Artículo de método

Determinación de biomasa microbiana en suelo mediante PCR digital de gotas (ddPCR)

DOI:

10.3791/69467

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24 de abril de 2026

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1Geography, Faculty of Environment, Science and Economy, University of Exeter

En este artículo

Resumen

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Este estudio presenta un método rápido de ddPCR para cuantificar la biomasa microbiana del suelo y las proporciones entre hongos y bacterias. Aunque el carbono microbiano derivado de ddPCR muestra solo una correlación débil con las estimaciones de fumigación con cloroformo, el método proporciona un enfoque molecular sensible y escalable para evaluar la abundancia microbiana sin muestreos adicionales del suelo ni el uso de métodos agresivos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El suelo representa el mayor depósito terrestre de carbono orgánico, pero se han perdido más de 133 Gt de carbono en los suelos en los últimos dos siglos. La cuantificación precisa de la biomasa microbiana del suelo, especialmente hongos y bacterias, los principales descomponedores que impulsan el ciclo del carbono y nutrientes, es esencial para comprender el funcionamiento ecológico y la salud ecológica del suelo. Los enfoques convencionales, incluyendo la extracción por fumigación con cloroformo y el análisis de PLFA, están limitados por altos requisitos de muestra y las incertidumbres asociadas a la conversión de marcadores bioquímicos en estimaciones microbianas. Aquí presentamos un flujo de trabajo optimizado para cuantificar la abundancia bacteriana y fúngica en el suelo mediante PCR digital de gotas (ddPCR) dirigido a los genes 16S y 18S rRNA. El método permite la cuantificación absoluta de copias genéticas microbianas, conversión a números celulares usando factores de corrección de número de copias genéticas y la posterior estimación del carbono microbiano de biomasa. Aplicamos este protocolo a suelos de cinco sistemas agrícolas distribuidos globalmente que difieren en textura, uso del suelo y contenido de materia orgánica. Las estimaciones derivadas de ddPCR se compararon con las estimaciones convencionales de fumigación con cloroformo de biomasa microbiana de carbono. DDPCR proporcionó una cuantificación de alta resolución de la abundancia microbiana y produjo estimaciones más amplias y sensibles de las proporciones F:B entre tipos de suelo que la secuenciación del genoma completo. Aunque el MBC derivado de ddPCR mostró solo una correlación débil con los valores de fumigación con cloroformo, este método ofrece un enfoque molecular eficaz para evaluar biomasa microbiana e indicadores ecológicos como la relación F:B. Este protocolo proporciona una estrategia reproducible y escalable para integrar medidas de abundancia microbiana con análisis composicionales para avanzar en la evaluación de la salud del suelo.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El suelo es el mayor depósito terrestre de carbono orgánico, conteniendo más carbono que la vegetación y el carbono atmosféricojuntos 1. Se han perdido más de 133 gigatoneladas (Gt) de carbono en los suelos en los últimos 200 años, y los esfuerzos continuos para restaurar y mantener las reservas de carbono en el suelo son vitales para la salud globaldel suelo 2. Dada la inmensa capacidad de almacenamiento de carbono de los suelos, determinar con precisión los principales contribuyentes a estas reservas de carbono esfundamentalmente importante 3. Los microbios desempeñan un papel fundamental en el ciclo de nutrientes dentro del suelo, y la biomasa microbiana representa un componente significativo del carbono orgánico (SOC) del suelo3. Los hongos y bacterias son los principales descomponedores en los ambientes del suelo y son esenciales en los ciclos biogeoquímicos de estosecosistemas 4,5. En suelos dominados por bacterias, la descomposición de materia orgánica y la mineralización de nutrientes son mucho más rápidas que en un suelo dominado porhongos 5. La proporción hongo-bacteriano (F:B) se emplea cada vez más como indicador de la salud delsuelo 6,7; por lo tanto, es fundamental una evaluación precisa tanto de hongos como de bacterias.

Las estimaciones de biomasa microbiana en suelos suelen depender de tratamientos químicos disruptivos, como la fumigación concloroformo 8. Otros enfoques se dirigen selectivamente a la comunidad microbiana activa mediante técnicas como la respiración inducida por sustrato o el análisis de ácidos grasos fosfolípidos(PLFA) 9. El análisis PLFA se ha utilizado ampliamente para evaluar la composición de comunidades microbianas y estimar la relación F:B. Sin embargo, una variación significativa en el tamaño celular entre diferentes especies fúngicas y bacterianas introduce incertidumbre al convertir las concentraciones de PLFA en proporciones F:B basadas en biomasa o población, haciendo que estas estimaciones sean potencialmentepoco fiables 10. Otros métodos, como la citometría de flujo, pueden emplearse para aumentar el rendimiento de muestras y determinar la abundancia bacteriana en los suelos; sin embargo, su precisión puede reducirse debido a que partículas no microbianas tienen tamaño, forma y características de autofluorescencia similares a las de losmicrobios 11. La fumigación con cloroformo requiere una cantidad relativamente grande de suelo (>10 g) para estimar biomasa microbiana, mientras que un tamaño de muestra de 500 mg de suelo es suficiente para métodos basados en ADN al realizar extracciones con kits comerciales. Una comparación previa entre métodos basados en ADN y la fumigación con cloroformo mostró que, aunque ambos enfoques eran capaces de estimar biomasa microbiana, usarlos conjuntamente proporcionaba una evaluación más robusta de la biomasa microbiana delsuelo 12.

Las evaluaciones de comunidades microbianas son una métrica poco utilizada de la salud del suelo que tiene el potencial de transformar la forma en que medimos y entendemos lossuelos 13. Los enfoques de metabarcoding se utilizan convencionalmente para determinar la comunidad microbiana del suelo, con abundancias bacterianas relativas evaluadas amplificando regiones del gen rRNA 16S, mientras que los taxones fúngicos se dirigen usando el gen rRNA 18S o el espaciador interno transcrito (ITS) región 14. Los enfoques de metabarcoding para hongos pueden depender de diferentes regiones genómicas objetivo, afectando la diversidad y abundancia de las especies fúngicas identificadas. La longitud desigual de ITS entre especies fúngicas puede favorecer la amplificación y secuenciación preferencial, por lo que una estimación incorrecta de su abundancia, lo que conduce a una evaluación incorrecta de las comunidades fúngicas15. Los cebadores Fungiquant se desarrollaron para atacar regiones variables específicas dentro del gen 18S rRNA que muestran una cobertura completa de hongos diversos y especificidad en comparación con otroseucariotas 16.

La mayoría de las bacterias y hongos tienen más de una copia del gen objetivo, lo que conduce a estimaciones sesgadas del recuento celular. Además, los hongos suelen tener células multinucleadas con un número variable de núcleos por célula6. Existe una considerable variación en el número de copias del gen de ARNr tanto dentro como entre grupos taxonómicos, con un total típico de menos de 15 copias en procariotas, y se estima que oscila entre 28 y 511 en el hongo17. Debido a esta variación, las técnicas moleculares utilizadas para analizar estructuras de comunidades microbianas se consideran semicuantitativas, ya que pueden sesgar la estimación de la abundancia relativa de especies en una comunidad18. El número de copias genéticas (GCN) medido se convierte rutinariamente en abundancias celulares utilizando el promedio estimado de GCN en el grupo taxonómico deinterés 18,19,20.

Algunos estudios han utilizado enfoques metagenómicos, ya que ofrecen varias ventajas sobre el metabarding, incluyendo la eliminación del sesgo de amplificación y la capacidad de examinar de forma exhaustiva toda la comunidadmicrobiana. Además, permiten la comparación simultánea de composiciones fúngicas y bacterianas, así como de sus relaciones entresí 22. En general, la qPCR RT se emplea comúnmente para detectar el contenido microbiano y la función23. La qPCR tiene limitaciones en comparación con la PCR digital de gotas (ddPCR) para la cuantificación absoluta debido a su sensibilidad a los inhibidores, ya que requiere un estándar externo24.

La ddPCR es una tecnología revolucionaria que se basa en la partición de reacciones de amplificación individuales en gotas separadas. La plantilla se amplifica posteriormente mediante PCR en cada gota como reacción separada. La ddPCR tiene baja sensibilidad a los inhibidores enzimáticos, mejor precisión, repetibilidad, sensibilidad y estabilidad en la cuantificación bacteriana y fúngica que la qPCR25. Además, es un método que puede utilizarse para la cuantificación absoluta de bacterias y hongos en el suelo5. Dado que la ddPCR se basa en el mismo ADN extraído que se utiliza para evaluar los cambios de composición microbiana, los datos de abundancia de ddPCR pueden vincularse directamente a los datos de composiciónde comunidades 26 y utilizarse para cuantificar la biomasa microbiana del suelo.

Este estudio proporciona una metodología para cuantificar hongos y bacterias en suelos utilizando PCR digital de gotas (ddPCR). Este método optimizado se aplicó a suelos de cinco ubicaciones globales diferentes y usos del suelo. Se seleccionaron las ubicaciones de muestra para abarcar un amplio espectro de propiedades del suelo, condiciones ambientales y prácticas de manejo, permitiendo así evaluar la robustez y generalidad de nuestro enfoque en diversos entornos. Estos datos permitieron determinar la relación F:B como bioindicador molecular de la calidad ecológica del suelo. Finalmente, se realizó una comparación de la biomasa microbiana estimada entre los datos microbianos ddPCR y los métodos convencionales de fumigación con cloroformo.

Protocolo

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Un esquema general de estos protocolos se muestra en la Figura 1. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Muestreo de suelos

  1. Recoger muestras compuestas de tierra vegetal (0–20 cm) de cinco ubicaciones globales, con tres muestras de puntos seleccionados al azar dentro de un área de 25 m de cada ubicación.
    NOTA: Todas las muestras se recogieron de sistemas agrícolas representativos del uso regional del suelo en el que se encontraban. La textura del suelo se caracterizó mediante difracción láser, medida con un analizador láser de tamaño de partículas (Tabla 1). Las muestras se transportaron a temperatura ambiente y se almacenaron a 4 °C hasta un análisis posterior.

2. Extracción de ADN

NOTA: Realice la extracción de ADN utilizando un kit de extracción de ADN en suelo siguiendo las instrucciones del fabricante. La temperatura ambiente en todos los pasos fue de 20 °C.

  1. Gira brevemente el tubo de batido de 2 mL para asegurarte de que las perlas se han asentado en el fondo. Añade 100 mg de tierra y 800 μL de Solución CD1. Vórtice brevemente para mezclar.
  2. Homogeneizar las muestras a fondo utilizando un homogeneizador de molino de cuentas, con muestras lisadas durante 40 s a 6 m s−1.
  3. Centrifuga un tubo de batido de perlas para lisis mecánica de células a 15.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
  4. Transfiere el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio de 2 mL.
    NOTA: El sobrenadante puede aún contener partículas de suelo.
  5. Añade 200 μL de solución CD2 y vórtice durante 5 segundos.
  6. Centrifuga a 15.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
  7. Transfiere hasta 700 μL de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio de 2 mL, evitando el pellet. El pellet debe ser visible.
  8. Añade 600 μL de solución CD3 y vórtice durante 5 segundos.
  9. Carga 650 μL del lisato sobre una columna de spin y centrifuga a 15.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
  10. Descarta el flujo y repite el paso 2.9 para asegurarte de que todo el lisato ha pasado por la columna de espín.
  11. Coloca la columna de centrifugación en un tubo de recogida limpio de 2 mL.
  12. Añade 500 μL de solución EA a la columna de spin. Centrifuga a 15.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
  13. Descarta el filtro de paso y coloca la columna de centrifugación de nuevo en el mismo tubo de recogida de 2 mL.
  14. Añade 500 μL de Solución C5 a la columna de spin. Centrifuga a 15.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
  15. Descarta el filtro de flujo y coloca la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 mL.
  16. Centrifuga hasta 16.000 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente.
  17. Coloca la columna de centrifugación en un nuevo tubo de elución de 1,5 mL.
  18. Añadir 50–100 μL de Solución C6 al centro de la membrana blanca del filtro.
  19. Centrifugar a 15.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente. Descartar la columna de spin y guardar el eluto a -20 °C.

3. Cuantificación de ADN purificado

NOTA: El ADN purificado se cuantificó utilizando un fluorómetro y un kit de ensayo de doble cadena (dsDNA) de rango amplio (BR) siguiendo las instrucciones del fabricante.

  1. Prepara una solución funcional usando una proporción de 199:1 de tampón respecto al reactivo.
  2. Añadir 10 μL de cada patrón de ADN a 190 μL de la solución de trabajo.
  3. Añadir 1–20 μL de ADN purificado a 180–199 μL de solución de trabajo. El volumen final debe ser de 200 μL. Vórtice e incubar muestras estándar y de ADN a temperatura ambiente durante 2 minutos.
  4. Analiza los estándares antes de las muestras de ADN en el fluorómetro usando las instrucciones en pantalla.

4. Elección de la imprimación

  1. Para el análisis de microorganismos del suelo, se seleccionan cebadores específicos basándose en referencias relevantes. Para bacterias, se usaron cebadores de 16SrRNA 25,27, y para hongos, cebadores 18S deARNr 16.
  2. Realizar la amplificación utilizando la mezcla maestra PCR en tiempo real basado en colorante (qPCR) que se une al ADN y un ciclador térmico. Las secuencias de cebador se proporcionan en la Tabla 2.

5. Cuantificación microbiana usando ddPCR

  1. Deshielo y vórtice son todos reactivos sobre hielo.
  2. Configura la reacción ddPCR de la siguiente manera: 0,1 μL (10 μM) hacia adelante y 0,1 μL (10 μM) inverso cebador 16S o 18S, 10 μL ddPCR Evagreen Supermix, 0,5 ng plantilla de ADN X μL, usando agua sin nucleasa (NFW) para ajustar el volumen final de reacción a 22 μL. Crea un control negativo añadiendo NFW en lugar de la plantilla para cada columna.
  3. Coloca la DG8 en el portacartuchos.
  4. Colocar un total de 20 μL de la mezcla de reacción en los pozos de muestra del cartucho.
  5. Añade 70 μL de aceite de generación de gotas para Evagreen en el cartucho bien etiquetado como 'aceite'.
  6. Coloca el cartucho en el generador de gotas y cúbrelo con una junta.
  7. Transfiere 40 μL de las gotas generadas a una placa de 96 pozos (semifaldilla) para amplificación por PCR.
  8. Sella la placa de 96 pozos usando el sellador de placas (temperatura, 180 °C durante 5 s).
  9. Utiliza las siguientes condiciones de ciclo con una tapa calefactada ajustada a 105 °C.
    NOTA: (a) Bacterias: 98 °C durante 5 minutos, 40 ciclos de; 94 °C durante 30 s, 61 °C durante 60 s, 5 min a 4 °C, 10 min a 98 °C. (b) Hongos: 95 °C durante 5 minutos, 40 ciclos de; 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 30 s, 5 minutos a 4 °C y 5 minutos a 90 °C.
  10. Transfiere la placa de 96 pozos al lector de placas.
  11. Evalúa la concentración de copia de cada pozo usando la versión 1.2 de QuantaSoft. Ajusta el umbral de amplitud para separar las gotas negativas y positivas.
  12. Calcular el número de copias génicas por cada ng de ADN en la reacción multiplicando copias/μL por el volumen final de reacción (20 μL) y dividiendo por el ADN total de plantilla entrada en la reacción de la siguiente manera: (copias μL-1 x volumen de reacción) / ADN total aportado a la reacción.
  13. Calcular el total de copias génicas por cada ng de ADN extraído multiplicando las copias de genes por ng por el ADN total extraído (ng) de la siguiente manera: (copias de genes por ng x ADN total extraído).
  14. Calcular las copias génicas por gramo dividiendo copias génicas totales por ng de ADN extraído por la cantidad de peso seco del suelo procesado en la extracción (g), de la siguiente manera:
    Copias génicas por gramo = (Copias génicas totales por NG de ADN extraído / gramo de peso seco del suelo (GDW) del suelo procesado en la extracción).
  15. Calcula el recuento celular por GDW convirtiendo las copias génicas usando el número medio de copias génicas (GCN) siguiendo la ecuación:
    Recuento celular = copias génicas por gramo / Copias genéticas medias célula-1).
  16. Convierte los números celulares a carbono microbiano de biomasa (MBC) usando la siguiente ecuación:
    MBC para 16S (mg C g-1 suelo) = celdas gdw-1 × (100 fg célula-1) × 10−15 (g fg-1) × 103(mg g-1)28
    MBC para 18S (mg C g-1 suelo) = celdas gdw-1 × (6 fg celdas-1) x 10−12 (g fg-1) × 103 (mg g-1)29
    El proceso completo se explica en la Figura 2.
    NOTA: Se calculó y se utilizó como factor de corrección para las bacterias 20 la copia media de la copia del gen 16S rRNA (media ± SD) para 46 filos bacterianos20 , con un valor final de 2,48. Mientras que para los hongos, el número de copias del gen se calculó con un factor de corrección de 113 según Lofgren et al.17. El carbono microbiano de biomasa (MBC) se estimó a partir de los recuentos celulares derivados de ddPCR, utilizando contenidos celulares de carbono asumido de 100 fg por célulabacteriana 28 y 6 pg por célulafúngica 29.

6. Análisis molecular del suelo a partir de secuenciación del genoma completo

  1. Prepara la biblioteca de secuenciación siguiendo el protocolo Oxford Nanopore Technologies SQK-NBD114, utilizando el Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) (véase la Tabla de Materiales). Asegúrate de usar un código de barras, proporcionado en el kit, para cada muestra.
  2. Secuencia la biblioteca preparada usando una celda de flujo Oxford Nanopore Technologies R10.4.1.
  3. Realiza la llamada a bases en MinKnow durante la secuenciación seleccionando el modelo de superprecisión (SUP) y seleccionando el recorte de códigos de barras "ON". Versión Dorado: 0.7.2+9ac85c6.
  4. Realizar la clasificación taxonómica de las lecturas de secuencias de ADN usando el clasificador taxonómico Kraken2 (v2.1.3)30 frente a la base de datos de proteínas no redundantes (nr) NCBI, confianza 0,05.
  5. Revisa los archivos de informes de Kraken2 para detectar clasificaciones totales de bacterias y hongos.
  6. Calcula la abundancia relativa de bacterias y hongos para cada muestra.

7. Estimación de carbono de biomasa microbiana del suelo mediante fumigación con cloroformo

  1. Pesa muestras de tierra fresca en bandejas prepesadas y sécalas en un horno a 105 °C durante 24 horas.
  2. Calcula el contenido de humedad del suelo restando el peso seco del suelo fresco y dividiendo la diferencia entre el peso del suelo fresco.
    Contenido de humedad (%) = (W húmedo –W seco)/ Wseco) × 100
  3. Utiliza el contenido de humedad para calcular la materia seca del suelo.
    Materia seca (%) = 100 – Contenido de humedad (%)
  4. Añade 5 g de tierra a dos tubos centrífugos individuales de 50 mL, etiquetados como no fumigados y fumigados.
  5. Añadir un total de 25 mL de 0,5 MK 2SO4 al tubo etiquetado sin fumigar.
  6. Agita las muestras sin fumigar en un agitador orbital durante 1 hora a temperatura ambiente.
  7. Añade 2 mL de cloroformo sin etanol directamente al suelo en los tubos etiquetados como fumigados. Cierra y asegura las tapas con parafilm, e incuba en la oscuridad durante 24 horas a temperatura ambiente.
  8. Centrifuga la muestra sin fumigar durante 10 minutos a 2.500 x g a temperatura ambiente.
  9. Decantar el sobrenadante de la muestra sin fumigar, filtrar a través de un filtro de celulosa de 0,45 μm y almacenarlo a -20 °C.
  10. Retira las tapas de las muestras fumigadas y ventila la campana extractora durante 2 horas, luego realiza la extracción K2SO 4 (repitiendo los pasos 5-9) y almacena a -20 °C.
  11. Mide la concentración de carbono del extracto tanto para muestras 'fumigadas' como 'no fumigadas', utilizando un analizador de carbono orgánico total.
  12. Calcular el carbono microbiano de biomasa (MBC) usando la siguiente ecuación: MBC = (Contenido de C fumigado-contenido de C no fumigado)/0,45. Normalizar para suelo seco por gramo.

8. Estimación del contenido de materia orgánica en el suelo

  1. Seca un crisol de porcelana en un horno de convección a 105 °C durante 30 minutos y luego pésalo tras enfriarlo hasta 20 °C (WC).
  2. Coloca hasta 2 g de tierra en el crisol seco y vuelve a pesar.
  3. Seca las muestras de suelo en el crisol relleno en un horno de convección a 105 °C durante 24 horas.
  4. Coloca en un desecador sellado para que se enfríe y vuelva a pesar (W S).
  5. Precalienta un horno de amortiguación a 550 °C y luego coloca el crisol que contiene la tierra en el horno durante 4 horas.
  6. Retira el crisol con tierra del horno y colócalo en un desecador para que se enfríe.
  7. Pesa el crisol con tierra (WA).
  8. Mide el porcentaje de SOM calculando la diferencia en el peso seco del suelo antes y después de la incubación a 550 °C.
    SOM LOI = [(WS –W A)/(WS –W C)] × 100

Resultados

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Se recogieron muestras de suelo en cinco ubicaciones y el contenido de materia orgánica del suelo se determinó por pérdida por inflamación. El contenido de materia orgánica en el suelo varió entre el 3,38 % y el 10,34 % en cada uno de los suelos utilizados en el estudio (Tabla 1). Se realizaron extracciones de ADN en cada muestra de suelo en triplicado, con rendimientos de ADN resultantes que oscilaron entre 32 ng y 4.590 ng por gramo de suelo seco (Figura 3A).

La concentración de ADN difería significativamente entre suelos con contenido variable de materia orgánica (ANOVA unidireccional p < 0,0001, R2=0,97). El suelo con menor contenido de materia orgánica, el suelo A, no mostró la menor concentración de ADN. Sin embargo, el suelo E, que tenía el mayor contenido de materia orgánica, tenía una concentración significativamente mayor de ADN de todos los demás suelos (A–D, p < 0,0001), mientras que el suelo B tenía el menor, diferiendo significativamente de A y D (p < 0,05). El protocolo ddPCR se realizó sobre ADN purificado de cada una de las muestras de suelo utilizando los cebadores del gen rRNA 16S y 18S. El número de copias génicas por gramo de peso seco de suelo para cada uno de los genes 16S (Figura 3B) y 18S rRNA (Figura 3C) se determinó usando la ddPCR. En todas las muestras de suelo, hubo menos copias del gen 18S rRNA que del gen 16S rRNA. Las pruebas post-hoc de Tukey revelaron que el suelo B tenía menos copias del gen 16S y 18S rRNA, con una media de 8,8 x 107 y 4,6 x 106 gens, respectivamente, por gramo de suelo seco. El suelo E difería significativamente de todos los demás suelos y mostró el mayor número de copias del gen 16S y 18S del ARNr, con copias de 4,4 x 109 y 2,5 x 10 de9 , respectivamente, por gramo de suelo seco. Las copias fúngicas en los suelos A–D no diferían significativamente entre sí, mientras que las copias bacterianas en el suelo D diferían significativamente de las del suelo B y E.

Se empleó la secuenciación shotgun del genoma completo (WGS) en ADN purificado de cada muestra de suelo, y se realizaron clasificaciones taxonómicas usando Kraken2 en comparación con la base de datos nr NCBI. El número total de lecturas de secuencias de ADN clasificadas contra bacterias y hongos se utilizó para calcular la proporción hongo:bacteriana (F:B) para cada suelo y comparada con las proporciones hongo:bacterianas calculadas a partir del número de copias genéticas estimadas por ddPCR (Figura suplementaria 1). Los valores de la relación F:B obtenidos con ddPCR oscilaron entre 0,022 y 0,66 en todas las muestras de suelo y fueron superiores a los obtenidos mediante secuenciación del genoma completo. El mayor promedio F:B se observó en el suelo E, con un F:B de 0,56 para ddPCR y 0,038 para los métodos WGS. Además, se identificó un rango más amplio de valores F:B en las muestras de suelo usando ddPCR en lugar de WGS. Además, se observó una correlación positiva entre la relación F:B determinada por el método ddPCR y los datos WGS (r = 0,59, R2 = 0,35, p = 0,019), como se muestra en la Figura Suplementaria 1.

Se utilizó un número medio de copias génicas para bacterias y hongos para convertir copias génicas calculadas en el número de bacterias y células de hongo en las muestras originadoras (Figura suplementaria 2). Estos datos se combinaron para estimar el número total de células microbianas en el suelo (Figura 3D) y diferían significativamente entre suelos (ANOVA unidireccional p < 0,0001). El análisis comparativo por pares de Tukey mostró que el mayor contenido microbiano se observó en el suelo E, mientras que el contenido microbiano más bajo se encontró en muestras recogidas del suelo B, difiriendo significativamente de A, D y E.

Se realizó fumigación con cloroformo en cada muestra de suelo en triplicado para estimar el carbono total de biomasa microbiana (MBC) en cada muestra (Figura 4A). Se identificaron entre 3,6 y 9,6 mg de carbono por gramo de suelo seco en los suelos utilizados, sin observar diferencias significativas entre cada una de las muestras (ANOVA unidireccional p = 0,266). Se utilizó un contenido medio de carbono para células bacterianas y fúngicas para convertir el número de células microbianas estimado por ddPCR en un carbono total de biomasa microbiana estimado. Estas estimaciones derivadas de ddPCR se compararon con el método de fumigación con cloroformo (Figura 4B). Para evaluar la relación entre el MBC medido por fumigación con cloroformo y el método ddPCR, se realizó una correlación de Pearson (n = 15). Se encontró una correlación positiva entre ambos métodos (r = 0,43, R2 = 0,18, valor p = 0,05). Los valores atípicos del suelo E, caracterizados por el mayor contenido de materia orgánica, probablemente contribuyeron de manera desproporcionada a este resultado marginalmente significativo (Figura 4B).

figure-results-1
Figura 1: Una visión general del procesamiento de muestras de suelo. La figura ilustra los métodos moleculares que utilizan ADN del suelo para cuantificación microbiana y los métodos convencionales para medir biomasa microbiana, carbono y materia orgánica del suelo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Diagrama de flujo del proceso de conteo celular desde las copias ddPCR tanto para 16S como para 18S, hasta la estimación final de carbono microbiano de biomasa, mostrando los pasos 5.11–5.16 del protocolo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Cuantificación microbiana de suelos. (A) La concentración media de ADN purificada de cada una de las muestras de suelo. (B) Número total medio de copias del gen 16S rRNA por gramo de peso seco de suelo usando ddPCR. (C) Número medio total de copias del gen de 18S rRNA por gramo de peso seco de suelo usando ddPCR. (D) Número total medio de células microbianas por gramo de peso seco en muestras de suelo. Todas las barras de error muestran el error estándar de la media. Se realizó una ANOVA unidireccional y una posterior prueba post-hoc de Tukey para comparaciones por pares, y las diferencias significativas se muestran usando una visualización compacta con letras (umbral de significación = 0,05). Las muestras se ordenan de porcentaje OM más bajo a mayor Origen del suelo (OM%) A: Países Bajos (3,38), B: Irak (5,14), C: China (6,41), D: Reino Unido (8,19) y E: Reino Unido (10,34). Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Biomasa microbiana de carbono medida por extracción por fumigación con cloroformo y estimaciones celulares basadas en genes. (A) MBC extraído por fumigación con cloroformo, organizado desde un contenido bajo hasta alto de materia orgánica. Las barras de error muestran el error estándar de la media. Se realizó una ANOVA unidireccional y posterior prueba post-hoc de Tukey para comparaciones por pares, y las diferencias significativas se muestran usando una visualización compacta de letras (umbral de significancia = 0,05). (B) MBC estimado a partir de la abundancia celular (célula gdw -1) derivado del número de copias del gen ddPCR y convertido en carbono biomasa, graficado contra materia orgánica total para la misma muestra. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

EjemploOrigen del suelopHPorcentaje de contenido de humedadMateria orgánica%TexturaUso del suelo
ATexel, Países Bajos7.1619.043.38Tierra arenosaHorticultura
BNajaf, Irak7.588.335.14Tierra limosaArroz
CJiangxi, China4.118.456.41Tierra limosaSésamo/Colza
DCambridge, Reino Unido6.8121.88.19Tierra limosaTrigo
EExeter, Reino Unido5.4420.2710.34Tierra limosaPraderas

Tabla 1: Propiedades fisioquímicas y características de uso del suelo de cinco muestras de suelo (A–E), para la determinación de biomasa microbiana.

ObjetivoBPAdelanteReversoReferencia
ARNr 16S1805′- ACTCCTACGGGGGGAGAGCAG5′- ATTACCGCGGCTGCTGG(Le Geay et al., 2024; Ovreås et al., 1997)
18S rRNA3515′-GGRAAACTCACCAGGTCCAG5′-GSWCTATCCCCAKCACGA(Liu et al., 2012)

Tabla 2: Pares de cebadores seleccionados para dirigirse al gen 16S y 18S rRNA usando la ddPCR.

Figura suplementaria 1: Una correlación entre la proporción F:B para todas las muestras de suelo, determinada por el método ddPCR y WGS. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Número de células en diferentes muestras de suelo medidas mediante el método ddPCR dirigidas a: (A) bacterias; y (B) hongos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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Los microbios del suelo son los principales descomponedores en los ecosistemas terrestres y desempeñan un papel esencial en el ciclo de nutrientes y como almacenamiento de carbono en el suelo. A pesar de la importancia de los microbios del suelo, cuantificar con precisión su abundancia absoluta mediante métodos basados en copias genéticas es un desafío. Esto se debe a muchos factores, como el número variable de genes objetivo en diferentes especies. Este estudio demuestra cómo la biomasa microbiana del suelo puede cuantificarse usando ddPCR dirigiéndose a procariotas y eucariotas utilizando las respectivas regiones codificantes de genes de ARNr 16S y 18S. Se observó la mayor proporción F:B en el suelo E, donde esta muestra también tenía el mayor porcentaje de materia orgánica. La segunda mayor proporción F:B se observó en la muestra C, que correlacionó con la alta acidez de estos suelos. Esto se esperaba para las muestras C y E, ya que el crecimiento fúngico aumenta con un pH másbajo de 31. Se realizó la secuenciación del genoma completo en los mismos extractos de ADN usados en los métodos ddPCR. Se comparó la relación F:B entre WGS y ddPCR. La relación F:B calculada a partir de los datos de WGS fue menor para todas las muestras analizadas en comparación con la relación F:B calculada a partir de datos de ddPCR. Sin embargo, la tendencia general de la relación F:B entre las muestras fue visualmente comparable entre ambos métodos. Esto produjo proporciones F:B más altas en muestras de suelo en comparación con la secuenciación del genoma completo y demostró una mayor variabilidad de la relación F:B entre diferentes tipos de suelo. La menor relación F:B observada en los datos de WGS probablemente se debe a las diferencias en el tamaño del genoma entre hongos y bacterias, y las secuencias fúngicas pueden estar infrarrepresentadas sin elenriquecimiento 32. Además, a pesar de que el suelo A tiene el menor contenido de materia orgánica, no mostró el menor número de copias microbianas ni de carbono microbiano, lo que pone de manifiesto en evidencia que el contenido de materia orgánica no siempre está directamente correlacionado con la biomasa microbiana. Cabe destacar que las tendencias observadas entre la concentración de ADN originario (Figura 3A) y las células microbianas totales (Figura 3D) fueron visualmente similares, lo que sugiere que la concentración de ADN es un buen indicador de la biomasa microbiana.

ddPCR permite cuantificar con precisión el número de copias de genes dentro de muestras de suelo, y este método puede emplearse para estimar el total de células microbianas. Sin embargo, existen limitaciones que deben considerarse. El número de copias de los genes de ARNr 16S y 18S varía mucho entre los taxonesmicrobianos 23. Como resultado, usar un único factor de corrección para el número de copias de genes puede llevar a una sobreestimación o subestimación de la abundancia microbiana en una muestra33. Esta limitación puede abordarse incorporando conocimientos previos de la comunidadmicrobiana 18, utilizando datos de secuenciación del genoma completo y aplicando correcciones adecuadas del número de copias genéticas que sean representativas de la microbiota específica del suelo. Aunque los métodos moleculares siguen proporcionando una estimación en lugar de un recuento exacto, ofrecen una predicción más precisa de la abundancia microbiana. Cuando se combina con los datos de composición de la comunidad, este enfoque permite interpretaciones que van más allá de la abundancia relativa por sí sola19,34.

El carbono de biomasa microbiana (MBC), estimado mediante fumigación con cloroformo, no mostró diferencias significativas entre las muestras analizadas, aunque se observaron altos grados de variación en MBC entre las muestras A–D. En contraste, se detectaron diferencias significativas en el recuento total de células microbianas medido mediante el método ddPCR, lo que indica que este enfoque molecular puede proporcionar una mayor resolución que las técnicas convencionales. Sin embargo, calcular el carbono microbiano de biomasa a partir de números celulares microbianos tiene sus propias limitaciones. La variabilidad en el tamaño celular puede influir en la conversión de los recuentos celulares a biomasa. De forma similar al uso de un único factor de conversión para el número de copias genéticas, usar un solo factor de conversión para el contenido de carbono bacteriano y fúngico puede llevar a una sobreestimación o subestimación del carbono microbiano de biomasa.

Además, los métodos basados en ADN pueden ser especialmente problemáticos en comparación con suelos que muestran grandes diferencias en el grado de dominancia entre bacterias y hongos. Tanto el rendimiento de ADN como el GCN también pueden verse afectados por la elección del método de extracción de ADN y el diseño delcebador 35,36, lo que dificulta las comparaciones entrelaboratorios 37. Además, tanto los métodos de GCN como los de producción de ADN pueden ser vulnerables a la sobreestimación debido al llamado "ADN reliquia", es decir, ADN en organismos muertos o unido aarcillas 14,38. Aunque los métodos ddPCR han mostrado mejor precisión y repetibilidad, algunas desventajas incluyen sus procesos complicados, altos costes y el uso de tintes de ADN inespecíficos al usar la químicaEvagreen 5. Esto puede generar falsos positivos débiles, dificultando la separación de gotas positivas de negativas, y un pequeño error en el umbral podría afectar a la proporción F:B cuando las copias genéticas están en14 segundos. Para aumentar el número de muestras que pueden procesarse usando este método ddPCR, se puede emplear automatización con robótica de manipulación de líquidos para extracciones de ADN y preparaciónde reacción 39. Además, el nuevo sistema ddPCR permite una mayor multiplexación, generando gotas para 96 muestras simultáneamente.

Es importante señalar que todas las mediciones de biomasa microbiana son estimaciones e implican factores de conversión generalizados para determinar los números37. Por lo tanto, las comparaciones entre métodos deben realizarse con precaución, ya que se desconoce cuáles son los más precisos. A pesar de ello, los métodos de fumigación y extracción con cloroformo se han utilizado ampliamente en las últimas décadas, basándose en vapores de cloroformo para fumigar el suelo. Esto ha generado muchas preocupaciones debido a su toxicidad para los humanos y el medio ambiente, así como su eficacia para lisar células microbianasdel suelo 40. Además, la fumigación con cloroformo puede llevar a una sobreestimación de los MBC producidos a partir de fuentes no vivas, como el residuovegetal 41. Finalmente, este método también se basa en cantidades relativamente grandes de suelo en comparación con otros métodos moleculares que requieren cantidades muy bajas de suelo (<500 mg).

Este estudio aporta evidencia de que los métodos basados en ddPCR para medir la biomasa microbiana del suelo en una variedad de suelos son robustos y no están afectados por diferentes tipos de suelo ni posibles inhibidores. El éxito de este método se ve afectado por la muestra de ADN originaria y, por tanto, es vital asegurar una purificación efectiva del ADN a partir de las muestras. Este método muestra potencial para la detección y cuantificación microbiana en diversos tipos y texturas de suelo, complementando los métodos existentes para la estimación de biomasa microbiana y permitiendo aplicaciones futuras valiosas en el monitoreo de la salud y escalabilidad del suelo para la vigilancia regional o global del microbioma.

Divulgaciones

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Los autores declaran no haber conflictos de interés.

Agradecimientos

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Agradecemos a la Dra. Nina Lindstrom-Friggens, la Dra. Liz Cressey, la Dra. Joanna Zaragoza-Castells, Angela Elliott, el Dr. Kees Jan van Groenigen y el Prof. Iain Hartley. También queremos agradecer a los propietarios de la tierra por proporcionar los suelos para este estudio. Esta investigación fue financiada por Shell Research Ltd (CW648947-PT34767). Los conjuntos de datos generados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio NCBI Sequence Read Archive PRJNA1305539.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bettersizer S3 Plus Bettersize, ChinaBT-803
CentrifugadoraTermociencia SL16 
Cloroformo ThermoScientificL14759. AU 
Placas ddPCR de 96 pozosBio-Rad, Watford, Reino Unido12001925
ddPCR Aceite para lector de gotas  Bio-Rad, Watford, Reino Unido1863004
Dessecador Davisil
Portacartuchos DG8Bio-Rad, Watford, Reino Unido1863051
Cartuchos DG8 para generador de gotas QX200/QX100Bio-Rad, Watford, Reino Unido1864008
Juntas DG8 para generador de gotas QX200/QX100Bio-Rad, Watford, Reino UnidoP33265
DNeasy Power Soil pro kit & nbsp;Qiagen, Alemania47017
Kit de ensayo de doble cadena (dsDNA) de gran alcance (BR)Invitrogen, AlemaniaP33230
FastPrep-24 5G MP Biomédicas, Reino Unido116005500
GridION Oxford Nanopore Technologies, Reino UnidoGRD-MK1CAPX
K2SO4Merck, Reino Unido7778-80-5
Cuentas magnéticas Mag-BindOmega Bio-tek, EE. UU.M1378-01
Celda de flujo MinIONOxford Nanopore Technologies, Reino UnidoFLO-MIN114
Horno amortiguadoCarbolite AAF1100
Kit nativo de codificación de barras 24Oxford Nanopore Technologies, Reino UnidoSQK-NBD114.24
Sellado térmico de placa PCR, papel de aluminio, perforable y nbsp;Bio-Rad, Watford, Reino Unido1814040
Sellador de placas PCR PX1Bio-Rad, Watford, Reino Unido1814000
Fluorómetro de QubitsInvitrogen, AlemaniaP33226
Sistema de PCR Digital de Gotas QX200Bio-Rad, Watford, Reino Unido1864001
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-Rad, Watford, Reino Unido186-4033
Aceite de generación de gotas QX200 para EvaGreen y nbsp;Bio-Rad, Watford, Reino Unido1864005
QXDx Generador de Gotas  Bio-Rad, Watford, Reino Unido12001049
SENSOQUEST LABCYCLER Geneflow, Alemania1120280125

Referencias

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