Este protocolo describe un método rápido y reproducible de extracción y precipitación a base de disolventes orgánicos para purificar polipéptidos similares a la elastina (ELP) de Escherichia coli, proporcionando una alternativa potencialmente escalable a los métodos convencionales de purificación de ELP.
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Artículo de método
Purificación eficiente de polipéptidos similares a la elastina (ELPs) de E. coli mediante un método de extracción y precipitación a base de disolventes orgánicos
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Resumen
Resumen
Los polipéptidos similares a elastina (ELP) son biopolímeros diseñados construidos a partir de secuencias repetitivas de pentapeptídeos que imitan motivos encontrados en la tropoelastina de mamíferos. Sus características únicas los convierten en candidatos ideales para una amplia variedad de aplicaciones biomédicas, que van desde la administración de fármacos y genes hasta la ingeniería tisular y la imagen molecular dirigida. Los enfoques convencionales de purificación a partir de la expresión de Escherichia coli (E. coli) pueden ser ineficaces para la ELP debido a la formación de cuerpos de inclusión. Otros métodos, como el ciclo inverso de transición (ITC), utilizan las propiedades de menor temperatura crítica de solución (LCST) del ELP para separarlo de contaminantes como los lipopolisacáridos (LPS), pero normalmente requieren múltiples pasos de calentamiento y refrigeración que son lentos y pueden resultar en bajas recuperaciones dependiendo de la secuencia, concentración y peso molecular del constructo ELP. Para afrontar estos desafíos, hemos desarrollado un flujo de trabajo de extracción-precipitación a base de disolventes orgánicos que aprovecha la hidrofobia intrínseca de la ELP para permitir una purificación rápida, robusta y ampliamente aplicable directamente a partir de pellets de células de E. coli. Este método utiliza disolventes orgánicos polares para ayudar en la ruptura celular y solubilizar selectivamente el ELP en un solo paso. Un paso de precipitación posterior elimina eficazmente disolventes orgánicos residuales, impurezas de bajo peso molecular y endotoxinas, produciendo ELP altamente puro con niveles de LPS inferiores a 1 EU/mL en menos de 3 horas. Los datos de microscopía de fuerza atómica sugieren que las proteínas de fusión ELP-purificadas de esta manera pueden autoensamblarse en estructuras similares a micelas inversas que mantienen la función de la proteína de fusión. Este método de purificación rápida ofrece a los investigadores una forma sencilla y potencialmente escalable de purificar el ELP, creando nuevas posibilidades para utilizar el ELP y sus proteínas de fusión como bloques flexibles para aplicaciones materiales y biomédicas.
Introducción
Los polipéptidos similares a elastina (ELPs) son biopolímeros compuestos por motivos repetitivos (VPGXG)n 1,2,3,4,5,6,7,8,9. El residuo invitado X en la unidad pentapeptídica puede ser cualquier aminoácido que no sea la prolina. Las variaciones en X pueden utilizarse para ajustar la hidrofobicidad, el comportamiento de transición térmic....
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Protocolo
1. Preparación de materiales
- Cepa bacteriana: Utilizar células químicamente competentes de Escherichia coli BL21(DE3) como hospedadora de expresión.
NOTA: Fueron seleccionados debido a su alta eficiencia en la transformación y su idoneidad para la producción de proteínas recombinantes. - Plásmido de expresión: Utilizar vector pET21(+) que codifica la proteína de fusión ELP-I-Cm2 con resistencia a laampicilina 9. Compra el vector plásmido de addgene. Inserta el gen Cm2 usando el sitio BsrG I al final de la inteína.
NOTA: La secuencia de ADN plasmídico para esta....
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Resultados
Tras pasar por las fases finales del protocolo, el siguiente paso es la visualización del resultado extracción-precipitación mediante análisis SDS-PAGE y tinción azul Coomassie. Cuando hay un paso de lisis antes de la extracción orgánica, debe ser visible una banda ELP prominente. En el caso de ELP-I-Cm2, esta banda aparece a 100 kDa (Figura 3A).
El cribado de diferentes combinaciones de disolventes orgánicos demostró eficiencias variables en la extracción (
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Discusión
La ITC se ha utilizado anteriormente para la purificación no cromatográfica deELP 19; sin embargo, puede ser un método que consume mucho tiempo y un proceso de bajo rendimiento. En los métodos detallados anteriormente, describimos un enfoque para la purificación rápida de una proteína de fusión ELP-I-Cm2, demostrando cómo el método de extracción-precipitación a base de disolventes orgánicos puede utilizarse eficazmente para la purificación de una amplia variedad d.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al Instituto de Investigación del Cáncer de la Universidad de Purdue y al programa NIH CCSG (CA23168) por su apoyo a este trabajo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanol | Bio-Rad | 161-0710 | Componente SDS-PAGE |
| 30% Acrilamida/Bis-acrilamida | TCI | A3218 | Componente SDS-PAGE |
| Acetona | Fisher Scientific | A949 | Disolvente orgánico |
| Acetonitrilo | Fisher Scientific | A996 | Disolvente orgánico |
| Ampicilina | Bio-Oro Biotecnología | A-301-25 | Antibiótico |
| APS (Persulfato de amonio) | Bio-Rad | 1610700 | Componente SDS-PAGE |
| Butanol | Fisher Scientific | L13171 | Disolvente orgánico |
| EDTA | Biorreactivos de Fisher | BP118-500 | Componente búfer de lisis |
| Etanol | Laboratorios de Descontaminación | UN1170 | Disolvente orgánico |
| Acetato de etilo | Fisher Scientific | E195 | Disolvente orgánico |
| Glicerol | Productos de Investigación Internacional | G22020-0.5 | Componente de medios de Terrific Broth (TB) |
| Ácido clorhídrico | Fisher Scientific | A144SI-212 | Componente búfer de lisis |
| Tinción instantánea de Coomasie | Abcam | ab119211 | Componente SDS-PAGE |
| IPTG | Bio-Oro Biotecnología | 12481C25 | Componente de expresión proteica |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A451-1 | Disolvente orgánico |
| K2HPO4 (Monobásico de fosfato de potasio) | Ciencia de los Wards | 470302-246 | Parte 2 Componente de búfer |
| KH2PO4 (Dibásico fosfato de potasio) | Ciencia de los Wards | 470302-254 | Parte 2 Componente de búfer |
| L-Proline | Productos de Investigación Internacional | P5200-500.0 | Componente de medios de Terrific Broth (TB) |
| Lisozima | Bio-Oro Biotecnología | L-040-1 | Componente búfer de lisis |
| Metanol | Fisher Scientific | A452 | Disolvente orgánico |
| Búfer de muestra nativo | Bio-Rad | 161-0738 | Componente SDS-PAGE |
| Escalera de proteínas | Bio-Oro Biotecnología | P008-500 | Componente SDS-PAGE |
| Amortiguador de gel de resolución | Bio-Rad | 1610798 | Componente SDS-PAGE |
| Sodim Dodeciil Sulfato (SDS) | Termo Científica | J18220-36 | Componente SDS-PAGE |
| Hidróxido de sodio | Fisher Scientific | S318-500 | Componente búfer de lisis |
| Buffer de gel apilado | Bio-Rad | 1610799 | Componente SDS-PAGE |
| TEMED | Bio-Rad | 1610801 | Componente SDS-PAGE |
| Tris Base | Biorreactivos de Fisher | BP-152 | Componente búfer de lisis |
| Triptona | Productos de Investigación Internacional | T60065-1000.0 | Componente de medios de Terrific Broth (TB) |
| Extracto de levadura | Productos de Investigación Internacional | Y20025-1000.0 | Componente de medios de Terrific Broth (TB) |
Referencias
- Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
- MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like ....
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Reimpresiones y permisos
