Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Enfoque multimodal para evaluar la regeneración ósea y el rendimiento en andamios

332 vistas

⸱

DOI:

10.3791/69483

⸱

13 de febrero de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Condensed Matter, Applied Physics and Nanoscience, Brazilian Center for Research in Physics, 3Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering (COPPE), Federal University of Rio de Janeiro, 4Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

En este artículo

Resumen

Proponemos un protocolo para evaluar la regeneración ósea en varios niveles jerárquicos. Este enfoque multimodal permite el análisis estructural a diferentes escalas de longitud, abordando eficazmente los desafíos en la preparación de la muestra. También proporciona un flujo de trabajo fiable para evaluar la eficacia de los biomateriales en la promoción de la regeneración ósea.

Resumen

El éxito clínico de un implante depende en gran medida de su capacidad para promover la reparación ósea y facilitar la osteointegración. Aunque se han logrado avances significativos en el diseño de nuevos andamios, no se ha investigado suficientemente a fondo el éxito del implante en distintas escalas de longitud ósea. El hueso es un tejido organizado jerárquicamente, con una estructura intrincada que abarca desde la organización de fibrillas de colágeno y su mineralización a escala nanométrica y micrómetro hasta la disposición macroscópica del hueso compacto y canceloso. Esta organización jerárquica es crucial para garantizar la función ósea y el rendimiento mecánico. En este contexto, es esencial una evaluación exhaustiva de los efectos de los biomateriales en la reparación ósea a múltiples escalas de longitud para evaluar la eficacia y seguridad de los materiales implantados. Sin embargo, preparar muestras para análisis multimodales integrados supone un desafío técnico. En este trabajo, presentamos un protocolo diseñado para evaluar la regeneración ósea a través de diversos niveles jerárquicos y analizar la interfaz entre el hueso recién formado y el andamiaje implantado. Este enfoque proporciona un método sólido para evaluar la eficacia de los andamios en la inducción de la reparación ósea. La combinación de técnicas seleccionadas de imagen 3D y 2D es crucial para una evaluación adecuada del tejido mineralizado complejo que se forma durante el proceso de curación ósea

Introducción

El hueso es un tejido complejo y organizadojerárquicamente 1,2. Comprender su organización estructural es esencial para abordar cuestiones fundamentales relacionadas con cómo las células contribuyen a la arquitectura tisular y cómo los cambios estructurales afectan a la función mecánica3. En este contexto, la remodelación ósea tras una lesión sigue siendo un tema central de investigación. La curación de fracturas es un proceso complejo de varias etapas, que comienza con una respuesta inflamatoria inicial, seguida de la angiogénesis y la diferenciación de las células progenitoras en condrocitos y osteoblastos 4,5. Se ha debatido mucho sobre el papel de los biomateriales para estimular la osteointegración, especialmente sobre la biocompatibilidad y su capacidad para prevenir la encapsulaciónfibrosa 6.

Un método comúnmente adoptado para evaluar osteointegración estimulada por biomateriales es la microscopía óptica, que permite análisis histológicos tanto cuantitativos como cualitativos. Se ha demostrado que este enfoque es una forma fiable y eficaz de evaluar el éxito de los implantesóseos 7,8. No obstante, varios problemas relacionados con la organización jerárquica ósea no pueden explorarse utilizando un único enfoque de imagen, especialmente el histológico, que está limitado al menos en parte por la restricción de aumento del método.

Los avances en la imagen tridimensional han resultado esenciales para comprender la organización jerárquica ósea. Técnicas como la tomografía microcomputarizada (microCT; radiación sincrotrón o fuentes convencionales de rayos X de laboratorio) 9,10,11, la microscopía electrónica de barrido de doble haz (FIB-SEM) asociada a la tomografía de corte yvista 12,13,14 y la tomografía electrónica de transmisión 15,16 aportaron nuevas perspectivas sobre la arquitectura ósea a múltiples escalas.

Basándose en diferentes enfoques de imagen 3D, se ha propuesto un modelo de organización jerárquica ósea, que inicialmente identificó nueve niveles distintos de organización estructuralósea 1. Este esquema ha sido recientemente revisado y ampliado para abarcar aproximadamente 12 niveles jerárquicos, sirviendo como una valiosa referencia para explorar la relación entre estructura y función en el tejidoóseo 2,17. Es importante destacar que este modelo jerárquico propuesto proporciona una base para evaluar el éxito de la reparación ósea tras una lesión. Evaluar si el tejido óseo regenerado reproduce la estructura jerárquica nativa es un estándar clave para evaluar la calidad de la cicatrización ósea, especialmente cuando se utilizan biomateriales en el sitio dañado.

Aunque se ha debatido el uso de múltiples técnicas de imagen para investigarla organización ósea 6,7,18,19,20, se ha explorado poco respecto a un flujo de trabajo que integre diferentes modalidades de imagen para evaluar la organización mineral ósea a lo largo de múltiples escalas espaciales. Como se ha mencionado, el hueso es un tejido compuesto complejo, compuesto por una fase orgánica (células, colágeno y macromoléculas) y una matriz mineralizada. Desde la perspectiva de la preparación de la muestra, esta complejidad presenta desafíos técnicos respecto a la permeación del disolvente a través de la muestra, la sección de una muestra dura y la integración de diferentes estrategias de imagen en la misma muestra.

La innovación clave en este trabajo es el establecimiento de un flujo de trabajo de imagen reproducible, correlativo y multiescala utilizando técnicas tridimensionales y complementarias. Como se ilustra en la Figura 1A, el flujo de trabajo está diseñado para que la misma muestra pueda examinarse secuencialmente utilizando diferentes modalidades de imagen. Como algunas de estas técnicas son destructivas o requieren seccionamiento, el flujo de trabajo sigue un orden que comienza con métodos no destructivos y avanza hacia enfoques que implican corte o eliminación de material.

Este flujo de trabajo de preparación y análisis de muestras es ampliamente aplicable a muestras duras o mineralizadas, incluyendo hueso cortical y trabecular, andamios preimplantacionales y la evaluación de la interfaz hueso/biomateriales tras la implantación. Al combinar modalidades de imagen que abarcan diferentes campos de visión y rangos de resolución (Figura 1B), el flujo de trabajo permite el análisis de muestras desde la escala centímetro hasta las escalas micrómetro y nanométrico. Aunque la secuencia está optimizada para soportar el análisis correlativo de una sola muestra, cada técnica también puede aplicarse de forma independiente según el objetivo experimental. Este enfoque permite una evaluación detallada de la osteointegración de biomateriales y la evaluación del crecimiento óseo regenerado en la zona de curación.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Los resultados presentados en este protocolo se obtuvieron de un procedimiento experimental realizado en un estudioanterior 21. Todos los procedimientos se llevaron a cabo conforme a las directrices éticas del Comité Ético para el Uso y Cuidado de Animales Experimentales de la Universidad Federal Fluminense, Brasil (CEUA/UFF: 779). Brevemente, 20 ratas Wistar machos de entre 300 y 400 g fueron asignados aleatoriamente a dos grupos: Sham y implantación de cHA-microsfera. Todos los animales fueron sometidos a cirugías en la que se creó un defecto de 2 mm en la diáfisis tibial. El grupo Sham actuó como control de coágulos para evaluar la regeneración ósea en un defecto no crítico, mientras que el grupo experimental recibió microesferas CHA37 implantadas en el lugar del defecto. Tras 7 y 21 días, se sacrificó a los animales con una sobredosis de anestesia general, y se recogieron bloqueos de hueso tibial de cada grupo y momento (7 y 21 días). La calidad ósea y la extensión del hueso recién formado se evaluaron mediante microscopía óptica y microtomografía.

1. Fijación de muestras e incrustación de resina

  1. Inmediatamente después de la eutanasia, se retira la tibia que contiene el biomaterial implantado y transfiere-lo a un vial que contiene solución fijadora de Karnovsky (2,5% glutaraldehído, 4% formaldehído en un tampón cacodilato 0,1 M). Guarda la muestra a -4 °C durante al menos 1 día.
    NOTA: Prepara y manipula el fijador bajo una campana extractora para evitar la exposición a sustancias volátiles. Toda la manipulación química debe realizarse utilizando el equipo de protección individual (EPP) adecuado, y se deben implementar medidas técnicas adicionales de seguridad siempre que sea necesario.
  2. Transfiere la muestra del fijador a un vial que contenga 0,1 M de tampón cacodilato. Mantén la muestra bajo una rotación suave, cambiando el buffer dos veces cada 10 minutos. En esta etapa, recorta los bordes de la muestra con una pequeña sierra para facilitar la infiltración de resina. Al cortar la muestra, mantenla húmeda en el tampón de cacodilato de 0,1 M para evitar que se seque.
    NOTA: Siempre mantén la muestra en un volumen buffer que sea al menos el doble del volumen de muestra. Esto debe aplicarse a todas las soluciones y resinas utilizadas en este protocolo. Al manipular los componentes químicos mencionados anteriormente, trabaja dentro de una campana extractora y usa el EPI adecuado. Recoge la solución fijadora y los residuos del tampón cacodilato en recipientes claramente etiquetados y químicamente compatibles con tapones correctamente ajustados. Seguir los Procedimientos Operativos Estándar (SOP) institucionales para el almacenamiento y eliminación segura de residuos químicos peligrosos.
  3. Inicia el proceso de deshidratación usando concentraciones crecientes de acetona (10%, 30%, 50%, 70%, 90% y 100%). Mantén la muestra bajo rotación durante 30 minutos en cada concentración. Repite el paso de acetona 100% anhidro 3 veces.
    NOTA: Al manipular acetona, trabaja dentro de una campana extractora y usa el EPI adecuado. Después de usarla, recoge cualquier disolvente residual en recipientes de residuos claramente etiquetados y químicamente compatibles con tapones bien ajustados. Sigue los procedimientos estándar estándar institucionales para el almacenamiento y eliminación segura de residuos químicos peligrosos.
  4. Infiltra con resina de espolón transfiriendo la muestra a través de una serie de proporciones graduadas de acetona a resina: 2:1, 1:1, 1:2, y finalmente resina pura. Cada paso debe durar 12 horas y realizarse en rotación a temperatura ambiente. Tras una infiltración graduada de acetona a resina, cambia la resina pura dos veces. Finalmente, transfiere la muestra a un molde que contenga resina pura y polimeriza la muestra a 70 °C durante 24 horas.
    NOTA: La resina se preparó según la hoja técnica para lograr una dureza media. Al manipular resina de espolones, trabaja dentro de una campana extractora y usa el EPI adecuado. Después de su uso, recoge cualquier residuo en contenedores de residuos claramente etiquetados y químicamente compatibles con tapones correctamente ajustados. Sigue los procedimientos estándar estándar institucionales para el almacenamiento y eliminación segura de residuos químicos peligrosos.

2. Visualización de muestras mediante tomografía de rayos X microcomputada (microCT)

NOTA: la microTC se utiliza para evaluar la posición del implante y la regeneración ósea. También ayuda a identificar posibles regiones de interés para análisis posteriores. Este paso debe realizarse con la muestra incrustada en resina.

  1. Utilice un soporte para muestras proporcionado por el fabricante como base, asegurándose de que la muestra esté bien posicionada para evitar movimientos durante el escaneo. Utiliza materiales de baja densidad para el soporte, como poliestireno, gasa o tubos de microcentrífuga.
  2. Visualiza usando los siguientes parámetros óptimos de barrido: tensión/corriente de tubo = 60 kV/133 mA; escalón angular = 0,33°; promediado de frames = 5; tamaño del vóxel = 5 μm; Modo de rotación = 180°. Para muestras que contienen implantes metálicos, se utiliza una rotación de 360° y un filtro de aluminio de 0,5 mm.
    NOTA: Durante la regeneración ósea, el grosor del hueso tejido tipo trabecular suele estar dentro de los límites de resolución de la imagen convencional por microTC. Para cuantificar con precisión los parámetros morfométricos convencionales del hueso trabecular, como el grosor, separación y número trabecular, se recomienda usar el menor tamaño de vóxel (5 μm según lo especificado). Si la Región de Interés (ROI) supera el Campo de Visión (FOV) a esta resolución nominal, primero se utiliza la característica multiscan para tilear el ROI. Considera aumentar el tamaño del vóxel solo como último recurso si el ROI no puede capturarse mediante multiscan.
  3. Tras el escaneo, los datos brutos de adquisición consisten en una serie de archivos de imagen numerados. Realizar la reconstrucción utilizando el software proporcionado por el fabricante, con un enfoque en minimizar artefactos en la región de interés de la muestra.
    NOTA: Es común encontrar artefactos de imagen a lo largo de los bordes de las imágenes, especialmente en áreas que no se analizarán. El volumen final puede recortarse usando el software del fabricante para eliminar estas regiones.
  4. Analiza el volumen reconstruido utilizando diversas opciones de software de visualización 3D, como Avizo, VGStudio Max, CTVox y Dragonfly22. Aplica filtros digitales de imagen para eliminar artefactos. En este caso, utiliza el método de Deruidización de Medios No Locales para estepropósito 19.
    NOTA: Los valores de suavizado del filtro de Denoising no local deben mantenerse lo más bajos posible, para no dificultar los detalles importantes de la interfaz.

3. Preparación de muestras para microscopía óptica

  1. Selecciona la dirección de sección de la muestra según el objetivo experimental. La tibia puede dividirse transversal o longitudinalmente a lo largo del eje largo del hueso. Utiliza secciones transversales para producir secciones en serie que cubran todo el volumen del defecto. La sección longitudinal es adecuada para evaluar la regeneración ósea a lo largo de la dirección del eje largo. Sin embargo, este enfoque solo proporciona una única sección del defecto.
    1. Utiliza un disco de sierra diamantado de baja velocidad para seccionar la muestra en rodajas de 1 mm, siguiendo la estrategia experimental.
      NOTA: Se recomienda usar un disco de diamante con un grosor de 0,006 a 0,012 pulgadas. Las hojas más finas permiten cortes muy precisos, con una pérdida mínima de material debido al grosor de la hoja.
    2. Llena el depósito de líquido hasta que el nivel del líquido cubra el borde inferior de la pala.
      NOTA: El agua destilada es adecuada para muestras de hueso. Sin embargo, si se prevé un calentamiento excesivo, como en muestras que contienen implantes metálicos, utiliza el aceite proporcionado por el fabricante del equipo para llenar el depósito.
    3. Asegura la muestra al soporte de la muestra y colócala al brazo del instrumento. Asegúrate de que la muestra esté estable y horizontal a la superficie del disco. Utiliza los botones de posicionamiento para ajustar la región de corte de la muestra al disco.
    4. Comienza a cortar la muestra usando ajustes de mayor velocidad (210 - 250 RPM) y aplica baja presión hasta que se forme una hendidura en la muestra. Luego, reduce la velocidad (a 93 - 124 RPM) para completar el seccionado de forma fluida y evitar vibraciones excesivas.
    5. Detén la sierra inmediatamente después de completar el corte. Ajusta el sistema correctamente para asegurarte de que el corte cese tan pronto como la muestra se desprenda de su bloque original.
  2. Examina la muestra con un estereomicroscopio. Comienza con una baja ampliación (por ejemplo, 5x-10x) para inspeccionar toda la muestra, luego aumenta la ampliación (por ejemplo, 20x-40x) para seleccionar la región de interés según la pregunta científica. El rango exacto de aumento puede variar según el instrumento utilizado. En este trabajo, se seleccionaron regiones que presentaban una mayor densidad de interfaces entre el hueso recién formado y el biomaterial para su análisis posterior.
  3. Montaje de muestra para diluido
    1. Monta la muestra sobre un soporte para facilitar un manejo adecuado durante el pulido. Si la muestra está destinada únicamente al análisis de microscopía óptica, fíjala directamente a una cubierta de plástico usando superpegamento en el lado previamente pulido.
      NOTA: Se recomiendan las láminas de plástico debido a su mejor adhesión. También se pueden usar portaobjetos de vidrio (tras un lavado extenso con jabón neutro). Sin embargo, las láminas de vidrio aumentan el riesgo de desprendimiento de la muestra durante el pulido.
    2. Para muestras que se analizarán más a fondo mediante un enfoque correlativo, montar sobre un conjunto de tubos de aluminio de dos piezas. En este protocolo, se desarrolló un conjunto casero de tubos de aluminio, compuesto por un cilindro sólido interior de 2,5 cm de diámetro y un cilindro hueco exterior que proporciona soporte mecánico durante el pulido. La muestra se conecta al cilindro sólido interior.
    3. Coloca el cilindro interior de aluminio sobre una placa caliente y caliéntalo a una temperatura adecuada para derretir la cera (normalmente alrededor de 60-70 °C, dependiendo del tipo de cera utilizada).
      NOTA: La cera de abeja también es adecuada. Al manipular cera de montaje, trabaja dentro de una campana extractora y lleva el EPI adecuado. Tras su uso, recoge los residuos en recipientes de residuos claramente etiquetados y químicamente compatibles con tapones correctamente ajustados. Sigue los procedimientos estándar estándar institucionales para el almacenamiento y eliminación segura de residuos químicos peligrosos.
    4. Aplica una pequeña cantidad de cera sobre la superficie del cilindro y deja que se derrita completamente.
    5. Una vez derretida, coloca la muestra con la superficie de interés sobre la superficie recubierta de cera y presiona suavemente para asegurar un contacto completo.
      NOTA: La superficie de interés debe orientarse hacia la superficie del cilindro para que el adelgazamiento se realice en el lado opuesto. Evita usar cera en exceso, ya que esto puede llevar a un montaje desigual y afectar la calidad del pulido.
    6. Retira el cilindro de la placa caliente y deja que la cera se solidifique a temperatura ambiente.
  4. Monitorización del grosor de la muestra durante el pulido
    1. Para monitorizar el grosor de la muestra durante el proceso de pulido, se utiliza microscopía de reflexión a aumentos bajos a intermedios (por ejemplo, 10x-20x). Un diagrama que ilustra la calibración del microscopio y la medición del grosor de la muestra se muestra en la Figura 2.
    2. Calibra el eje Z del microscopio con un tobogán estándar, que suele tener un grosor de unos 150 μm. Marca un lado del recubriente con un rotulador permanente rojo y una zona adyacente al lado opuesto con un rotulador azul. Monta la capa de cubierta en una corredera de cristal.
    3. Usando el botón de enfoque fino y la escala micrómetro, enfoca primero la superficie inferior del abrigo y luego la superficie superior.
    4. Anota el valor de desplazamiento Z. Este valor corresponde al grosor del deslizamiento de cubierta (aproximadamente 150 μm) y sirve como referencia.
    5. Mientras pule la muestra, utiliza periódicamente esta calibración del eje Z para estimar el grosor de la muestra sin extraerla del cilindro de aluminio.
      NOTA: Esta técnica permite una estimación rápida y no destructiva del grosor durante el pulido. Alternativamente, la muestra puede extraerse del soporte y medirse con un calibrador digital o micrómetro.
  5. Diluido y pulido
    1. Comienza el pulido grueso e intermedio usando papel de lija con granos de 1200, 2500 y 4100. El objetivo de este paso es reducir el grosor de la muestra a aproximadamente 0,15 mm eliminando irregularidades significativas en la superficie.
    2. Empieza con papel de lija de grano 1200, luego progresa a grano 2500. Aplica una ligera presión durante este proceso. Periódicamente monitoriza el grosor de la muestra usando microscopía de reflexión durante el pulido.
    3. Una vez alcanzado el grosor deseado, pule ambos lados de la muestra usando papel de lija de grano 4100. El pulido puede realizarse manualmente o con una máquina de pulido semiautomática ajustada a baja velocidad de rotación. Limpia la muestra a fondo con agua destilada de forma continua durante cada paso de pulido.
      NOTA: Mantener las muestras y los papeles de lija húmedos durante el pulido ayuda a reducir el calor y evita la contaminación superficial por las lija más rugosas.
    4. Para el pulido final, aplica una pequeña cantidad de pasta de diamante (por ejemplo, 6 μm o 3 μm) sobre un paño de fieltro montado en un disco de pulido. Selecciona el tamaño de la partícula de la pasta de diamante según la rugosidad superficial de la muestra.
      NOTA: Una pasta de 6 μm es adecuada para el pulido fino preliminar, mientras que se recomienda una pasta de 3 μm para el pulido final con espejo. Cuando es posible, usar ambas pastas secuencialmente da los mejores resultados. No obstante, aún se puede lograr un pulido satisfactorio usando solo la pasta de 6 μm.
    5. Pule suavemente ambos lados de la muestra con la mínima presión. Utiliza aire comprimido o algodón para secar la superficie pulida de la muestra antes de las investigaciones por microscopía.
    6. Para despegar la muestra del cilindro, calienta la cera usando una placa caliente y limpia cualquier residuo de cera de la muestra usando acetona anhidra.
      NOTA: Al manipular cera de montaje y acetona anhidra, trabaja dentro de una campana extractora y usa el EPI adecuado. Tras su uso, recoge los residuos en recipientes de residuos claramente etiquetados y químicamente compatibles con tapones correctamente ajustados. Sigue los procedimientos estándar estándar institucionales para el almacenamiento y eliminación segura de residuos químicos peligrosos.
    7. Monta la muestra entre una lámina de vidrio y el portaobjetos usando aceite de inmersión como medio de montaje y evalúa la orientación de la fibra de colágeno mediante microscopía de luz polarizada. Comienza con una baja ampliación (por ejemplo, 5x-10x) para medir la muestra y aumenta a una ampliación intermedia (por ejemplo, 20x-40x) para identificar regiones potenciales para exploración posterior mediante microscopía electrónica.
      NOTA: Para continuar con el flujo de trabajo correlativo y el posterior análisis de la muestra mediante microscopía electrónica de barrido, se recomienda no sellar la muestra.

4. Preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido

  1. Retira cuidadosamente la muestra de la lámina de vidrio. Desliza suavemente la cubierta fuera del corredero de cristal usando una punta de pipeta. Usa papel de filtro para eliminar el exceso de aceite de inmersión. Lava la muestra con jabón neutro. Realiza el lavado dentro de un recipiente pequeño para evitar la pérdida accidental de la muestra.
    NOTA: Si aún queda aceite de inmersión en la muestra, limpia suavemente la superficie usando un hisopo de algodón ligeramente humedecido con etanol al 70%.
  2. Deja que la muestra seque al aire sobre un papel de filtro de cristal. También se puede usar aire comprimido o algodón para secar la muestra. Una vez completamente seca, monta la muestra sobre un muñón con cinta de carbono. Cubre la muestra con una capa de oro de 10 nm para evitar la carga durante la imagen.
  3. Utiliza el microscopio FIB-SEM de doble haz para explorar la muestra mediante diversos métodos.
    1. En el modo SEM (microscopía electrónica de barrido), utilizando electrones secundarios o electrones retrodispersados, evalúa la morfología de la muestra, el biomaterial y la nueva interfaz ósea formada en regiones previamente seleccionadas por microscopía óptica.
    2. En el modo microscopía electrónica de barrido de haz de iones enfocado (FIB-SEM), se realiza tomografía de corte y vista.
  4. En modo SEM con el detector secundario de electrones, selecciona áreas que previamente se analizaron mediante microscopía de luz polarizada y SEM para proceder con la adquisición de tomografía de corte y vista.
  5. Ajusta los parámetros para el volumen de la zanja, tamaño de píxeles y grosor de corte según las características de interés. En nuestro montaje, la tomografía de corte y vista se realizó con un volumen de zanja de 15 μm x 10 μm x 10 μm, un tamaño de píxel de 20 nm y un grosor de corte de 60 nm. Se recomienda utilizar un tamaño de vóxel isométrico siempre que sea posible para mejorar la calidad de imagen en las tres dimensiones (XYZ).
    NOTA: Estos parámetros pueden variar según el sistema FIB-SEM específico. Consulta con el operador del equipo para determinar las condiciones óptimas basándose en tus requerimientos analíticos y las capacidades del sistema.

5. Alineación, procesamiento de filtros y segmentación de la tomografía FIB-SEM de corte y vista

  1. La tomografía de corte y vista genera una serie de imágenes numeradas secuencialmente. Para proceder con la alineación, convierte la serie en un archivo MRC, comúnmente conocido como pila.
  2. Realizar la generación de archivos MRC y el alineamiento de pilas de imágenes usando software IMOD.
    NOTA: Otros programas, como Avizo y FIJI/ImageJ, también ofrecen plugins de alineación de pila. Para una orientación detallada, consulte cada documentación específica de software. Además, el trabajo de Peddie etal 23. ofrece una visión general de los enfoques adoptados durante la alineación de la pila.
  3. Para generar el archivo MRC, abre el terminal o el símbolo del prompt, navega a la carpeta que contiene la secuencia de imágenes y ejecuta el siguiente comando: tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
    1. Para imágenes que no están en formato TIFF, usa raw2mrc en su lugar. Añade -g (por ejemplo, tif2mrc -g) para convertir imágenes RGB de 24 bits a escala de grises de 8 bits. Esto reducirá sustancialmente el tiempo de cálculo.
  4. Lanza Etomo desde el terminal y selecciona la opción Alinear secciones seriales. Sigue la secuencia para alinear la pila: (1) Carga la pila desalineada en un solo fotograma. (2) Pestaña de algin usando alineación automática inicial. (3) Crear una pestaña de pila usando Hacer pila alineada, y luego abrir la pila alineada.
    NOTA: Este proceso puede durar varios minutos, dependiendo del tamaño de la pila y del rendimiento del sistema.
  5. Una vez terminado, revisa el resultado. El archivo de pila alineado se llamará stackname_ali.mrc.
    NOTA: Este procedimiento utiliza la configuración predeterminada del sistema para la alineación de la pila. Sin embargo, los parámetros relacionados con la alineación inicial y la generación final de la pila pueden modificarse según las preferencias del usuario. Para orientación detallada, consulte la documentación del IMOD: https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.
  6. Realiza filtrado adicional de imágenes usando el software Avizo. Abre la pila alineada y aplica secuencialmente los siguientes filtros: Filtro de transformada rápida de Fourier (FFT), disponible en el plugin Sandbox Filter (selecciona la opción de orientación de franja vertical, valor de tolerancia: 2), asistente de corrección de sombreado (ajustar la selección de máscara para cubrir toda el área de sombra de la imagen, usar factor de normalización de 100), ecualización de histogramas (configuración por defecto) y medios no locales (ajustar valores a 5; 0,1; 10; 3).
    NOTA: Filtros equivalentes están disponibles en otros programas de análisis de imágenes. En FIJI/ImageJ, recomendamos la siguiente secuencia: filtro FFT, Restar Fondo, Mejorar Contraste Local (CLAHE) y Filtro de Medios No Locales.
  7. Procede a la segmentación de imágenes y al renderizado 3D usando el software. Existen diferentes estrategias de segmentación, incluyendo segmentación manual y segmentación basada en umbrales. Herramientas adicionales, como el algoritmo Watershed, pueden ayudar a automatizar el proceso y reducir el tiempo necesario para la segmentación.

6. Preparación de muestras para microscopía electrónica de transmisión

  1. Preparar las láminas utilizando microscopía electrónica de barrido de haz de iones enfocados (FIB-SEM) para evaluar la interfaz hueso/biomaterial.
    NOTA: Si el biomaterial implantado no es cerámico o metálico, como en este estudio, se pueden preparar secciones ultrafinas adecuadas para microscopía electrónica de transmisión (TEM) utilizando un ultramicrotomo. Sin embargo, es importante señalar que seccionar materiales mineralizados puede reducir significativamente la vida útil del cuchillo de diamante.
  2. Después de teñir las secciones ultrafinas durante 20 minutos en una solución acuosa de acetato de uranilo al 5%.
    NOTA: Al manipular acetato de urano, trabaja dentro de una campana extractora y usa el EPI adecuado. Tras su uso, recoge cualquier disolvente residual en recipientes de residuos claramente etiquetados y químicamente compatibles con tapones correctamente ajustados. Sigue los procedimientos estándar estándar institucionales para el almacenamiento y eliminación segura de residuos químicos peligrosos.
  3. Analiza las secciones usando TEM. Para un análisis exhaustivo, combina la imagen con difracción de electrones de área seleccionada (SAED), espectroscopía de rayos X con dispersión de energía (EDS) y tomografía electrónica.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

El análisis inicial de muestras incrustadas en resina se realiza mediante tomografía microcomputarizada (microCT). Esta técnica no destructiva facilita la visualización 3D de toda la zona del defecto, permitiendo tanto análisis cuantitativos como cualitativos de la muestra. El contraste en la imagen microTC se basa principalmente en las diferencias de densidad de los materiales presentes en la muestra. La Figura 1 ilustra el análisis microCT de un defecto no...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Se han empleado diferentes técnicas de imagen para investigar la arquitectura ósea y evaluar la eficacia de los biomateriales en la inducción de osteointegración 7,21,22,23,24. En este protocolo, establecimos un flujo de trabajo que incorpora microtomografía de rayos X, microscopía óptica y microscopía electrónica para analiza...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores afirman que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo reportado en este artículo.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por becas a los autores de las siguientes agencias brasileñas: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Brasil) y Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). Agradecemos a LABNANO/CBPF y CENABIO/UFRJ las instalaciones de microscopía electrónica. El refinamiento del lenguaje y la revisión gramatical se realizaron usando ChatGPT (OpenAI, GPT-5.1, 2025). Todas las ediciones fueron revisadas y verificadas por los autores.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Acetona Merck67-64-1
Cilindro de aluminiocaserasN/D
Versión de Avizo 2022.1ThermoFisherN/Dsoftware para filtrado de imágenes, segmentación y visualización 3D
Ácido cacodílico, sal sódica, trihidratoTed Pella18851polvo para Cacodylate Buffer. Prepara una solución de stock de 0,2 M
Compuesto de pulido de diamante 3 y micro; Tamaño mTed Pella895-8
Compuesto de pulido de diamante 6 y micro; Tamaño mTed Pella895-9
Rueda de diamante x.006Tecnología South BayDWH 3063
Rueda de diamante x.012Tecnología South BayDWH 4122
Tela de fieltro para pulirTed Pella816-20
Cápsulas de Incrustación PlanaEMS70021
Engobe de tapa de cristalKnittelN/D
Corredera de vidrioKnittelN/D
Glutaraldehído, 25% grado electromagnéticoTed Pella18426/18427
Sputter dorado K550XEMITECHN/D
ImageJInstitutos Nacionales de Salud (NIH)software para la configuración de imágenes, filtrado, segmentación y visualización 3D
IMOD versión 5.1Universidad de Coloradosoftware para la visualización de imágenes, segmentación y visualización 3D
Máquina de Pulido ChapadoTecnología South BayModelo 910
Sierra de rueda de diamante de baja velocidad  Tecnología South BayModelo 650
Kit de incrustación de baja viscosidadEMS14300Kit para resina SPURR. Prepárate según las especificaciones de la hoja de datos y la hoja de datos;
Micro-CT Skyscan 1273 BrukerN/D
Microscopio Jeol 2100F 200kV JeolN/D
Microscopio Olympus BX51OlimpoN/D
Microscopio Tescan Lyra3TescanN/D
Microscope Zeiss AxioplanZeissN/Dequipado con una placa lambda de primer orden
Paraformaldehído, grado EMSigmaP6148Polvo para solución de formaldehído. Prepara una solución stock del 16%
Corredera de plásticoExakt41500
Cera de montaje QuickStick 135Tecnología South BayN/D
Papeles de lija  Tamaños de grano 1200N/DN/D
Papeles de lija  Tamaños de grano 2500N/DN/D
Papeles de lija  Tamaños de grano: 4100N/DN/D
Super PegamentoLoctiteN/D
Refrigerante soluble en agua  Tecnología South BayN/D
Papel filtro Whatmann grado 1sigmaWHA1001150

Referencias

  1. Reznikov, N., Shahar, R., Weiner, S. Bone hierarchical structure in three dimensions. Acta Biomater. 10 (9), 3815-3826 (2014).
  2. Buss, D. J., Kröger, R., McKee, M. D., Reznikov, N. Hierarchical organization of bone in three dimensions: A twist of twists. J Str Biol: X. 6, (2022).
  3. Grandfield, K., Gustafsson, S., Palmquist, A. Where bone meets implant: The characterization of nano-osseointegration. Nanoscale. 5 (10), 4302-4308 (2013).
  4. Loi, F., Córdova, L. A., Pajarinen, J., Lin, T., Yao, Z., Goodman, S. B. Inflammation, fracture and bone repair. Bone. 86, 119-130 (2016).
  5. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
  6. Shah, F. A., Thomsen, P., Palmquist, A. Osseointegration and current interpretations of the bone-implant interface. Acta Biomater. 84, 1-15 (2019).
  7. Palmquist, A. A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration. J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).
  8. Sim, J. H., Yeo, I. S. Light Microscopy Analysis of Bone Response to Implant Surfaces. Microsc Today. 24 (4), 28-33 (2016).
  9. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  10. Müller, R. Hierarchical microimaging of bone structure and function. Nat Rev Rheumatol. 5 (7), 373-381 (2009).
  11. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  12. Buss, D. J., Reznikov, N., McKee, M. D. Crossfibrillar mineral tessellation in normal and Hyp mouse bone as revealed by 3D FIB-SEM microscopy. J Str Biol. 212 (2), 107603(2020).
  13. Binkley, D. M., Deering, J., Yuan, H., Gourrier, A., Grandfield, K. Ellipsoidal mesoscale mineralization pattern in human cortical bone revealed in 3D by plasma focused ion beam serial sectioning. J Str Biol. 212 (2), 107615(2020).
  14. Reznikov, N., Almany-Magal, R., Shahar, R., Weiner, S. Three-dimensional imaging of collagen fibril organization in rat circumferential lamellar bone using a dual beam electron microscope reveals ordered and disordered sub-lamellar structures. Bone. 52 (2), 676-683 (2013).
  15. Reznikov, N., Bilton, M., Lari, L., Stevens, M. M., Kröger, R. Fractal-like hierarchical organization of bone begins at the nanoscale. Science. 360 (6388), 2189(2018).
  16. Grandfield, K., Vuong, V., Schwarcz, H. P. Ultrastructure of Bone: Hierarchical Features from Nanometer to Micrometer Scale Revealed in Focused Ion Beam Sections in the TEM. Calcified Tissue Int. 103 (6), 606-616 (2018).
  17. Micheletti, C., et al. mineral organization at the mesoscale: A review of mineral ellipsoids in bone and at bone interfaces. Acta Biomater. 142, 1-13 (2022).
  18. Micheletti, C., Shah, F. A. Bone hierarchical organization through the lens of materials science: Present opportunities and future challenges. Bone Rep. 22, (2024).
  19. Shah, F. A., Ruscsák, K., Palmquist, A. 50 years of scanning electron microscopy of bone-a comprehensive overview of the important discoveries made and insights gained into bone material properties in health, disease, and taphonomy. Bone Res. 7 (1), (2019).
  20. Georgiadis, M., Müller, R., Schneider, P. Techniques to assess bone ultrastructure organization: Orientation and arrangement of mineralized collagen fibrils. J Royal Soc Interface. 13 (119), (2016).
  21. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  22. Keklikoglou, K., et al. Micro-computed tomography for natural history specimens: a handbook of best practice protocols. Eur J Taxonomy. (522), (2019).
  23. Peddie, C. J., et al. Volume electron microscopy. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 51(2022).
  24. Costa De-Moraes, S. L., et al. Histomorphometric and microtomographic evaluation of hydroxyapatite coated implants and L-PRF in over drilled bone sites in sheep. Sci Rep. 15 (1), 14761(2025).
  25. Liu, Y., Xie, D., Zhou, R., Zhang, Y. 3D X-ray micro-computed tomography imaging for the microarchitecture evaluation of porous metallic implants and scaffolds. Micron. 142, (2021).
  26. Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography. J Vis Exp. (190), e64262(2022).
  27. Ramezanzadehkoldeh, M., Skallerud, B. H. MicroCT-based finite element models as a tool for virtual testing of cortical bone. Med Eng Physics. 46, 12-20 (2017).
  28. Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
  29. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
  30. Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
  31. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  32. Zaborowska, M., Shah, F. A., Trobos, M., Palmquist, A. Retrieval, sample processing, and analyses of bone-anchored implants. Bone Repair Biomater Regenerat Clin Appl Second Edition. , 447-466 (2018).
  33. Thorfve, A., Palmquist, A., Grandfield, K. Three-dimensional analytical techniques for evaluation of osseointegrated titanium implants. Mater Sci Technol. 31 (2), 174-179 (2015).
  34. Mastrogiacomo, M., Campi, G., Cancedda, R., Cedola, A. Synchrotron radiation techniques boost the research in bone tissue engineering. Acta Biomater. 89, 33-46 (2019).
  35. Raguin, E., Rechav, K., Shahar, R., Weiner, S. Focused ion beam-SEM 3D analysis of mineralized osteonal bone: lamellae and cement sheath structures. Acta Biomater. 121, 497-513 (2021).
  36. McMahon, G., Malis, T. Ultramicrotomy of nanocrystalline materials. Microscopy Res Tech. 31 (4), 267-274 (1995).
  37. Bassim, N. D., et al. Minimizing damage during FIB sample preparation of soft materials. J Microsc. 245 (3), 288-301 (2012).
  38. Witzke, K., et al. Comparative Sample Preparation Using Focused Ion Beam and Ultramicrotomy of Human Dental Enamel and Dentine for Multimicroscopic Imaging at Micro- and Nanoscale. Materials. 15 (9), 3084(2022).
  39. Carter, J. L. W., Karakulak Uz, T., Ibrahim, B., Pigott, J. S., Gordon, J. V. A comparison of energy dispersive spectroscopy in transmission scanning electron microscopy with scanning transmission electron microscopy. Ultramicroscopy. 270, 114106(2025).
  40. Grandfield, K., McNally, E. A., Palmquist, A., Botton, G. A., Thomsen, P., Engqvist, H. Visualizing biointerfaces in three dimensions: electron tomography of the bone-hydroxyapatite interface. J Royal Soc Interface. 7 (51), 1497-1501 (2010).
  41. Grandfield, K., Palmquist, A., Engqvist, H. Three-dimensional structure of laser-modified Ti6Al4V and bone interface revealed with STEM tomography. Ultramicroscopy. 127, 48-52 (2013).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Imagen MultimodalReparaci n seaEvaluaci n de BiomaterialesInterfaz Hueso BiomaterialMicroscop a de Luz PolarizadaMicroscop a Electr nica de BarridoMicroscop a Electr nica de Transmisi nEnerg a Dispersiva de Rayos X
Enfoque multimodal para evaluar la regeneración ósea y el rendimiento en andamios
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.