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Artículo de método

Cultivo de ovarios neonatales en ratones y cuantificación de folículos de montaje completo: un enfoque in vitro eficiente para estudiar la regulación primordial del folículo

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DOI:

10.3791/69498

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19 de diciembre de 2025

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1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, 2Division of Biological Sciences, University of Missouri

En este artículo

Resumen

Este estudio presenta protocolos para el cultivo de ovarios postnatales de ratón en insertos de membrana y para la cuantificación folicular de montaje completo en un ovario completo. Los resultados demostraron que el manejo técnico durante el cultivo de ovarios afecta significativamente al recuento de folículos primordiales, lo que subraya la importancia de mantener la consistencia para minimizar la variación no biológica.

Resumen

En mamíferos femeninos, los folículos primordiales se forman durante el desarrollo ovárico fetal y sirven como la única fuente para mantener la función ovárica adulta. Los mecanismos subyacentes a cómo se ensamblan los folículos primordiales, mantienen la dormencia, se activan para el desarrollo folicular y sufren la muerte celular son importantes para comprender la fisiología ovárica y las condiciones patológicas. Este estudio presenta un protocolo para cultivar ovarios de ratón posnatales en inserciones de membrana, un enfoque que permite el cultivo y tratamiento farmacéutico de ovarios intactos durante hasta 10 días, dependiendo de la etapa de desarrollo del ovario. Los cambios en las condiciones del cultivo pueden lograrse transfiriendo insertos que contienen ovarios cultivados entre pozos en una placa, evitando así interferencias físicas con los tejidos durante el cultivo. Por ejemplo, los ovarios P5 se aislaron y cultivaron en un inserto de 12 mm en una placa de 24 pozos. Cada ovario se separó dentro de una gota de medio DMEM/F12 suplementado con 10% FBS, 3 mg/mL de BSA, 10 mIU/mL de FSH y antibiótico-antimicótico, y se estabilizó suavemente en la inserción de membrana. El medio se cambiaba cada dos días y la cultura se mantenía durante un total de cinco días. Tras el cultivo, los ovarios se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 2 horas y se procesaron para la tinción total de anticuerpos del marcador de ovocitos DDX4. Los folículos se escalonaron y cuantificaron en función del tamaño del ovocito y la morfología nuclear de las células foliculares somáticas. Los resultados mostraron que el número de folículos primordiales en cada ovario se veía significativamente afectado por la correcta colocación de los tejidos en la inserción de membrana. Además, las diferencias en el número de ovarios de cada inserción pueden introducir variaciones no biológicas y deben evitarse.

Introducción

La oogénesis es un proceso altamente regulado y complejo que da lugar a la producción de ovocitos maduros. En los mamíferos, la oogénesis comienza en los ovarios fetales, donde las células germinales primordiales (PGCs) se diferencian en ovocitos primarios. Cada ovocito primario está encerrado por una capa de células escamosas pregranulosas, formando un folículo primordial. La mayoría de estos folículos primordiales se vuelven latentes tras su formación, sirviendo como reservaovárica 1,2,3. En el ovario adulto, la activación periódica de los folículos primordiales para el desarrollo folicular, conocida como foliculogénesis, es esencial para mantener la producción de ovocitos maduros y hormonas esteroides ováricas 4,5. En ausencia de señales de activación, los folículos primordiales humanos pueden permanecer inactivos hasta 50 años. La prolongada latencia puede contribuir a una reducción de la calidad de los ovocitos, así como a un aumento de la pérdida de folículos primordiales en ovariosenvejecidos 6. Los mecanismos subyacentes a cómo se activa un conjunto específico de folículos mientras otros permanecen inactivos y sufren muerte celular periódica siguen siendo incógnitas.

El proceso de oogénesis está altamente conservado en mamíferos, lo que convierte a los ratones en un modelo ideal para estudiar la oogénesisde mamíferos 7. En ratones, la formación primordial del folículo se completa en el día postnatal 4 (P4). Una pequeña proporción de folículos primordiales experimenta un desarrollo folicular inmediatamente después de su formación. Durante el desarrollo del folículo, el ovocito aumenta de tamaño debido a la organogénesis mejorada y a la síntesis de ARNm yproteínas 4. Las células de la granulosa escamosa hacen la transición a células de la granulosa cuboidal y se vuelvenproliferativas 8. Estos folículos en desarrollo crecen hasta la etapa ovulatoria alrededor del día 21, que es cuando las ratones hembras alcanzan la pubertad. Esta fase del desarrollo folicular en los ovarios postnatales se conoce comúnmente como 'foliculogénesis de primera ola'. Dado que la foliculogénesis de primera ola refleja de cerca el proceso de desarrollo folículolar, los ovarios de ratón postnatales proporcionan un modelo ideal para estudiar la regulación folicular primordial y la foliculogénesisovárica 9.

La clasificación de los folículos ováricos se basa principalmente en la morfología nuclear de las células foliculares somáticas y en el tamaño del ovocito. En los ovarios de ratón, el folículo primordial latente se identifica por una única capa de células pregranulosas escamosas que encierran un ovocito primario, que tiene un diámetro de aproximadamente 20 μm. Los folículos en desarrollo pueden clasificarse en folículos primarios, secundarios, terciarios y antrales. El folículo primario contiene un ovocito que suele medir más de 25 μm de diámetro y está rodeado por una única capa de células cúbicas de la granulosa (Figura suplementaria 1). El folículo secundario presenta dos capas de células de la granulosa, mientras que el folículo terciario comprende tres o más capas de células de la granulosa. El folículo antral es más grande que el folículo terciario, contiene múltiples capas de células de la granulosa y posee una cavidad llena de líquido conocida como antro. A medida que se desarrollan los folículos, el ovocito aumenta de tamaño, alcanzando aproximadamente 80 μm en el momento de la ovulación. Además, los folículos en desarrollo están rodeados por varias capas de células tecas delgadas, que se encuentran fuera de las células de lagranulosa 10,11,12.

El tamaño relativamente pequeño de los ovarios postnatales de ratón convierte en el cultivo completo de ovarios un enfoque práctico para la investigación. Este método permite eficazmente el estudio del desarrollo ovárico y folículo dentro de un ovario intacto, ya que preserva los microambientes físicos y fisiológicos mientras minimiza la interferencia de los tejidoscircundantes 12. Este enfoque permite realizar experimentos que serían difíciles de realizar en modelos in vivo. Ejemplos incluyen imágenes en vivo del desarrollo ovárico, tratamientos multifármacos controlados en el tiempo y el análisis de la actividad secretora ovárica mediante perfilado proteico del mediode cultivo 13,14. Además, este enfoque puede aplicarse para investigar el efecto de los factores secretores sin interacción directa célula-célula mediante experimentos de co-cultivo. En estos experimentos, diferentes tipos de tejidos pueden colocarse en insertos de membrana separados dentro de un medio compartido15. Además, el uso condicional de ovarios de ratón con eliminación genética in vitro podría ayudar a dilucidar mecanismos clave implicados en la activación y crecimiento del folículo primordial.

En este artículo, presentamos métodos para cultivar ovarios de ratón posnatales utilizando inserciones de membrana y para la cuantificación de folículos de montaje completo en un ovario completo (Figura 1). Las técnicas descritas aquí incluyen 1) disección de ovarios neonatales de ratón, 2) cultivo de ovarios neonatales de ratón, 3) cambio de medios durante el cultivo, 4) fijación tisular y tinción de anticuerpos de montaje completo, y 5) imagen tisular y cuantificación de folículos. Además, este estudio empleó doxorubicina para inducir experimentalmente la pérdida folicular primordial, proporcionando un modelo para investigar los mecanismos subyacentes al agotamiento de la reserva ovárica. Los resultados mostraron que el número de ovarios por inserto y su posición dentro del inserto durante el cultivo influyeron en el recuento de folículos primordiales. Esto pone de manifiesto la importancia de mantener una configuración de cultivo consistente para evitar variaciones no biológicas en los resultados experimentales.

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Protocolo

Los ratones macho y hembra de CD-1 fueron alojados juntos en una proporción de 1:1 como parejas reproductoras. La fecha de nacimiento de los nuevos cachorros se designó como día postnatal 0. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Misuri (número de protocolo: 36647).

1. Reactivos y medios culturales

  1. Todos los reactivos utilizados en este estudio están listados en la Tabla de Materiales. Prepara todos los materiales y medios antes del cultivo de ovarios.
  2. Medios de cultivo: Elaborar ~5 mL de medios DMEM/F-12 suplementados con 3 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA), suero fetal bovino al 10% (FBS) y 10 mIU/mL hormona folicular-estimulante (FSH).
    NOTA: El medio debe prepararse de nuevo añadiendo las reservas de BSA (30 mg/mL), FBS y FSH (10 IU/mL) al medio DMEM/F-12. Equilibrar el medio en una placa de Petri durante unos 30 minutos en una incubadora con 5% de CO2 a 37 °C. Guarda los caldos a -20 °C y déjalos descongelar inmediatamente antes de usarlos. Existencias alicuotas en volúmenes adecuados para evitar congelaciones y descongelaciones repetidas.

2. Cultivo de ovarios

  1. Eutanasia a las ratones P5 decapitándolas. Retira los ovarios y el tejido bursa adherido usando tijeras quirúrgicas y pinzas. Colocar los ovarios en una placa de Petri de 60 mm con suero salino fosfatado de Dulbecco (DPBS) previamente refrigerado que contiene antibiótico-antimicótico (Figura 2A,B).
  2. Utilizando un par de jeringuillas de insulina (1 mL), disecciona y extirpa el tejido bursa del ovario bajo un estereoscopio (Figura 2C,D). Transfiere los ovarios usando una pipeta de 1 mL a una placa de Petri de 30 mm que contenga 3 mL de medio de cultivo y coloque la bandeja en una incubadora deCO2.
    NOTA: Evita pinchar o apretar los ovarios. Realiza incisiones limpias y uniformes a través de la bursa ovárica usando jeringuillas de insulina para liberar el ovario. Prellena la punta de la pipeta con aproximadamente 50 μL de medio, coloca la punta junto al ovario y aspira la punta para la transferencia.
  3. Bajo la campana de flujo laminar, prepare la placa colocando 400 μL de medio y un inserto en cada pozo (Figura 2E, E'). El medio está fuera del inserto, y la membrana del inserto se vuelve opaca una vez que es empapado por el medio.
  4. Para el cultivo con tratamiento Dox de 24 horas, preparar un medio que contenga Dox a una concentración de 0,1 mg/mL fresco, diluyendo el material Dox (10 mg/mL) con el medio.
    NOTA: Los medios que contengan Dox deben ser eliminados adecuadamente de acuerdo con las directrices de los comités institucionales de bioseguridad y salud y seguridad ambiental.
  5. Bajo un estereoscopio, transfiere hasta tres ovarios a un inserto usando una pipeta de 1 mL (Figura 2F,G). Minimiza la cantidad de material transferido al inserto y elimina inmediatamente cualquier excedente de medio tras la transferencia. Una vez que los ovarios se colocan suavemente en el inserto, utiliza una pipeta de 200 μL para transferir aproximadamente 200 μL de medio desde el pozo al inserto, asegurándote de que la membrana esté completamente cubierta por el medio. Transfiere el medio de nuevo al pozo y centra los ovarios en la membrana. Rellena la punta de la pipeta con medio de cultivo para evitar que el ovario sea absorbido hacia la punta al centrarlo. Asegúrese de dejar suficiente espacio entre los ovarios y que estén estabilizados en el inserto de membrana (Figura 2H), en lugar de permanecer suspendidos en el medio (Figura 2I). Ten cuidado de no pinchar los ovarios ni la membrana.
  6. En una cultura de 5 días, se cambia el medio cada dos días retirando 200 μL de medio (la mitad del total) del pozo y añadiendo 200 μL de medio fresco de cultivo al pozo (Figura 2J).
  7. Para el cultivo con tratamiento farmacológico de 24 horas, transfiere el inserto con ovarios a un nuevo pozo con 400 μL de medio de cultivo fresco tras las primeras 24 horas, siguiendo los siguientes pasos:
    1. Retira el inserto que contiene los ovarios del pozo usando un par de pinzas.
    2. Enjuaga brevemente la parte inferior del inserto sumergiéndolo en un recipiente de 60 mm con medio fresco de cultivo.
    3. Golpea suavemente la parte inferior del inserto en un plato vacío de 60 mm para eliminar el exceso de material del inserto. Coloca el inserto en el pozo con medios de cultivo frescos.
      NOTA: Retira el exceso de medio del inserto para asegurarte de que los ovarios se estabilizan en la membrana inmediatamente después de cambiar el medio o transferir el inserto.

3. Fijación e inmunotinción de montaje completo

  1. Para fijar los ovarios cultivados, retira el inserto de la placa usando un par de pinzas y colócalo en una placa de Petri de 60 mm que contiene 5 mL de DPBS. Transfiere aproximadamente 100 μL de DPBS junto a los ovarios y resuspendilos usando una pipeta de 1 mL.
  2. Utilizando una pipeta de 1 mL, transfiere los ovarios del inserto a un tubo Eppendorf de 1,5 mL. Retira el DPBS del tubo y añade 500 μL de paraformaldehído al 4%. Fija los ovarios a 4°C durante 2 horas.
    NOTA: Puede que el extremo de la punta de la pipeta necesite ser recortado más ancho para evitar dañar los tejidos si los ovarios son demasiado grandes para atravesarlo.
  3. Lava los ovarios fijos con 1 mL dePBST 2 (PBS, 0,1% Tween [v/v], 0,5% Triton [v/v]) al menos tres veces, 1 hora cada uno sobre un agitador giratorio. Se recomienda dejar los tejidos en PBST2 durante la noche (12-16 horas) a 4 °C para mejorar la penetración de los anticuerpos.
    NOTA: Esto puede ser un punto de parada; los tejidos pueden almacenarse enPBST 2 hasta tres días antes de la incubación primaria de anticuerpos.
  4. Incubar los ovarios con helicasa anti-dead-box 4 (DDX4) en 100 μL de buffer de dilución de anticuerpos (1% BSA [p/v], 10% suero de burro [v/v], 0,1 M glicina, 0,1% Tween y 0,5% Triton en PBS) con una dilución de 1/400 (2,3 μg/mL) a 4 °C durante 12-16 horas.
  5. Al día siguiente, retira el anticuerpo primario y añade 1 mL dePBST 2 al tubo. Lava los pañuelos al menos tres veces, 1 hora cada una en un agitador giratorio.
    NOTA: Esto puede ser un punto de parada; los tejidos pueden permanecer en PBST2 hasta tres días después de la incubación primaria de anticuerpos.
  6. Diluir el anticuerpo secundario donkey anti-rabbit AF488 a una dilución de 1/500 (1,5 μg/mL) enPBST 2. Incubar el tejido con al menos 100 μL del anticuerpo secundario diluido a 4 °C durante 12-16 horas.
  7. Al día siguiente, lava los pañuelos a fondo enPBST 2 al menos tres veces, 1 hora cada una en un agitador giratorio. Se recomienda lavar los pañuelos hasta 8 horas para reducir el fondo. Asegúrate de cubrir los tubos con papel de aluminio para protegerlos de la luz de este paso adelante.
  8. RetiraPBST 2 y añade 100 μL de DAPI a una dilución de 1/1000 (1 μg/mL) en PBS al tubo. Incuba los tejidos en DAPI durante 30 minutos a temperatura ambiente.
  9. Lava los ovarios en PBST2 una vez durante 30 minutos y móntalos en una lámina microscópica con un separador de imagen. Transfiere los ovarios al centro del separador usando una pipeta de 1 mL y elimina el exceso dePBST 2. Añade unos 5 μL del medio de montaje antidesvanecimiento y coloca una lámina de microscopio en la parte superior del separador. Sella los bordes del separador con esmalte transparente para almacenarlo a largo plazo.
    NOTA: Antes de imaginar las correderas, asegúrate de que el esmalte esté completamente seco y que no haya medio de montaje en el exterior de la funda de la cubierta. Estos reactivos pueden dañar los objetivos del microscopio. Además, evita usar un exceso de soporte de montaje, ya que los ovarios deben permanecer inmóviles durante la imagen.
  10. Fotografía los ovarios con un microscopio confocal a una ampliación de 10x con un tamaño Z-step de 10 μm. Ajusta la configuración y usa la compensación Z (ganancia de excitación) para obtener imágenes de todo el ovario. Esto se puede hacer siguiendo los siguientes pasos:
    1. Ajusta la potencia de excitación y la ganancia del detector monitorizando la saturación de la señal usando el histograma, ya que puede variar entre tejidos. Empieza con poca potencia láser y aumenta gradualmente según sea necesario.
    2. Para obtener imágenes de regiones más profundas, activa la compensación Z para el detector de ganancia, ya que la intensidad de la señal puede disminuir con la profundidad. Utiliza un promedio de fotogramas de al menos 10 y activa el escaneo X bidireccional a una velocidad de 600 Hz.
      NOTA: Con estos ajustes, la imagen no debe superar los 10 minutos por ovario (~200 μm). La tinción inmunofluorescente de montaje completo de los ovarios con anti-DDX4 suele ser robusta y rara vez se blanquea con fotoblanqueo.

4. Cuantificación del folículo

  1. Para cuantificar los folículos en cada ovario, abre las imágenes usando el software ImageJ. Al abrir, asegúrate de que el modo de color está seleccionado como coloreado y que los canales divididos están marcados en la casilla debajo de separado en ventanas separadas. Selecciona la imagen de interés y luego usa la herramienta imagen/transformación/rotación para colocar el ovario simétricamente en la imagen.
    NOTA: Las imágenes adquiridas por el confocal pueden verse y analizarse en 3D usando el software Imaris (Figura 3A,B) o el softwareImageJ 16.
  2. Utiliza la herramienta de analizar/herramientas/cuadrícula para dividir el ovario en cuadrículas (Figura 3C, C').
  3. Usa la herramienta plugins/analizar/contador de células para marcar todas las cuadrículas que cubren el ovario (Figura 3D, D', cuadrículas marcadas por 4). De estas cuadrillas, marque cada dos cuadrículas en cada fila para la cuantificación de los folículos (Figuras 3E, E', cuadrículas marcadas con 8). Las rejillas en el borde del ovario que tengan menos de 10 ovocitos no se incluyen para la cuantificación del folículo.
    NOTA: Inicializa el contador de celdas y elige los tipos de contadores que consideres fáciles de leer.
  4. Los ovocitos pueden identificarse por la presencia de una estructura en forma de anillo positiva para DDX4 que rodea un núcleo que es positiva para DAPI. Los folículos primordiales tienen ovocitos de aproximadamente 20 μm de diámetro rodeados por células somáticas escamosas. Los folículos en desarrollo tienen ovocitos de más de 25 μm de diámetro y rodeados por una o más capas de células de la granulosa cuboidal (Figura suplementaria 1).
  5. Cuenta los folículos primordiales en cada cuadrícula marcada (como se ve en la Figura 3E, E' con el contador Tipo 8). Repasa los folículos usando secciones/pilas ópticas en la cuadrícula y márcalos con la herramienta de contador celular, respectivamente. Asegúrate de no contar dos veces los folículos primordiales en dos secciones o pilas ópticas consecutivas. Contar folículos en desarrollo en todas las rejillas marcadas con contraataque tipo 4.
    NOTA: Usa la opción de zoom para ayudar a visualizar y contar los ovocitos a través de las pilas.
  6. Calcula el número de folículos primordiales en todo el ovario (nf) multiplicando el número medio de folículos primordiales por cuadrícula (nfgrid) por el número de rejillas que abarcan el ovario (ngrids). nf = cuadrícula nf × ngrids.
    NOTA: Se realizaron análisis estadísticos y se generaron gráficos utilizando el software Prism 10.2.0 (GraphPad Software, versión 10, Inc., CA). Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Se consideró la significación estadística en p < 0,05. Los datos se presentan como la media ± error estándar (SE).

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Resultados

En este artículo, demostramos los métodos de cultivo neonatal de ovarios, tinción de anticuerpos de montaje completo, imagen confocal y cuantificación de folículos para evaluar si el número y la posición de los ovarios en el inserto durante el cultivo afectan al resultado experimental, concretamente, al recuento de folículos en el ovario. Cultivamos ovarios con las siguientes configuraciones: uno, dos o tres ovarios por inserto para cultivo estabilizado, y tres ovarios por inserto para cultivo flotante. Los ovarios se cu...

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Discusión

En este estudio, demostramos métodos para el cultivo de ovarios neonatales en ratones y para la cuantificación de folículos ováricos de montaje completo. El enfoque de cultivo puede sostener folículos primordiales y en desarrollo temprano in vitro. El método de cuantificación del folículo de montaje completo requiere un procesamiento mínimo del tejido, lo que ahorra tiempo y preserva la integridad del tejido, asegurando una cuantificación precisa del folículo.

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R35GM158131. EADM contó con el apoyo de la Fundación Lalor. Los autores agradecen sinceramente al University of Missouri Advanced Light Microscopy Core por su apoyo y asistencia en este trabajo

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de cultivo celular de 24 pozosFisher Scientific y nbsp;09-761-146 
Alexa Fluor 488 Anti-Conejo BurroLaboratorios de Inmunoinvestigación Jackson711-546-152
Anti-Anti (100X)Gibco15240-062
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA1470-25G
Ratón CD-1 IGSLaboratorios Charles River & nbsp;022Ratones
Insertos de cultivo celularMilliporePICM01250
Jeringuilla de insulina Comfort Point con aguja 1cc 28G x 1/2Exel26027
DAPITermo Científica62248
DDX4 Rabbit mAbABCAMab13840
DMEM/F12 (1:1) (1X)Gibco11320-033
Doxorubicina clorhidrato Sigma-AldrichPHR1789
DPBS (1X)Gibco14190-144
Suero fetal bovinoSigma-AldrichF0926-500ML
Fiyi-ImageJNIH, EE. UU. (https://imagej.net/ij/)ImageJ 1.52p
Mezcladores nutantes Fisherbrand - Velocidad variableFisher Scientific y nbsp;88-861-043Shaker
Hormona folículo-estimulanteSigma-AldrichF4021-10UG
Forma Steri-Cycle i160Termo Científica y Comercio;i160Incubadora de CO2
GlicinaFisher Scientific y nbsp;BP381-500
Imaris Oxford Instruments (https://imaris.oxinst.com/)Imaris 10.2
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsSN 8100001409Confocal
Suero normal de burroLaboratorios de Inmunoinvestigación Jackson017-000-121
Olympus SZ61Microscopios OlympusSZ61Estereoscopio
Paraformaldehído Fisher Scientific y nbsp;15714
Espaciador de imagen SecureSealGrace Bio-Labs654002
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500ML
PREADOLESCENTES 20Sigma-AldrichP1379-500ML
Medio de montaje antifade VECTASHIELDLaboratorios VectorH-1000

Referencias

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