Cultivo de ovarios neonatales en ratones y cuantificación de folículos de montaje completo: un enfoque in vitro eficiente para estudiar la regulación primordial del folículo

Edgar  A. Diaz Miranda; Grace Anne Dyer; Faith Wilson; Mariel English; Emma Parry; Taylor VanDeVoorde; Lei Lei

doi:10.3791/69498

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Cultivo de ovarios neonatales en ratones y cuantificación de folículos de montaje completo: un enfoque in vitro eficiente para estudiar la regulación primordial del folículo

723 visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/69498

⸱

19 de diciembre de 2025

Edgar A. Diaz Miranda¹ , Grace Anne Dyer¹ , Faith Wilson¹^,² , Mariel English¹ , Emma Parry¹^,² , Taylor VanDeVoorde¹ , Lei Lei¹^,²

¹Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, ²Division of Biological Sciences, University of Missouri

En este artículo

Resumen

Este estudio presenta protocolos para el cultivo de ovarios postnatales de ratón en insertos de membrana y para la cuantificación folicular de montaje completo en un ovario completo. Los resultados demostraron que el manejo técnico durante el cultivo de ovarios afecta significativamente al recuento de folículos primordiales, lo que subraya la importancia de mantener la consistencia para minimizar la variación no biológica.

Resumen

En mamíferos femeninos, los folículos primordiales se forman durante el desarrollo ovárico fetal y sirven como la única fuente para mantener la función ovárica adulta. Los mecanismos subyacentes a cómo se ensamblan los folículos primordiales, mantienen la dormencia, se activan para el desarrollo folicular y sufren la muerte celular son importantes para comprender la fisiología ovárica y las condiciones patológicas. Este estudio presenta un protocolo para cultivar ovarios de ratón posnatales en inserciones de membrana, un enfoque que permite el cultivo y tratamiento farmacéutico de ovarios intactos durante hasta 10 días, dependiendo de la etapa de desarrollo del ovario. Los cambios en las condiciones del cultivo pueden lograrse transfiriendo insertos que contienen ovarios cultivados entre pozos en una placa, evitando así interferencias físicas con los tejidos durante el cultivo. Por ejemplo, los ovarios P5 se aislaron y cultivaron en un inserto de 12 mm en una placa de 24 pozos. Cada ovario se separó dentro de una gota de medio DMEM/F12 suplementado con 10% FBS, 3 mg/mL de BSA, 10 mIU/mL de FSH y antibiótico-antimicótico, y se estabilizó suavemente en la inserción de membrana. El medio se cambiaba cada dos días y la cultura se mantenía durante un total de cinco días. Tras el cultivo, los ovarios se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 2 horas y se procesaron para la tinción total de anticuerpos del marcador de ovocitos DDX4. Los folículos se escalonaron y cuantificaron en función del tamaño del ovocito y la morfología nuclear de las células foliculares somáticas. Los resultados mostraron que el número de folículos primordiales en cada ovario se veía significativamente afectado por la correcta colocación de los tejidos en la inserción de membrana. Además, las diferencias en el número de ovarios de cada inserción pueden introducir variaciones no biológicas y deben evitarse.

Introducción

La oogénesis es un proceso altamente regulado y complejo que da lugar a la producción de ovocitos maduros. En los mamíferos, la oogénesis comienza en los ovarios fetales, donde las células germinales primordiales (PGCs) se diferencian en ovocitos primarios. Cada ovocito primario está encerrado por una capa de células escamosas pregranulosas, formando un folículo primordial. La mayoría de estos folículos primordiales se vuelven latentes tras su formación, sirviendo como reserva^ovárica ^1,2,3. En el ovario adulto, la activación periódica de los ....