalúa mezclas adicionales (por ejemplo, 1:2, 2:1, 4:1) para mejorar la efectividad del proceso.
   NOTA: Actualmente, no existen directrices para seleccionar racionalmente los disolventes o combinaciones más efectivos, por lo que es necesaria una campaña de cribado para seleccionar entre disolventes que previamente han tenido éxito en la solubilización de agregados proteicos hidrofóbicos. La selección final del extractor de disolvente orgánico que se utilizará para la purificación debe basarse en el análisis SDS-PAGE de los aislados obtenidos de este cribado.
2. Procedimiento de extracción
   1. Adición de disolvente: Añadir 4 mL de disolvente orgánico o mezcla de disolventes al pellet/sobrenadante secado al aire obtenido tras la lisis. Para combinaciones mixtas, asegura proporciones volumétricas precisas (por ejemplo, 2 mL de cada una para una combinación 1:1).
   2. Vórtice: Agita la suspensión vigorosamente durante 1 minuto para asegurar una mezcla y penetración profunda del disolvente en el pellet.
   3. Incubación (tiempo de retención): Permitir que la suspensión incube a 20 °C durante 5 minutos, asegurando suficiente tiempo de interacción para que las proteínas extracelulares se agrupen y sedimenten mientras los ELP se solubilizan en la fase orgánica.
   4. Centrifugación: Centrifugar la mezcla a 13.000 × g durante 10 minutos a 20 °C para separar las proteínas solubilizadas de los restos insolubles residuales.
   5. Recogida de sobrenadantes: Recoge cuidadosamente el sobrenadante sin alterar la bola. El sobrenadante contiene el ELP solubilizado, mientras que el pellet contiene proteínas de la célula huésped, ácidos nucleicos y lípidos.
   6. Medición de volumen: Registrar con precisión el volumen del sobrenadante recuperado. Se debe tener cuidado para que el sobrenadante esté libre de partículas de pellet. Esta medición es fundamental para el paso de precipitación aguas abajo.

4. Precipitación de proteínas

1. Adición de antidisolvente: Añadir acetona o acetonitrilo al sobrenadante orgánico a 2,33 veces el volumen medido del sobrenadante.
2. Incubación: Incuba la mezcla a 20 °C durante 5-7 minutos.
3. Centrifugación: Centrifugar a 10.000 g durante 10 minutos a 20 °C.
4. Manipulación de pellets: Tras la centrifugación, descarta cuidadosamente el sobrenadante y seca al aire la muestra dejando el tubo sin tapar bajo un suave chorro de gas nitrógeno durante 10-15 minutos, o incuba colocando tubos de centrifugadora sin tapar boca abajo sobre toallitas sin pelusa en una campana extractora durante 1 hora a 20 °C (no aplicar calor).

5. Manipulación y resuspensión de pellets de proteína

1. Resuspensión: Tras la precipitación y el secado al aire, se resuspende el pellet proteico en 50 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Pipetea suavemente arriba y abajo para asegurarte de que el pellet esté completamente disuelto.
2. Almacenamiento: Almacenar la proteína resuspendida a -20 °C para uso a corto y medio plazo. Evita ciclos repetidos de congelación y descongelación para mantener la integridad funcional de las proteínas.

6. Validación mediante SDS-PAGE

1. Preparación de la muestra: Mezclar la proteína purificada con un buffer de carga SDS-PAGE de 4× en una proporción 3:1 y un vórtice brevemente para asegurar la homogeneidad.
2. Condiciones de electroforesis: Carga sobre un gel SDS-PAGE al 15% para ELP-I-Cm2 y funciona a 100-120 V hasta que el tinte de seguimiento llegue al fondo.
   NOTA: El % de reticulación en el gel debe basarse en el tamaño del constructo ELP de interés
3. Tinción y visualización: Tiñe el gel usando tinte Instant Blue Coomassie u otro tinte adecuado durante 2 horas a 20 °C. Rechazar enjuagando con agua desionizada hasta lograr un fondo claro. Analizar la proteína aislada en ensayos de actividad para validar que se ha producido retención de actividad tras el flujo de trabajo de extracción y purificación por precipitación con disolventes orgánicos.

Results

Tras pasar por las fases finales del protocolo, el siguiente paso es la visualización del resultado extracción-precipitación mediante análisis SDS-PAGE y tinción azul Coomassie. Cuando hay un paso de lisis antes de la extracción orgánica, debe ser visible una banda ELP prominente. En el caso de ELP-I-Cm2, esta banda aparece a 100 kDa (Figura 3A).

El cribado de diferentes combinaciones de disolventes orgánicos demostró eficiencias variables en la extracción (

Discussion

La ITC se ha utilizado anteriormente para la purificación no cromatográfica de^{ELP 19}; sin embargo, puede ser un método que consume mucho tiempo y un proceso de bajo rendimiento. En los métodos detallados anteriormente, describimos un enfoque para la purificación rápida de una proteína de fusión ELP-I-Cm2, demostrando cómo el método de extracción-precipitación a base de disolventes orgánicos puede utilizarse eficazmente para la purificación de una amplia variedad d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoetanol	Bio-Rad	161-0710	Componente SDS-PAGE
30% Acrilamida/Bis-acrilamida	TCI	A3218	Componente SDS-PAGE
Acetona	Fisher Scientific	A949	Disolvente orgánico
Acetonitrilo	Fisher Scientific	A996	Disolvente orgánico
Ampicilina	Bio-Oro Biotecnología	A-301-25	Antibiótico
APS (Persulfato de amonio)	Bio-Rad	1610700	Componente SDS-PAGE
Butanol	Fisher Scientific	L13171	Disolvente orgánico
EDTA	Biorreactivos de Fisher	BP118-500	Componente búfer de lisis
Etanol	Laboratorios de Descontaminación	UN1170	Disolvente orgánico
Acetato de etilo	Fisher Scientific	E195	Disolvente orgánico
Glicerol	Productos de Investigación Internacional	G22020-0.5	Componente de medios de Terrific Broth (TB)
Ácido clorhídrico	Fisher Scientific	A144SI-212	Componente búfer de lisis
Tinción instantánea de Coomasie	Abcam	ab119211	Componente SDS-PAGE
IPTG	Bio-Oro Biotecnología	12481C25	Componente de expresión proteica
Isopropanol	Fisher Scientific	A451-1	Disolvente orgánico
K2HPO4 (Monobásico de fosfato de potasio)	Ciencia de los Wards	470302-246	Parte 2 Componente de búfer
KH2PO4 (Dibásico fosfato de potasio)	Ciencia de los Wards	470302-254	Parte 2 Componente de búfer
L-Proline	Productos de Investigación Internacional	P5200-500.0	Componente de medios de Terrific Broth (TB)
Lisozima	Bio-Oro Biotecnología	L-040-1	Componente búfer de lisis
Metanol	Fisher Scientific	A452	Disolvente orgánico
Búfer de muestra nativo	Bio-Rad	161-0738	Componente SDS-PAGE
Escalera de proteínas	Bio-Oro Biotecnología	P008-500	Componente SDS-PAGE
Amortiguador de gel de resolución	Bio-Rad	1610798	Componente SDS-PAGE
Sodim Dodeciil Sulfato (SDS)	Termo Científica	J18220-36	Componente SDS-PAGE
Hidróxido de sodio	Fisher Scientific	S318-500	Componente búfer de lisis
Buffer de gel apilado	Bio-Rad	1610799	Componente SDS-PAGE
TEMED	Bio-Rad	1610801	Componente SDS-PAGE
Tris Base	Biorreactivos de Fisher	BP-152	Componente búfer de lisis
Triptona	Productos de Investigación Internacional	T60065-1000.0	Componente de medios de Terrific Broth (TB)
Extracto de levadura	Productos de Investigación Internacional	Y20025-1000.0	Componente de medios de Terrific Broth (TB)