Imagen de calcio basada en fluorescencia en cultivos epiteliales de las vías respiratorias primarias humanas utilizando segmentación celular automatizada

Resumen

La imagen de la señalización de calcio por células vivas se utiliza extensamente para estudiar la movilización de calcio en líneas celulares estables cultivadas en monocapas. Este protocolo describe la imagen de fluorescencia de la señalización de calcio mediante colorantes de células vivas en tejido primario complejo, y también utiliza software de aprendizaje automático para cuantificar simultáneamente la intensidad de fluorescencia de miles de células individuales, agilizando así los análisis.

Resumen

La señalización de calcio es fundamental en multitud de procesos biológicos, lo que refuerza la necesidad de desarrollar métodos para estudiar el flujo de calcio en el tejido primario. El estudio de la señalización de calcio a resolución unicelular en cultivos epiteliales primarios complejos es desafiante y, por tanto, sigue siendo poco estudiado. Este estudio presenta métodos adaptados para monitorizar la señalización de calcio vivo en cultivos epiteliales primarios de las vías respiratorias y enfoques novedosos para análisis basados en aprendizaje automático. Utilizando cultivos epiteliales primarios de las vías respiratorias derivados del paciente, diferenciados en ALI (interfaz aire-líquido) cargados con un colorante indicador fluorescente extrínseco, se midió la movilización de calcio a resolución de célula única mediante un microscopio epifluorescente. Desarrollamos un software novedoso que utiliza la segmentación celular basada en aprendizaje automático para asignar intensidades de fluorescencia a células distintas a lo largo del tiempo. En general, el sistema de imagen adaptado y el software permiten un enfoque rápido y sesgado para analizar células individuales dentro de los cultivos epiteliales primarios. El protocolo paso a paso presentado aquí permitirá el estudio futuro del calcio en células individuales y tipos celulares que conforman los cultivos epiteliales primarios.

Introducción

Los cambios en la movilización intracelular del calcio dictan una amplia variedad de procesos celulares, incluyendo cambios en la expresión génica y la modulación de las respuestas inmunitarias^innatas. Los niveles intracelulares de calcio pueden alterarse mediante la liberación de reservas intracelulares de calcio, como el retículo endoplásmico y las mitocondrias ^1,2,3. La entrada extracelular de calcio en el espacio intracelular también puede alterar el calcio citosólico tanto mediante transporte pasivo como^{activo 2}. La imagen de células vivas de la movilización de calcio se analiza principalmente mediante colorantes intracelulares o colorantes codificados genéticamente, GCaMP (Multimer/Proteína activada por calcio verde⁾⁴. Comunes en la literatura son los tintes conjugados con AM (acetoximetil), que permiten que el tinte penetre en la membrana^plasmática 5,6,7,8. Al entrar en la célula, la mitad AM es escindida por esterasas intracelulares endógenas, y el colorante adquiere una carga negativa, lo que lo atrapa en el espacio^{citosólico 9}. Debido a esta carga adquirida, el tinte puede ser bombeado por canales aniónicos orgánicos residentes en la membrana plasmática. Por ello, se añade probenecido, un inhibidor de los transportadores de eflujo de aniones orgánicos, para prevenir el flujo celular del colorante y retener la señal citosólica^{óptima 10,11}. Los estudios emplean comúnmente Fura-2 AM, un colorante ratiométrico, y Fluo-4AM, un colorante intensitométrico, para analizar la señalización de calcio en líneas celulares estables cultivadas en una monocapa. Este estudio emplea un protocolo adaptado para la imagen epifluorescente de cultivos multicapa cultivados en la interfaz aire-líquido utilizando el colorante calcio intensitométrico recientemente desarrollado, Cal-520 AM, que tiene una sensibilidad aumentada en comparación con Fluo-4 AM. Por tanto, es adecuado visualizar de forma robusta señales sutiles a una sola resolución celular a partir de cultivos epiteliales primarios complejos. La literatura actual es rica en imágenes de calcio vivo de respuestas masivas de líneas celulares estables. Sin embargo, ahora se sabe comúnmente que in vivo, los tejidos constituyen un paisaje celular diverso que sostiene diferentes roles específicos de cada tipo celular en el mantenimiento de la homeostasis^tisular 12,13,14,15. A pesar de este conocimiento común, los mecanismos por los cuales distintos tipos celulares coordinan señales de calcio y regulan la homeostasis de los iones calcio siguen siendo desconocidos. Por lo tanto, los métodos aquí presentados permitirán la detección unicelular de la señalización de calcio y aumentarán el rendimiento de análisis aguas abajo en tejidos primarios de las vías respiratorias.

Estamos aprovechando nuestros modelos de cultivo epitelial primario previamente publicados y rigurosamente validados del epitelio nasal humano como herramienta para obtener imágenes de calcio citosólico de células vivas en un modelo biológicamente^{más relevante} 16,17,18. En resumen, las células epiteliales se aíslan de los cepillos nasales del paciente y se cultivan sobre una membrana semipermeable de un transwell, que está suspendida dentro de un pozo de cultivo para mantener una interfaz aire-líquido (ALI). Esta interfaz, junto con medios especializados, ha sido rigurosamente probada mediante técnicas ortogonales para detectar la presencia de diferentes tipos^celulares 16,17,18. Además, se ha demostrado que los métodos actuales se pueden trasladar a cultivos bronquiales primarios que se cultivan de manera similar a nuestros cultivos nasales^{primarios 19}.

Este artículo presenta un método adaptado para medir y analizar la señalización de calcio vivo a una resolución unicelular en estos cultivos epiteliales de las vías respiratorias primarias. Estas culturas multicapa son difíciles de visualizar mediante microscopía; Sin embargo, la configuración actual nos permite centrarnos de forma fiable en capas individuales dentro de los cultivos multicapa, lo que nos permite detectar la movilización de calcio de estas capas específicas. Este sistema tiene varias ventajas, ya que no requiere un sistema de perfusión, que a menudo es costoso y difícil de adaptar a menos que se empleen microscopios especializados. Se ha empleado la microscopía de epifluorescencia, que ofrece una mejor resolución temporal en comparación con la imagen confocal. El uso de diodos emisores de luz (LED) minimiza la fototoxicidad en comparación con los sistemas confocales basados en láser. Se utilizan tintes intensiométricos extrínsecos en el protocolo presentado aquí, ya que permiten cambios rápidos y relativos en el calcio en toda la población celular y son compatibles con la mayoría de los sistemas de microscopía de fluorescencia. Esto es beneficioso frente a los tintes ratiométricos comunes, que requieren excitación ultravioleta profunda (UV) que no está disponible en muchos microscopios. Además, GCaMP requiere transfección o transducción, lo que fortalece la técnica para una imagen de calcio más dirigida en tipos celulares específicos. Debido a la baja transducción y eficiencias de transfección en cultivos epiteliales primarios, la técnica es poco adecuada para monitorizar toda la población celular.

Además, este estudio desarrolló un software novedoso y especializado basado en aprendizaje automático que permite la segmentación de células individuales basada en tinción nuclear en vivo. El software es capaz de registrar los valores de intensidad de fluorescencia de cada célula a lo largo del tiempo. Inicialmente se empleó una línea celular epitelial estable (Calu-3) para la optimización del método. Luego, estos métodos se tradujeron para estudiar la movilización de calcio unicelular en cultivos epiteliales primarios. Se optimizaron variables como la concentración del tinte de calcio y del probenecido, el momento de los pasos de incubación, así como el montaje de imagen. Aquí, la señalización de calcio se registra a una tasa de 0,2 fps (fotogramas por segundo), lo cual es adecuado para monitorizar la señalización de calcio. La tasa de fotogramas puede aumentarse para medir transitorios de calcio más^{rápidos 20}. A continuación, se aplicaron las variables óptimas y se optimizaron aún más en cultivos nasales primarios más complejos.

Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Mantenimiento y cultivo de células Calu-3

1. Mantener las células de Calu-3 en frascos de T-25 en medios de cultivo EMEM suplementados con 20% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina. Precalienta el sustrato y cámbialo en días alternos (5 mL/cantimplora).
2. Cuando las células estén confluyentes en un 70% en el matraz, aspira el medio en el matraz.
3. Lava el matraz con 5 mL de solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS).
4. Añade 1 mL de Triple directamente a las células durante 10-15 minutos a 37 °C, 5% de CO₂. Asegúrate de que todas las células se hayan desprendido del fondo del frasco y estén disociadas en una suspensión de célula única.
5. Neutraliza la reacción con 4 mL de medio de cultivo fresco (paso 1.1), luego mezcla bien las células con una pipeta serológica para asegurar una siembra uniforme.
6. Placar las celdas sobre una placa de 96 pozos en una confluencia del 90%-100% (aproximadamente 40.000 celdas/pozo).
   1. Para sembrar pozos, añade 200 μL/pozo de suspensión de celdas bien mezcladas.
   2. Permite que las celdas se adhieran a la placa de 96 pozos durante la noche.
7. Cambia el medio cada día (200 μL/pozo) hasta que esté listo para los experimentos.
8. Permite que entre 2 y 5 días después de la confluencia dentro de los pozos comience la experimentación antes de realizar experimentos para permitir la diferenciación.

2. Protocolo para cargar celdas Calu-3 con Cal 520 AM o Fluo-4 AM

PRECAUCIÓN: Fluo-4 AM y Cal-520 AM se disuelven en DMSO, lo cual se considera peligroso. Probenecid está catalogado como un peligro agudo. Por favor, llevad guantes y bata de laboratorio al manipular productos químicos para evitar el contacto con la piel. Elimina todos los productos químicos en los contenedores de residuos químicos designados.

1. El día del experimento, retirar el medio de los pozos pipeteando y lavar las células dos veces (200 μL/pozo) en un tampón de calcio precalentado (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM_{MgCl 2} 2 mM_{CaCl 2 y} 10 mM Hepes, ajustados a pH 7,38 (NaOH) 291 mOsm), para eliminar las células muertas.
2. Incubar células con 200 μL/pozo de un cóctel de 3 μM Cal-520 AM, 2,5 mM de probenecida y tinción nuclear Hoechst 1:5000 en tampón de calcio (paso 2.1) durante 1 hora en una incubadora fijada a 37°C y 5% de CO₂.
   1. Para experimentos de Fluo-4 AM, incubar células con 200 μL/pozo de un cóctel de 3 μM Fluo-4 AM, 2,5 mM de probenecida y tinción nuclear Hoechst 1:5000 en tampón de calcio (paso 2.1) durante 1 hora a 37 °C y 5% de CO₂.
      NOTA: Mantén los tubos de tinte en la oscuridad cubriéndolos con papel de aluminio.
3. Durante la incubación, prepara la thapsigargin en un tampón de calcio (paso 2.1). Ajusta las concentraciones intermedias de stock para asegurar las concentraciones finales adecuadas dentro del pozo.
   NOTA: Aquí se añaden 50 μL de fármaco a 100 μL del tampón de calcio existente. Por ello, se preparó un stock intermedio 3x de 6 μM.
4. Después de 1 hora, aspira el contraste pipeteando y elimina el contraste extracelular con tampón de calcio (paso 2.1) dos veces (200 μL/pozo).
5. Tras los lavados, añadir 100 μL/pozo de probenecido de 2,5 mM diluido en tampón de calcio (paso 2.1) para mantener el tinte en el espacio citoplasmático.
6. Envuelve la placa en papel de aluminio para protegerla de la luz. Las células ya están listas para obtener imagen.

3. Preparación de la microscopía para la línea celular estable Calu-3

1. Utilizando el microscopio de epifluorescencia equipado con un objetivo SuperFluor, una fuente de luz estable de estado sólido y una cámara de fluorescencia CMOS (tamaño de píxel de 6,5 μm). La intensidad de iluminación está fijada en 500 mW.
2. Coloca la placa de celdas en la etapa usando el adaptador de placa de 96 pozos. Usando Brightfield, enfoca la capa celular a baja magnificación para encontrar la monocapa de celdas (usa 5-10 veces el objetivo de aire).
   NOTA: Este paso es opcional, pero útil para obtener un enfoque inicial en la capa celular de forma eficiente.
3. Una vez identificada la capa celular, usa Campo Claro y cambia a una mayor ampliación (objetivo de aire 20x) y vuelve a enfocar en la capa celular.
   NOTA: Asegúrate de enfocar correctamente la monocapa con campo claro; Los límites de las celdas deben estar claros.
4. Identifica la señal del tinte de calcio usando la GFP (LED de 475 nm). Asegúrate de que la potencia del LED esté entre el 5% y el 10% para evitar el fotoblanqueo, y el tiempo de exposición es adecuado para visualizar la señal verde base sin saturar la señal, normalmente entre 300 y 500 ms.
   NOTA: Para asegurar la reproducibilidad e incluso la carga de colorantes, analizar cualitativamente la capa celular; La mayoría de las celdas deberían mostrar el mismo brillo. Concéntrate en campos de visión con pocas células muertas, que fluorescen intensamente antes de añadir cualquier estimulante. La intensidad relativa de fluorescencia de base puede medirse usando Fiyi (paso 7.9). La variación basal de fluorescencia entre células debería estar cerca del 10%-15% si el tinte se ha cargado de forma uniforme (paso 7.9).
5. Identifica el tinte nuclear Hoechst usando el LED DAPI (405 nm). La potencia del LED debería estar entre el 2% y el 5%, con un tiempo de exposición entre 50 y 100 ms.
   NOTA: Si las células están enfocadas, los núcleos deben aparecer con contornos nítidos. Asegúrate de que la señal nuclear no alcance la saturación, ya que los núcleos pueden interferir con el canal verde.

4. Adquisición de vídeo de calcio en vivo

1. Empieza un vídeo en directo usando un intervalo de 1 fotograma cada 5 s (0,2 fps) durante 10 minutos.
   NOTA: Captura cada canal fluorescente (DAPI 405 nm y GFP 475 nm) en cada fotograma.
2. Una vez que el vídeo haya comenzado, deja una lectura de referencia de 5 minutos antes de añadir agonistas.
3. Utilizando una pipeta P200, añade 50 μL de thapsigargin en un stock intermedio 3x al pozo que contiene 100 μL de 2,5 mM de probenecida en tampón de calcio (paso 2.1). Resuspende suavemente 1-2 veces dentro del pozo para asegurar que el fármaco se distribuya de forma uniforme. Sigue leyendo durante 5 minutos tras la incorporación del thapsigargin.
   NOTA: El paso de adición de fármacos es fundamental; La punta de la pipeta no debe tocar la placa para desplazar el plano de enfoque. En su lugar, flota la punta de la pipeta para que solo contacte con el amortiguador dentro del pozo. Si los fármacos se mezclan con demasiada intensidad, las células pueden desprenderse de la placa e interferir con la señal.
   NOTA: Asegúrese de tomar nota del marco en el que se añade el fármaco para el análisis posterior.
4. Guarda el vídeo y la instantánea tomadas antes del experimento. Procede al análisis de datos.

5. Protocolo para cargar celdas primarias de las vías respiratorias con Cal 520 AM o Fluo-4 AM

1. El día del experimento, retirar el medio basolateral del pozo trans y lavar dos veces los lados apical y basolateral del inserto utilizando 750 μL de basolateral y 300 μL apical del tampón de calcio (paso 2.1).
2. Incubar las células con 600 μL de basolateral y 200 μL apical de los tintes Cal-520 AM o Fluo-4 AM durante 1 hora a 37 °C y 5% de CO₂. Preparar el colorante de la misma manera que para las células Calu-3, para Cal-520 AM, 3 μM Cal-520 AM, 2,5 mM de probenecida y 1:5000 de Hoechst en tampón de calcio (paso 2.1). Para Fluo-4 AM, 3 μM de Fluo-4 AM, 2,5 mM de probenecida y 1:5000 de Hoechst en el mismo tampón de calcio.
3. Durante el periodo de incubación, preparar la thapsigargin en un stock intermedio de 3× para una concentración final de 2 μM (stock intermedio de 6 μM).
4. Después, aspira el tinte y lava las células dos veces con 300 μL apical y 750 μL de tampón basolateral que contiene calcio (paso 2.1).
5. Tras lavados, añade 100 μL de apical y 500 μL de basolateral de 2,5 mM de probenecido en tampón de calcio (paso 2.1).
6. Manteniendo la transmisión bien dentro de la placa, envuélvela en papel de aluminio. Las células ya están listas para la imagen.

6. Montaje de la microscopía para las inserciones nasales primarias

1. Consigue una placa de Petri con fondo de cristal adecuada para imagen, pinzas y cinta fina de enmascarar. Asegúrate de que la placa de Petri esté limpia limpiándola rápidamente con etanol al 70% y dejando que se seque completamente.
2. Coloque la placa de Petri con fondo de cristal dentro del pequeño adaptador circular para el microscopio de epifluorescencia.
3. Con una pinza, coloca cuidadosamente el inserto en el centro del recipiente con fondo de cristal.
   NOTA: Ten cuidado de no derramar el amortiguador, que está situado en el compartimento apical del inserto.
4. Para asegurarte de que el inserto no se mueva durante la adición de medicamentos, utiliza cinta de enmascarar para asegurar la parte superior del plástico del inserto a los laterales del plato de cristal.
5. Coloca el adaptador con el inserto acoplado al escenario del microscopio y comienza enfocando las células usando el objetivo de campo claro de aire 10x.
6. Identifica la señal del tinte de calcio usando el GFP (LED de 475nm). Asegúrate de que la potencia del LED esté entre el 5% y el 10% para evitar el fotoblanqueo, y que el tiempo de exposición sea adecuado para visualizar la señal verde base sin saturarla, normalmente entre 300 y 500 ms.
   NOTA: Por favor, consulte la NOTA en el paso 3.4 para asegurar una carga adecuada de tintes de calcio.
7. Identifica el tinte nuclear Hoechst usando el LED DAPI (405 nm). La potencia del LED debería estar entre el 2% y el 5%, con un tiempo de exposición entre 50 y 100 ms.
   NOTA: Si las células están enfocadas, los núcleos deben aparecer con contornos claros y definidos. Concéntrate en la capa más apical de las células. Ajusta el eje z del microscopio para identificar el plano focal más alto donde las células permanecen en enfoque nítido. Asegúrate de que los núcleos no alcancen la saturación de la señal, ya que la señal nuclear puede interferir con el canal verde.
8. Para obtener el vídeo en directo sobre el calcio, sigue los pasos 5.1-5.4. Durante el paso de adición del fármaco, añade en el centro del inserto y vuelve a suspender lentamente usando una pipeta P200.
   NOTA: Asegúrese de tomar nota del marco en el que se añade el fármaco para el análisis posterior.

7. Análisis utilizando el software de Fiyi

1. Abre la aplicación Fiji y selecciona Archivo \ Abrir, sube el archivo de vídeo y, en la ventana emergente resultante, mantén todos los ajustes por defecto.
2. Si lo deseas, en Imagen \ Ajustar \ Brillo/Contraste, modifica el brillo y contraste de los canales de fluorescencia separados para tener la mejor vista posible de las células.
3. Para facilitar el trazado de celdas, fusiona los canales de tinción nuclear o campo claro usando Imagen \ Color \ Canales de Fusión y selecciona los archivos apropiados para cada canal individual en la ventana emergente.
4. Para rastrear celdas específicas basándose en los límites celulares y la tinción nuclear, usa Analizar \ Herramientas \ ROI Manager y marca tanto mostrar todo como etiquetar en la ventana emergente resultante.
5. Traza cuidadosamente las celdas usando la herramienta de selección a mano alzada y pulsa t para añadir una celda.
   NOTA: Asegúrate de que las celdas estén trazadas en las 4 esquinas y en el centro del vídeo.
6. Una vez que todas las celdas hayan sido trazadas correctamente, dentro de la pestaña abierta con todos los ROIs, haz clic en Más \ Multi Measure y pulsa OK en la ventana emergente resultante.
7. Copia toda la hoja en la ventana emergente titulada Resultados en un archivo Excel.
   NOTA: La hoja resultante tendrá 6 subtítulos (Area1, Mean1, Min1, Max1, IntDen1, RawIntDen1) para cada ROI con un valor numérico después de cada uno, que corresponde a la celda correspondiente que se ha trazado. El valor importante para el análisis downstream será la media de cada ROI.
8. Para monitorizar la variación entre la intensidad de fluorescencia, calcular la fluorescencia media durante la línea base para cada célula y calcular el porcentaje de varianza. Los experimentos suelen tener una varianza entre el 20% y el 30%.
   
9. Normaliza todas las lecturas dividiendo los valores de intensidad media por la primera lectura de la línea base para cada una de las células trazadas.
10. Crea una columna adicional para el tiempo en segundos, con el primer fotograma correspondiente al fotograma 0 y los siguientes puntos de tiempo aumentando en 5, lo que corresponde al intervalo de 0,2 fps.
11. Copia los datos en un software de análisis y gráficos y genera una curva de cambio en la fluorescencia sobre la línea base a lo largo del tiempo.
    NOTA: Para generar gráficos de máximos de una sola celda, utilice la función =MAX() en Excel para encontrar el marco en el que se alcanza la intensidad máxima de fluorescencia para cada celda y graficar usando GraphPad Prism.

8. Análisis usando la Suite de Calcio

1. Usando Fiji, abre el archivo de vídeo y sigue los pasos 8.1 y 8.2.
2. Una vez que los canales nuclear y verde estén optimizados para su visualización, duplica un solo fotograma del vídeo haciendo clic en Imagen \ Duplicar. En la ventana emergente resultante, desmarca Duplicar pila de Hyper. Dentro de la misma ventana emergente, en canales, tipo 1. Guárdalo como archivo de imagen PNG.
3. Repite el paso 9.2 y debajo de los canales, tipo 2.
   Fusiona las dos imágenes siguiendo el paso 8.3. Sube la imagen a la interfaz gráfica de usuario de Cell-Pose para generar una máscara celular.
4. Sube la imagen a la interfaz gráfica de pose celular y segmenta usando la tinción nuclear (Canal 1) y las tinciones citoplasmáticas (Canal 2) seleccionando el modelo Cyto3.
5. Guarda la imagen como un archivo PNG, luego abre el archivo PNG en Fiji y conviértelo a un archivo TIFF.
   NOTA: La interfaz gráfica de pose de celda produce un archivo PNG en blanco y negro.
6. Abre tanto el archivo de máscara como el de vídeo en la Calcium Suite arrastrando y soltando, y luego haz clic en Analizar datos para generar un gráfico descargable, así como un archivo de .csv descargable que contiene valores normalizados y de intensidad en bruto para todas las células contadas por el software.

Resultados

Para medir la movilización del calcio en células vivas, se incuban células de Calu-3 o cultivos nasales primarios diferenciados con un colorante intracelular. El cambio relativo en la señal dependiente del calcio se mide como un aumento en la movilización del calcio, ya sea desde las reservas intracelulares de calcio o del espacio extracelular hacia el citosol. Un aumento sostenido de calcio en el citosol se representa por un aumento de la fluorescencia después de que se

Discusión

Este artículo ha presentado métodos para analizar la señalización de calcio unicelular en cultivos nasales y bronquiales primarios vivos, así como en una línea celular epitelial estable. Tanto los reporteros de calcio Cal-520 AM como Fluo-4 AM son indicadores útiles de calcio en ambos montajes. El Cal-520 AM es más sensible, ya que tiene un rendimiento cuántico mayor de 0,75 en comparación con el Fluo-4 AM de 0,16 y una afinidad ligeramente mayor por el calcio (el Kd del Cal-520 AM es de...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 24 pozos	Thermofisher	142475
insertos transwell de 24 pozos	Corning	CLS3470-48EA
Microplacas de poliestireno negro con fondo plano transparente de 96 pozos tratados con TC	Corning	3603
Cal-520 AM	AAT Bioquest	21130	Alistado y almacenado a -20&º; C, disuelto en DMSO
Calcium Suite Software	El código se puede solicitar contactando con nuestro grupo de laboratorio
EMEM, 1xs	Wisent	320-005-CL	Almacenado a 4º grado; C
Suero bovino fetal	Wisent	080-450	Alistado y almacenado a -20&º; C
Fluo-4 AM & nbsp;	AAT Bioquest	20550	Alistado y almacenado a -20&º; C, disuelto en DMSO
HEPES	Bioshop	HEP001.5	Almacenado a temperatura ambiente
Hoechst	Thermofisher	H3570	Almacenado a 4º grado; C
Línea celular epitelial de adeoncarcinoma colorrectal humano	ATCC	HTB-55
Cloruro de Magnesio y nbsp;	Sigma	7786-30-3	Almacenado a temperatura ambiente
Micro-plato de 35mm, fondo de cristal bajo	Ibidi	80137	Almacenado a temperatura ambiente
Solución de penicilina-estreptomicina	Wisent	450-200-EL	Almacenado a 4º grado; C
Solución salina con fosfato tamponado (PBS)	Wisent	3111-010-CL	Almacenado a temperatura ambiente
Cloruro de potasio	Sigma	7447-40-7	Almacenado a temperatura ambiente
Probenecid	Thermofisher	P36400	Alistado y almacenado a -20&º; C, soluble en agua y nbsp;
Cloruro de sodio y nbsp;	Bioshop	SOD004	Almacenado a temperatura ambiente
Thapsigargin	Thermofisher	T7458	Alistado y almacenado a -20&º; C disuelto en DMSO
Enzima TripLE Express (1X), fenol rojo y nbsp;	Thermofisher	12605010	Almacenado a 4º grado; C