Este protocolo demuestra la inyección temporal en venas para la administración intravenosa de células cancerosas pediátricas a ratones neonatales, permitiendo un modelado preciso y reproducible de las respuestas inmunitarias en la vida temprana contra el cáncer. El método permite evaluar el impacto de intervenciones, como la inmunomodulación o la terapia, cuando se aplican durante el periodo neonatal.
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Artículo de método
Un modelo de trasplante intravenoso neonatal para la evaluación de las actividades inmunitarias en la vida temprana contra células cancerosas
En este artículo
Resumen
Resumen
Más de la mitad de todos los cánceres pediátricos se inician in utero, con la progresión hacia la enfermedad manifesta que continúa durante el periodo neonatal. Aunque las inmunoterapias ahora ofrecen nuevas opciones de tratamiento para muchos niños con cáncer, cómo la inmunidad en la vida temprana influye en la progresión del cáncer y la respuesta terapéutica sigue sin comprenderse completamente. Para abordar esta carencia requerirá la evaluación de intervenciones terapéuticas durante el periodo neonatal, cuando las respuestas inmunitarias difieren fundamentalmente de las de la infancia avanzada y la edad adulta.
Aquí describimos un modelo de trasplante neonatal que se integra con imágenes bioluminiscentes in vivo para investigar el impacto de la modulación inmunitaria en la vida temprana en los cánceres pediátricos.
La inyección temporal de células marcadas con luciferasa derivadas de dos cánceres iniciados en el útero logró el enjerto tumoral reproducible en receptores singénicos de 1–2 días de edad, sin mortalidad relacionada con procedimientos y con alto éxito procedimental, como lo confirma la imagen bioluminiscente. Utilizando la modulación inmune impulsada por la infección como variable experimental, mostramos que la infección intraperitoneal con citomegalovirus murino cinco días después del trasplante resulta en una reducción notable de la carga de leucemia linfoblástica aguda (LLA), pero no del neuroblastoma (NB). Esta plataforma permite estudiar diferencias específicas del cáncer en respuesta a la modulación inmune en la vida temprana y subraya la importancia del contexto tumoral al modelar las interacciones inmune y cáncer en la vida temprana.
En conjunto, esta metodología proporciona una plataforma versátil y altamente reproducible para analizar los mecanismos inmunitarios neonatales relevantes para la inmunovigilancia del cáncer, la modulación inmune impulsada por infecciones y la intervención terapéutica. Más allá de la LLA y NB, este enfoque puede adaptarse a nuevas malignidades pediátricas y estrategias inmunomoduladoras, apoyando estudios mecanicistas y evaluación preclínica de intervenciones oncológicas en la vida temprana.
Introducción
Los avances recientes en inmunoterapia han mejorado notablemente los resultados para ciertos pacientes con cáncer, pero su aplicación óptima en niños pequeños requiere una comprensión profunda de cómo el sistema inmunitario en desarrollo identifica y erradica las células cancerosas. Aunque aproximadamente el 50% de los cánceres infantiles se originan in utero, incluyendo leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL) y NB, cada vez más evidencia sugiere que los eventos posnatales influyen críticamente en la evolución de la enfermedad y en el resultadoclínico 1,2.
Las respuestas inmunitarias neonatales difieren cuantitativa y cualitativamente de las de los adultos3. En ausencia de una inmunidad adaptativa completamente desarrollada, la protección de los recién nacidos depende en gran medida de los anticuerpos maternos y de las células inmunitarias innatas. Sin embargo, estos efectores innatos son funcionalmente menos eficientes que sus homólogos adultos debido a la hipo-respuesta intrínseca a las células y a la activación aumentada de las vías inmunosupresoras, dejando a los recién nacidos particularmente susceptibles a lainfección 4,5,6. Sin embargo, el impacto de estas características en la capacidad del sistema inmunitario inmaduro para desarrollar respuestas anticancerígenas efectivas sigue siendo poco comprendido.
Modelar la inmunidad anticancerígena en la vida temprana requiere la administración precisa y reproducible de células cancerosas y moduladores inmunitarios o patógenos durante la corta ventana posnatal, cuando la función inmunitaria está limitada. La inyección en la vena temporal es un método de administración intravenosa neonatal (IV) que mejor cumple con estos requisitos y ofrece un alto éxito procedimental, baja mortalidad, estrés mínimo de manipulación y compatibilidad con intervenciones secuenciales, como el desafío de infección o la administraciónterapéutica 7,8,9,10.
En este estudio, basamos y modificamos técnicas de parto intravenoso neonatal previamente validadas y la versatilidad de la imagen bioluminiscente in vivo para describir un modelo de trasplante que estudie el impacto de la infección en la vida temprana en la progresión de las células cancerosas pediátricas. Este enfoque permite la administración intravenosa de células B-ALL o NB marcadas con luciferasa a cachorros de 1–2 días de nacidad, seguida de la modulación inmunitaria mediante la administración intraperitoneal (i.p.) de citomegalovirus murino (mCMV) en el día posnatal 7 (P7). La progresión del cáncer fue evaluada posteriormente 10 días después de la infección (P17).
Aunque el acceso a la vena temporal está restringido a una ventana postnatal limitada (P0–P3), esta metodología mejora la reproducibilidad y el control experimental, ofreciendo una plataforma versátil para investigar la influencia de los mecanismos inmunitarios en la vida temprana en la inmunovigilancia del cáncer, las interacciones infección–cáncer y las respuestas a la inmunoterapia. Además, este enfoque favorece la localización eficiente de células trasplantadas, permitiendo así el establecimiento reproducible de modelos de enfermedades para investigaciones mecanicistas.
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Protocolo
Todos los procedimientos (Figura 1) se realizaron conforme a las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal y fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Columbia Británica (protocolo A23-0169).
1. Generación de células leucémicas marcadas con luciferasa
- Aislamiento de células leucémicas de ratones leucémicos Eμ-Ret
- Anestesiar ratones en una cámara de inducción de 1 L con un 5 % de isoflurano y 1 L·min-1 de oxígeno hasta lograr un plano quirúrgico profundo (pérdida del reflejo de enderezamiento y respiración lenta y regular).
- Una vez confirmada la anestesia profunda, se suspende el isoflurano y se administra dióxido de carbono (CO₂) a un caudal elevado (3–4 veces la tasa estándar de desplazamiento gradual; por ejemplo, 6-8 L·min para una cámara de 10 L) sin transferir al animal entre cámaras. Mantén la exposición al CO₂ durante al menos 5 minutos después de que cese la respiración para asegurar la muerte.
- Ventila y elimina los gases residuales antes de abrir la cámara.
- Confirmar la muerte por ausencia de latidos cardíacos y respiración, y luego realizar una luxación cervical como método físico secundario según lo institucional.
- Transfiere el cadáver a un armario de bioseguridad, reconfirma la muerte, registra el sexo y el peso corporal, y rocía el exterior con un 70 % de etanol.
- Haz una incisión abdominal media, refleja la piel y la pared peritoneal, y extirpa el bazo en un PBS estéril de 5 mL.
- Disecciona tibias y fémures de ambas piernas, eliminando el exceso de tejido, y extirpa el bazo en condiciones estériles. Transfiere inmediatamente el bazo a una solución estéril y helada de solución salina tamponada con fosfato (PBS) de 5 mL para preservar la viabilidad celular.
- Procesa el bazo.
- Homogeneizar tejido del bazo en 1 mL de tampón de lisis de 1× glóbulos rojos (glóbulos rojos) (usar 2 mL para bazos > 200 mg). Incuba durante 2–3 minutos a temperatura ambiente.
- Apagar la lisis añadiendo 10 mL de PBS + 2 % de suero bovino fetal (FBS) (tampón FACS), filtrar por un colador de 40 μm y centrifugar a 350 × g durante 5 minutos a 4 °C.
- Resuspende el pellet de bazo en un buffer FACS de 5 mL.
- Procesa la médula ósea.
- Extirpe ambas epífisis y enjuague cada hueso con un buffer FACS de 1 mL usando una jeringuilla de 1 mL equipada con una aguja calibre 29 en un tubo de 15 mL.
- Centrifugar la suspensión celular, descartar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 mL de tampón de lisis de 1× glóbulos, incubar durante 2 minutos en RT, luego apagar la lisis añadiendo 10 mL de tampón FACS, filtrar a través de un colador de 40 μm y centrifugar a 350 × g durante 5 minutos a 4 °C.
- Desecha el sobrenadante y vuelve a suspender el perdigón BM en un buffer FACS de 1 mL pipeteando arriba y abajo.
- Aplica el vórtice suavemente y filtra a través de un colador de 40 μm si es necesario.
- Resuspender 0,5 × 10^6 células leucémicas en medios de cultivo celular de 200 μL (por ejemplo, el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco) suplementado con 20 % FBS e interleucina-7 (IL-7; 250 pg·mL-1).
Punto de pausa: Deja las suspensiones de las celdas en hielo hasta 2 horas antes de teñir.
- Transducción lentiviral de células leucémicas:
- Siembra células estromales derivadas de la médula ósea murina a 1 × 10^5 células por pozo en una placa de 24 pozos 24 horas antes de la transducción para permitir la adherencia y lograr una confluencia del 70–80%.
- Células leucémicas de placas (0,5 × 10^6 células en un volumen final de 200 μL) en una placa de 24 pozos tratada sin cultivo tisular.
- Añadir un vector lentiviral autoinactivador (SIN) que codifica un reportero de doble fusión compuesto por luciferasa roja de escarabajo clic (CBR) y proteína fluorescente verde mejorada (eGFP), impulsado por un promotor constitutivo de ubiquitina, con multiplicidad de infección (MOI): 10–20, título viral: ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1 (unidades transducentes por mililitro) en un volumen final de transducción de 200 μL junto con polibrina (8 μg·mL-1; Sigma, H9268-5G).
PRECAUCIÓN: La polibrena es citotóxica en concentraciones altas. No exceder los 8 μg·mL-1. Manejar el lentivirus bajo contención de Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2). - Sella la placa con parafilm y centrifuga a 1.200 × g durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Tras la espinoculación, transfiere las células leucémicas transducidas a la monocapa estromal y cultiva durante 24 horas a 37 °C, 5% CO₂ en DMEM + 20% FBS + IL-7 (250 pg·mL-1) para apoyar la supervivencia celular y la expresión de reporteros.
NOTA: Se pueden añadir antibióticos después de 24 horas si es necesario, pero deben evitarse durante la transducción viral. - Tras 24 horas, recoge células leucémicas no adherentes y lávate dos veces con solución fisiológica estéril tamponada con fosfato (PBS), 350 × g durante 20 minutos a 4 °C, para eliminar virus y polibreno residuales.
- Resuspender células en PBS estéril a 1 × 10^7 células·mL-1 para el trasplante.
Punto de pausa: Tras el lavado, las células pueden mantenerse en la misma condición de cultivo hasta 48 horas antes del trasplante si es necesario.
- Trasplante en ratones adultos NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl/SzJ)
- Utiliza ratones NSG de 4–6 semanas como receptores.
- Calienta el ratón durante 5 minutos usando una almohadilla de calor o una lámpara de calor para dilatar las venas de la cola.
- Sujeta al ratón usando un restricción acrílica.
- Inyectar 1 × 10^6 células en PBS estéril de 100 μL a través de la vena lateral de la cola usando jeringuilla de insulina calibre 29. No se requiere anestesia (a menos que lo requieran las directrices de la institución)
- Aplica una presión suave en el lugar de la inyección para evitar el sangrado.
PRECAUCIÓN: Evita la extravasación. Una inyección intravenosa exitosa resulta en que no se vea hinchazón. - Monitoriza a los ratones dos veces por semana para detectar el desarrollo de enfermedades.
- Clasificación de células leucémicas GFP+
- Al inicio de la enfermedad, recolecta la defección o el bazo de ratones leucémicos NSG.
- Prepara una suspensión de celda simple como se ha descrito anteriormente.
- Células de tinción con tinte de viabilidad (7-AAD).
- Utiliza la Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS) para clasificar células leucémicas GFP+.
- Para la clasificación, utiliza un clasificador de celdas de alta velocidad y sigue la estrategia de gating de dispersión directa (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) → excluir residuos, FSC-A frente a FSC-H → seleccionar singletes, viabilidad de colorante negativo → seleccionar celdas vivas, GFP+ → aislar células leucémicas reporteras positivas.
- Recoge las células clasificadas en tubos que contienen DMEM + 20 % FBS. Pureza objetivo post-ordenación: ≥ 95 % de celdas GFP+.
Punto de pausa: Las celdas clasificadas pueden mantenerse en hielo hasta 2 horas antes de la criopreservación.
- Criopreservación de celdas clasificadas
- Resuspende las células clasificadas a 5 × 10^6 células/mL en un medio congelante que contenga 90 % FBS y 10 % de dimetilsulfóxido (DMSO).
- Adicte 1 mL por criovial y coloca los viales en un recipiente congelante a base de isopropanol y guarda a −80 °C durante la noche (12–18 h).
- Transfiere los viales al nitrógeno líquido (LN₂) para su almacenamiento a largo plazo.
PRECAUCIÓN: El DMSO es tóxico y se absorbe fácilmente a través de la piel. Manipula con guantes y trabaja rápido.
Punto de pausa: Las células pueden almacenarse a largo plazo en nitrógeno líquido hasta su uso en experimentos de trasplante neonatal.
2. Generación de células NB marcadas con luciferasa
NOTA: Los ratones transgénicos TH-MYCN desarrollan tumores NB espontáneos y se mantuvieron bajo protocolos institucionales aprobados para el cuidado animal. El vector lentiviral utilizado es el mismo que se describe en la Sección 1.2.
- Extracción de tumores y disociación tisular
- Eutanasiar ratones portadores de tumores con TH-MYCN según las directrices aprobadas para el cuidado animal.
- Extraer tumores NB subcutáneos o abdominales en condiciones estériles.
- Pesa el tejido tumoral y tritura en fragmentos de ~1–2 mm usando tijeras estériles.
- Transfiere tejido a aproximadamente 5 mL de tampón digestivo por cada 0,5 g de tejido tumoral en un tubo cónico de 15 mL, compuesto por DMEM, desoxirribonucleasa I (DNasa I; 50–100 U·mL-1) y mezcla enzimática basada en colagénasa (concentración final de 10 μg·mL-1 ).
- Incubar a 37 °C en una incubadora agitada a 150 rpm durante 30 minutos.
PRECAUCIÓN: Los reactivos digestivos enzimáticos pueden causar irritación de la piel y los ojos. Lleva guantes y protección ocular. - Después de la digestión, pipetea suavemente arriba y abajo para disociar aún más el tejido. Filtra la suspensión a través de un colador de celda de 70 μm hacia un tubo nuevo.
- Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente (20–22 °C).
- Desecha el sobrenadante y resuspende el pellet en DMEM complementado con un 10% de FBS.
- Realizar la lisis de los glóbulos rojos utilizando el buffer de lisis RBS como se ha descrito anteriormente en la Sección 1.1.
- Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos y resuspender el pellet en 10 mL de DMEM de alta glucosa suplementado con FBS al 10% y 50 μM de 2-mercaptoetanol.
PRECAUCIÓN: El 2-mercaptoetanol es tóxico y volátil. Realiza la manipulación en una campana extractora química.
Punto de pausa: Las células pueden mantenerse en hielo hasta 1 hora antes de la transducción.
- Transducción lentiviral
- Pellet 2 × 10^6 células NB a 300 × g durante 5 minutos y elimina completamente el sobrenadante.
- Resuspende el pellet celular directamente en un vector lentiviral concentrado de 14 μL (el mismo vector descrito en la Sección 1.2; título viral ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1, MOI aproximado: 10–20).
- Incubar la mezcla célula-virus durante 5 minutos a 37 °C en una incubadora humidificada (% CO₂).
- Añade 200 μL de DMEM con alta glucosa + 10% FBS y continúa la incubación durante 2 horas a 37 °C, 5% CO₂.
PRECAUCIÓN: Los vectores lentivirales deben manejarse bajo condiciones BSL 2. - Lava las células transducidas cuatro veces con DMEM de alta glucosa para eliminar el virus residual.
- Cuenta las células viables usando exclusión de azul de tripán.
IMPORTANTE: Mantén la preparación de la matriz en hielo en todo momento para evitar la gelificación prematura.
- Implantación subcutánea en ratones NSG
- Resuspender células a 5 × 10^6 células por 100 μL en una preparación de matriz de membrana basal fría (matriz extracelular reducida por factor de crecimiento).
- Anestesiar ratones NSG de 6–8 semanas (véase Sección 1.1) utilizando isoflurano inhalado (2–3% de oxígeno).
- Mezcla de célula de carga–matriz en una jeringuilla prefría de 1 mL equipada con una aguja calibre 27.
- Inyectar 5 × 10^6 células con un volumen total de 100 μL de forma subcutánea en la región del flanco.
- Vigila a los ratones hasta que se recupere completamente de la anestesia.
NOTA: Inyecta inmediatamente después de mezclar con la matriz para evitar la solidificación dentro de la jeringuilla. - Permite que los tumores crezcan hasta ~1 cm de diámetro.
- Clasificación de celdas
- Extraer tumores y generar suspensiones unicelulares como se describe en las Secciones 2.1–2.2.
- Enriquecer las células marcadas con luciferasa mediante FACS basándose en la expresión de GFP, siguiendo la estrategia de acceso descrita en la Sección 1.4.
- Realiza dos rondas secuenciales de clasificación para alcanzar ≥ pureza positiva al 95% de GFP.
- Criopreservación
- Células clasificadas criopreservadas según se describe en la Sección 1.5.
Punto de pausa: Las células pueden almacenarse a largo plazo en nitrógeno líquido para futuros experimentos de trasplante.
- Células clasificadas criopreservadas según se describe en la Sección 1.5.
3. Prepara la suspensión celular para la inyección de la vena temporal
- Descongelación criopreservada rápidamente células leucémicas marcadas con luciferasa o células NB en un baño de agua a 37 °C hasta que queda un pequeño cristal de hielo.
- Desinfecta inmediatamente el exterior del vial con un 70 % de etanol, luego transfiere el contenido a 9 mL de medio DMEM precalentado + 10 % FBS en un tubo cónico de 15 mL.
- Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C, aspirar sobrenadante y volver a suspender el pellet en PBS estéril y helado.
- Determina la viabilidad usando exclusión de azul de tripán y un hemocitómetro (o contador celular automatizado). Usa solo suspensiones con ≥ 80 % de viabilidad.
- Pasa la suspensión de la celda por un colador de celda de 40 μm para eliminar grumos.
PRECAUCIÓN: Los grupos celulares aumentan las inyecciones fallidas y las lesiones tisulares. - Ajustar la concentración para preparar 20 μL por neonato que contenga 1 × 10^4 células leucémicas (para trasplante leucémico), o 5 × 10^4 células NB (para trasplante NB).
- Mantén la suspensión de la célula sobre hielo y mezcla suavemente inmediatamente antes de cargar la jeringuilla para mantener la homogeneidad.
Punto de pausa: Mantenga las células en hielo hasta 2 horas antes de la inyección si la viabilidad se mantiene ≥ 80%.
4. Inyección de vena temporal (crías P1–P2)
NOTA: La inyección neonatal de venas temporales puede realizarse sin anestesia. Sin embargo, la inmovilización hipotérmica breve se utiliza comúnmente para reducir el movimiento y mejorar la precisión de la inyección. Algunos comités institucionales de cuidado animal no permiten el uso de inmovilización por hipotermia; los investigadores deben consultar con su comité institucional correspondiente antes de realizar este procedimiento. Si su institución lo aprueba, los siguientes pasos son efectivos para la inmovilización hipotérmica.
- Prepara un recipiente pequeño forrado con una servilleta estéril y enfríalo previamente colocándola sobre hielo.
- Colocar a los cachorros (días postnatales 1–2; P1–P2) sobre la servilleta dentro del recipiente para la inmovilización hipotérmica durante 2–3 minutos hasta que el movimiento espontáneo se reduce notablemente.
IMPORTANTE: No permitas que los cachorros entren en contacto directo con el hielo (usa siempre el recipiente y la barrera de servilletas). - Carga 60 μL de la suspensión de la celda en una jeringuilla de cristal de 100 μL y coloca una aguja calibre 30. Expulsa la suspensión de nuevo dentro del tubo para rellenar el volumen muerto de la jeringuilla y la aguja. Una vez que el volumen muerto está cebado, aspira 20 μL de suspensión de celda para la inyección, asegurando que no haya burbujas de aire. Utilizan ratones BALB/c y TH-MYCN como receptores de células leucémicas y NB, respectivamente.
- Prepara un escenario transiluminado colocando una fuente de luz fría bajo una plataforma de plexiglás.
- Usa gafas con aumento (o un estereomicroscopio) para visualizar el lugar de la inyección.
- Coloca una servilleta estéril con un agujero central en el escenario y coloca al cachorro de modo que la vena temporal sea visible.
- Coloca un pequeño trozo de plastilina (plastilina) junto a la cabeza del cachorro para ayudar a estabilizar la aguja durante la inyección.
- Insertar el bisel de la aguja hacia arriba en la vena temporal visible e inyectar lentamente la suspensión celular, observando el llenado vascular para confirmar el éxito de la administración intravenosa.
- Después de la inyección, aplica una presión suave en el lugar de la inyección usando un hisopo de algodón estéril. Coloca al cachorro sobre una superficie de recuperación calentita (aproximadamente 37 °C, por ejemplo, almohadilla térmica en baja temperatura con una barrera para toallas) hasta que el movimiento normal y la coloración rosa regresen.
- Vigila al cachorro durante 5–10 minutos tras recuperarse y luego devuélvelo a la presa.
PRECAUCIÓN: Evita sobrecalentar durante la recuperación. Usa una capa de barrera y monitoriza de forma continua. - Enjuaga la jeringuilla inmediatamente con PBS, luego con una solución limpiadora para jeringuilla, y termina con etanol al 70%.
5. Preparación e infección del virus
- Realizar todos los procedimientos relacionados con el citomegalovirus murino (mCMV) bajo contención de BSL-2, de acuerdo con las autorizaciones institucionales de bioseguridad y cuidado animal.
- Manipular las existencias de virus en un armario certificado de seguridad biológica de Clase II y realizar infecciones animales en áreas designadas para procedimientos BSL-2.
- Realizar la preparación y manejo del virus en un gabinete certificado de seguridad biológica Clase II, y realizar las infecciones animales en áreas designadas para procedimientos BSL-2.
- Lleva el EPI adecuado, incluyendo bata de laboratorio o bata desechable, guantes y protección ocular. Trata todos los materiales que contengan virus (jeringuillas, camas, jaulas y superficies) como potencialmente infecciosos.
- Minimizar el uso de objetos punzantes y desechar las agujas inmediatamente en recipientes aprobados para objetos biohazard. Descontamina las superficies de trabajo y los equipos después de su uso. Eliminar todos los residuos sólidos y líquidos como residuos biopeligrosos según los procedimientos institucionales.
- Infectar ratones en P7 (5–6 días después del trasplante de células leucémicas).
- Descongela una alicota del virus sobre hielo, mezcla suavemente por inversión y mantenla en hielo durante la preparación. Evita ciclos repetidos de congelación-deshielo (utiliza alicotas de un solo uso).
- Preparar mCMV a 2 × 10^5 unidades formadoras de placas (PFU)/mL en PBS e inyectar las puños intraperitonealmente (i.p.) con 1 × 10^4 PFU en PBS de 50 μL usando una aguja de calibre 30. Inyecta en el cuadrante inferior derecho del abdomen en un ángulo poco profundo para evitar los órganos abdominales.
PRECAUCIÓN: el mCMV es infeccioso (BSL-2). Utiliza una contención y descontaminación adecuadas. - Registrar la identificación del animal, edad, grupo experimental, dosis del virus, volumen y detalles de la inyección.
6. Imagen por bioluminiscencia (BLI)
NOTA: Realizar BLI en P7 (5–6 días después de la inyección celular y antes de la infección) y en P17 (10 días después de la infección) como se describe a continuación.
- Disolver D-Luciferina en PBS a 10 μg·μL-1. Filtrar y esterilizar usando un filtro de 0,22 μm, una cuota y guardarlo a −20 °C protegido de la luz.
PRECAUCIÓN: La D-luciferina es fotosensible. Minimiza la exposición a la luz durante la preparación y el uso. - Inyecta D-luciferina i.p. a 50 μL por cachorro usando una aguja de calibre 30.
- Anestesiar a las crías con isoflurano (inducción 3–4 %, mantenimiento 1,5–2 %) en oxígeno (0,8–1,0 L·min-1). Mantener la temperatura corporal en un escenario de imagen calentado (aproximadamente 37 °C).
PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico volátil. Utiliza un vaporizador y un sistema de recogida aprobados. - Coloca a los cachorros anestesiados en un sistema de imagen para animales pequeños (detalles del instrumento proporcionados en la Tabla de Materiales).
- Adquirir imágenes bioluminiscentes y de rayos X usando ajustes de exposición consistentes 10 minutos después de la inyección de D-luciferina (ajustes BLI: tiempo de exposición 120 s para imágenes P7 y 30 s para P17, binning B4 para P7 y B4 para imágenes P17, campo de visión (FOV) 25, paso 1,2, altura del objeto 1,5 y ajustes de rayos X: resolución alta, potencia alta).
Punto de pausa: Almacenar archivos de imágenes inmediatamente después de la imagen; El análisis puede completarse más adelante. - Analizar imágenes utilizando el software de imagen BLI adecuado definiendo regiones de interés (ROI) que abarcan todo el cuerpo de cada ratón y cuantificando la luz emitida como fotones·s⁻1·cm⁻2·sr⁻1.
- Exportar valores cuantificados de ROI para análisis estadístico posterior.
7. Extracción de células leucémicas de ratones trasplantados
- Extraer células leucémicas y generar suspensiones unicelulares como se describe en la Sección 1.1.
8. Tinción y adquisición por citometría de flujo
- Contar las celdas y las suspensiones de centrifugadora a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C y resuspender a 1 × 10^7 células·mL-1 en el tampón FACS.
- Transfiere 100 μL (1 × 10^6 celdas) a tubos de citometría de flujo de poliestireno.
- Añade anticuerpo bloqueador de los receptores Fc (anti-CD16/32; 1 μL por sonda) e incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Preparar mezcla maestra de anticuerpos en el tampón FACS y añadir a cada tubo CD19-FITC, BP1-PE, B220-APC y marcadores negativos de linaje (TER119-PerCP, CD3-PerCP, CD11b-PerCP), 1 μL de cada anticuerpo por 1 x 10^6 células en un tampón FACS de 100 μL.
- Incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lavar con un buffer FACS de 5 mL, centrifugar y volver a suspender en un buffer FACS de 200 μL que contiene 7-AAD (3 μL) y contar perlas (6 μL; 6.000 perlas).
- Preparar controles de compensación con tinción única utilizando perlas o células de captura de anticuerpos y adquirir controles junto con muestras experimentales.
- Adquirir muestras en un citómetro de flujo usando los ajustes estándar de detectores FITC/PE/APC/PerCP y un caudal medio. Colecciona eventos hasta conseguir 1.000 cuentas.
- Exportar archivos FCS y analizar utilizando software de análisis de citometría de flujo (listado en la Tabla de Materiales) utilizando la estrategia de acceso establecida (Figura 2D).
- Calcula el número absoluto de células por bazo o médula ósea usando cuentas de conteo multiplicando el número de eventos objetivo adquiridos en 1.000 perlas por un factor de escala de 6 (se añaden 6.000 cuentas), y normalizando a la cellularidad total de órganos basada en la fracción de células teñidas (1 × 10^6 células).
9. Graficar gráficos y análisis estadístico
NOTA: Generar gráficos y realizar análisis estadísticos para datos de BLI y citometría de flujo utilizando un paquete de software estadístico (listado en la Tabla de Materiales).
- Presentar los datos como media ± error estándar de la media (SEM).
NOTA: Ningún animal fue excluido de este estudio. - Para BLI, comparar los grupos PBS y mCMV por separado en P7 y P17 usando pruebas de Mann–Whitney no emparejadas, aplicando la corrección de Holm–Šídák para ajustar las comparaciones múltiples entre puntos temporales.
- Analizar los resultados de la citometría de flujo utilizando una prueba de Mann–Whitney sin pares de dos colas.
- Define la significación estadística como p < 0,05.
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Resultados
La inyección de venas temporales permite un injerto neonatal eficiente de leucemia y neuroblastoma
Para modelar el impacto de la infección en la vida temprana en la progresión del cáncer pediátrico, se administraron por vía intravenosa a través de la vena temporal a crías sinténicas sinténicas de 1–2 días de nacido con Eμ-Ret o células NB derivadas de ratones Th-Mycn moribundos. El injerto exitoso se confirmó cinco días después del trasplante mediante imágenes BLI y r...
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Discusión
Comprender cómo el desarrollo inmunológico en la vida temprana influye en la progresión del cáncer es esencial para diseñar estrategias inmunomoduladoras adecuadas a la edad. En este estudio, describimos una plataforma reproducible de trasplante neonatal que permite un control temporal preciso del enfratemento de células cancerosas y la modulación inmunitaria durante una ventana crítica de inmadurez inmune posnatal. Al combinar la administración intravenosa mediada por venas temporales c...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por subvenciones operativas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud a G.S.D.R. (MOP-126122). A.F. fue beneficiario de una beca postdoctoral del Programa de Investigación del Cáncer Infantil Michael Cuccione (MC3RP).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100µL, Microliter Syringe, Luer Tip | Hamilton | 80601 | - |
| 30 G Needle | BD | 305106 | - |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | - |
| Ami-X imaging system | Spectral Instruments Imaging | - | - |
| anti-mouse B220- APC | Biolegend | 103212 | - |
| anti-mouse CD19-FITC | Biolegend | 152404 | - |
| anti-mouse CD3ε- PerCP | Biolegend | 100326 | - |
| anti-mouse Ly-51-PE | Biolegend | 108308 | También llamado BP1 |
| anti-mouse TER119- PerCP | Biolegend | 116226 | - |
| anti-mouse/human CD11b- PerCP | Biolegend | 101230 | - |
| Aura software | Spectral Instruments Imaging | - | versión 4.0.8 |
| BD Accuri C6 | BD | - | - |
| BD Fortessa X-20 | BD | - | - |
| Cleaning solution | Hamilton | 18310 | - |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 2770930 | 6 µL contiene 6000 cuentas |
| D-Luciferin | GoldBio | eLUCK-1G | - |
| DMEM | Gibco | 11965092 | - |
| DNase I | Sigma | 1.13E+10 | - |
| Falcon 40µm Cell Strainer, Blue, Sterile, Individually Packaged | FALCON | 352340 | - |
| FBS | Gibco | A5256701 | - |
| FlowJo software | BD | - | v10.8 |
| GeltrexTM | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | - |
| GraphPad Prism software | Dotmatics | - | v10.4.1 |
| LE.5209 Cold light source | Euromex | - | - |
| Liberase™ TM Research Grade | Sigma | 5.4E+09 | - |
| NSG mice | Jackson Labrotary | 5557 | NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ |
| Polybrene | Sigma | H9268-5G | - |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | 101301 | - |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | - |
Referencias
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat Rev Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Hwee, J., et al. A systematic review and meta-analysis of the association between childhood infections and the risk of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 118 (1), 127(2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Tsafaras, G. P., Ntontsi, P., Xanthou, G. Advantages and Limitations of the Neonatal Immune System. Front Pediatr. 8, 5(2020).
- Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune Responses in Neonates. Expert Rev Clin Immunol. 10 (9), 1171-1184 (2014).
- Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat Rev Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous Injections in Neonatal Mice. J Vis Exp. (93), e52037(2014).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread Gene Delivery and Structure-Specific Patterns of Expression in the Brain after Intraventricular Injections of Neonatal Mice with an Adeno-Associated Virus Vector. J Virol. 75 (24), 12382-12392 (2001).
- Wasala, L. P., Hakim, C. H., Yue, Y., Yang, N. N., Duan, D. Systemic Delivery of Adeno-Associated Viral Vectors in Mice and Dogs. Methods Mol Biol. 1937, 281-294 (2019).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice. J Vis Exp. (56), e2968(2011).
- Farrokhi, A., et al. Early-life infection depletes preleukemic cells in model of hyperdiploid B-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 144 (8), 809-821 (2024).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. 40 (5), 155-160 (2011).
- Pavathuparambil, A. M. N., et al. Facial vein injection of human cells in severe combined immunodeficiency (SCID) neonatal mice. MethodsX. 5, 1281-1286 (2018).
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