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Pruebas de esfuerzo de Mito y glucólisis en placa única utilizando células adherentes o no adherentes

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DOI:

10.3791/69504

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22 de mayo de 2026

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1Department of Biochemistry, Cancer Biology, Neuroscience and Pharmacology, School of Medicine, Meharry Medical College, 2Department of Biomedical Sciences, School of Graduate Studies, Meharry Medical College, 3Host-Tumor Interactions Research Program, Vanderbilt-Ingram Comprehensive Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Vanderbilt Institute for Infection, Immunology and Inflammation, Vanderbilt University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Este estudio presenta protocolos optimizados para realizar análisis metabólicos en tiempo real de pruebas de estrés de Mito y de glicólisis simultáneamente en la misma placa. Los procedimientos están adaptados tanto a células adherentes (BMDM) como a células no adherentes (linfocitos), permitiendo una evaluación precisa, reproducible y paralela de la función mitocondrial y glicolítica de las células de interés.

Resumen

El análisis metabólico en tiempo real proporciona mediciones sin etiquetas de la respiración mitocondrial y la glucólisis, permitiendo a los investigadores vincular el metabolismo energético celular con los mecanismos de la enfermedad y las respuestas terapéuticas en diversos campos. Al comparar el metabolismo energético entre diferentes ratones, otros animales, humanos o células bajo distintos tratamientos, es fundamental realizar mediciones en una sola prueba para asegurar resultados precisos y fiables. Además, el diseño experimental debe considerar el tipo celular analizado, por ejemplo, si son adherentes, como los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM), o no adherentes, como los linfocitos. Por ello, se desarrolló un protocolo que permite realizar simultáneamente pruebas de estrés de Mito y pruebas de esfuerzo por glucólisis en la misma placa, a pesar de que los ensayos requieren inyecciones de fármacos y programas analíticos distintos. Se optimizaron protocolos de manipulación separados para el análisis tanto de células altamente adherentes (por ejemplo, BMDM) como de células "flotantes" no adherentes (por ejemplo, células T y otros linfocitos). Aquí se presentan protocolos detallados para realizar estos ensayos de forma eficiente y reproducible.

Introducción

El Analizador XF de Seahorse es un instrumento único que permite medir en tiempo real la respiración mitocondrial y la glucólisis en muchos tipos celulares. Al cuantificar simultáneamente la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR), esta tecnología permite una disección precisa de vías bioenergéticas bajo condiciones fisiológicas o de estrés. Su versatilidad lo ha hecho indispensable en diversas áreas de investigación, incluyendo cáncer1,neurociencia 2,inmunología 3,envejecimiento 3, 4 y 5 y descubrimientode fármacos 6, donde la reprogramación metabólica es una característica distintiva de la progresión de la enfermedad y la respuesta terapéutica. Al vincular la bioenergética funcional con fenotiposcelulares 7,8, el análisis proporciona una plataforma poderosa para descubrir mecanismos, identificar vulnerabilidades metabólicas y evaluar los efectos de intervenciones genéticas o farmacológicas.

En muchas disciplinas, comparar los efectos inmediatos de fármacos, moléculas pequeñas, citocinas o compuestos naturales sobre el metabolismo celular es mejor bajo condiciones experimentales idénticas, la misma placa, tiempo de incubación, parámetros ambientales y hora del día. Por lo tanto, este enfoque consiste en placar células con diferentes tratamientos o antecedentes genéticos en la misma placa y analizarlas simultáneamente para detectar múltiples parámetros metabólicos. Esta estrategia garantiza la comparación más precisa de los cambios relacionados con fármacos o genética en el metabolismo energético celular.

Muchos tipos celulares se comportan de forma diferente en cultivo. Los linfocitos permanecen en suspensión y nunca se adhieren a la placa9, los macrófagos se adhieren fuertemente, dificultando su transferencia, y las células cancerosas proliferan rápidamente pero a ritmos variables según la línea. Estas diferencias presentan desafíos para el análisis metabólico en tiempo real; Por lo tanto, cada tipo de célula en el experimento requiere un protocolo personalizado.

Este artículo ofrece protocolos paso a paso para realizar estos ensayos mediante análisis metabólicos en tiempo real, asegurando eficiencia y reproducibilidad. Estos protocolos pueden aplicarse a todas las versiones de analizadores disponibles en el mercado.

Protocolo

Los ratones fueron atendidos conforme a los procedimientos establecidos en el protocolo del Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) de los Institutos Nacionales de Salud y Cuidado Animal (IACUC) en el Meharry Medical College. Esta institución está acreditada por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International y cumple con la Política del Servicio de Salud Pública para el tratamiento y uso de animales de laboratorio en condiciones libres de patógenos. Los detalles de los reactivos y del equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Optimización para la densidad celular

NOTA: Cada tipo celular presenta características metabólicas únicas y una considerable variación en tamaño. Ambos factores son fundamentales para determinar el número adecuado de celdas a cargar por pozo y así obtener resultados óptimos. Antes de realizar un ensayo experimental inicial, prepara y ejecuta una placa de prueba con las celdas de interés elegidas a diferentes densidades.

  1. Para las células adherentes (por ejemplo, células cancerosas), se evalúan las densidades de siembra que oscilan entre 20.000 y 100.000 células por pozo. Para células altamente metabólicas y/o grandes (por ejemplo, células cancerosas humanas o fibroblastos), la optimización de densidad comienza en 10.000 células o menos por pozo.
  2. Para células no adherentes (por ejemplo, linfocitos), optimizar la densidad de siembra dentro del rango de 100.000–500.000 células por pozo. Para todos los tipos de células, procura una monocapa uniforme de una sola célula para lograr resultados óptimos (véase la Figura 1 como ejemplo la disposición de placas de muestras).
  3. Ejecuta el ensayo de estrés de Mito (como se indica abajo). Los datos de este ensayo preliminar pueden utilizarse para determinar la densidad celular óptima para el experimento principal. Selecciona la densidad que muestre la mayor diferencia entre las condiciones del ensayo.
    NOTA: Este protocolo no se aplica al análisis de muestras 3D (por ejemplo, esferoides celulares, organoides). Sin embargo, puede modificarse para tener en cuenta el grosor de la muestra y la superficie irregular.

2. Preparación para el ensayo

  1. El día antes de ejecutar el ensayo, levanta suavemente el cartucho sensor fuera de la placa de utilidad y añade 200 μL de agua libre de RNAasa/DNAsa a cada pozo de la placa de utilidad, y baja el cartucho sensor dentro de la placa de utilidad hasta que los sensores estén completamente sumergidos en agua.
    NOTA: El nivel del agua debe ser lo suficientemente alto para asegurar que los sensores estén completamente sumergidos durante la noche, ya que los fluoróforos del cartucho del sensor no funcionarán si no están correctamente hidratados. Si se utiliza un XF Hydrobooster para hidratar el cartucho, se puede poner directamente en una solución calibrante y excluir el paso de hidratación del agua.
  2. Coloca el cartucho sensor hidratado/placa de utilidad en una incubadora de 37 °C conCO-less durante la noche. Para evitar la evaporación de la placa, también coloca un recipiente con agua doble destilada en la incubadora.
  3. El día del ensayo, retira el cartucho sensor/placa de utilidad de la incubadora sin CO2 y retira suavemente el cartucho sensor de la placa de utilidad, colocando el cartucho con el sensor hacia arriba sobre el banco.
  4. Descarta el agua de la placa de utilidad y seca con agitación cualquier gota suelta, y añade 200 μL de solución calibrante XF a cada pozo.
  5. Coloca suavemente el cartucho sensor de nuevo en la placa de utilidad para que los sensores queden completamente sumergidos en la solución calibrante y colócalo de nuevo en la incubadora sin CO 2 a 37 °C.

3. Preparación de medios de ensayo

  1. Preparación para medios de Mito Stress:
    1. En un tubo de 50 mL, añade lo siguiente a 45 mL de medio RPMI XF: 500 μL de piruvato de sodio 100x (concentración final: 1 mM), 500 μL de 100x L-glutamina (concentración final: 2 mM) y 550 μL de solución de glucosa al 45% (concentración final: 25 mM)
  2. Ajusta el pH a 7,4. Recarga con XF RPMI medium hasta un volumen final de 50 mL. Mantén el medio preparado en un baño maria o en seco a 37 °C antes de usarlo.
  3. Preparación de medios para ensayos de glucólisis:
    1. En un tubo de 50 mL, añade 250 μL de 100x L-glutamina a 45 mL de medio XF RPMI.
  4. Ajusta el pH a 7,4 y luego recarga con XF RPMI medium hasta un volumen final de 50 mL. Mantén el medio preparado en un baño de agua o seco a 37 °C antes de usarlo.
    NOTA: El pH tanto del medio de ensayo de Mito Stress como del de glucólisis debe reajustarse a 7,4 tras añadir suplementos que alteren el pH, ya que incluso pequeñas desviaciones pueden afectar significativamente los resultados del ensayo.

4. Lavar células y cambiar el medio antes del análisis

NOTA: El paso de lavado de las microplacas de cultivo celular XFe96/XF Pro variará dependiendo de si se utilizan tipos celulares adherentes o no adherentes. Por favor, consulte el paso 9, Adherentes (células cancerosas, células primarias BMDM) y células no adherentes (células T y otros linfocitos), para determinar el mejor método de lavado para el tipo celular utilizado.

  1. Retira entre 160 y 180 μL de medio de crecimiento de cada pozo usando un multipipetador, trabajando fila/columna a la vez para evitar que las células se sequen. Evita tocar el fondo de los pozos.
  2. Utilizando un pipetman de punta única, retirar los 20–30 μL restantes de los pozos, evitando tocar la capa celular en el fondo del pozo.
  3. Añadir 180 μL de medios de ensayo de glucólisis o de mito estrés (véase paso 3) a cada pozo, siguiendo el diseño de la Figura 1. Para evitar alterar la capa celular, dispensa suavemente el medio a lo largo de la pared lateral de cada pozo hasta que todos los pozos estén llenos. Ambos ensayos están en la misma placa.
    NOTA: Los pozos que no contienen células y controlan los pozos también deben llenarse con medios de ensayo.
  4. Coloca la microplaca en una incubadora de 37 °C con CO-less 2 durante 40–45 minutos antes de comenzar el ensayo, y comienza a preparar los fármacos.

5. Preparación del fármaco y carga del cartucho

PRECAUCIÓN: Algunos fármacos (FCCP, Antimicina A/ Rotenona, Oligomicina) son peligrosos y deben manejarse con cuidado. Se necesitan medidas adecuadas para proteger al personal; estas incluyen el uso de guantes y otros equipos de protección individual (EPP), así como la eliminación de materiales en un contenedor o contenedor de residuos químicos aprobado por la institución.

NOTA: La concentración óptima de FCCP/oligomicina depende del tipo celular y, antes del ensayo, se titula empíricamente cuando se trabaja con células particularmente sensibles. Las concentraciones finales pueden variar en los fármacos según el tipo celular. Prepara los medicamentos y los medios de análisis frescos el día del uso. No congeles ni reutilizes. La preparación del fármaco para ensayar puede completarse en este periodo de 45 minutos para obtener resultados óptimos.

  1. Utilizando los medios de ensayo de Mito Stress y Gólisis precalentados del paso 3, diluir los compuestos según la Tabla 1 y/o la Tabla 2 a las concentraciones adecuadas para cada tipo celular. Prepara cada compuesto en un tubo separado de 15 mL (si usas los seis compuestos, serán necesarios seis tubos).
  2. Retirar el cartucho sensor/placa de utilidad de la incubadorasin 2 sin CO de 37 °C y retirar la tapa, colocando cuidadosamente la guía de carga XF que viene con el kit, y la guía de carga XF correspondiente al puerto inyector (Guía A para el puerto A) bien por encima de la parte superior del cartucho sensor (véase la Figura 2).
  3. Utilizando un pipetador multicanal y un reservorio de reactivo para cada fármaco, añade lentamente el volumen necesario al puerto correspondiente (consulte la Tabla 1 y la Tabla 2 para el volumen). Mantenga la pipeta completamente erguida al cargar los fármacos (véase la Figura 2).
  4. Cámbiala o reutiliza después de enjuagar y secar bien la guía de carga según sea necesario para cada puerto (puerto A, B, C y D) y desecha las puntas de la pipeta tras cada carga.
    NOTA: Las puntas de la pipeta deben encajar firmemente en el puerto guía, pero sin apretar demasiado, ya que las puntas pueden quedar atascadas en la guía. Se recomienda probar las puntas/pipetador de la pipeta usados en las guías antes de cargar los compuestos para evitar cargar muestras de forma incorrecta.
  5. Después de cargar todos los compuestos en sus respectivos puertos, retirar la guía, confirmar visualmente que todos los puertos están llenos y asegurar el cartucho con su tapa. Los fármacos deben corresponder al ensayo en cada parte de la misma placa (Figura 1).
    NOTA: Las concentraciones finales recomendadas para el estrés de Mito son 1 μM de oligomicina, 1 μM de FCCP y 0,5 μM de rotenona/antimicina; para glucólisis, 10 mM de glucosa, 1 μM de oligomicina y 50 mM de 2-DG.

6. Configuración del analizador Seahorse XFe96

  1. Enciende el analizador y abre el software WAVE (véase la Figura 3).
  2. Selecciona XF Mito Stress Test.
    NOTA: Mientras se utilicen los medios y compuestos adecuados para el ensayo, el analizador puede realizar simultáneamente pruebas mitocondriales y de glucólisis en la misma placa utilizando la prueba de esfuerzo XF Mito.
  3. Selecciona el número de 'Grupos' según la configuración de la placa y etiqueta cada grupo. Proceda a la siguiente pestaña para asignar pozos al mapa de placas (véase la Figura 3). Ambos ensayos se realizan en la misma placa.
  4. Resalta los pozos de cada grupo según cómo se carga la placa.
  5. Ajusta el programa según el tipo de célula y el propósito experimental. Por ejemplo, si la configuración incluye un grupo preactivado antes del análisis o se añade un activador durante la ejecución, amplía el tiempo de incubación en cada ciclo para permitir que la activación ocurra.
  6. Selecciona la siguiente pestaña, 'Ejecutar ensayo', y rellena la información según sea necesario para guardar el archivo de datos.
  7. Carga el cartucho prehidratado con medicamentos (del paso 5) en la máquina cuando se indique para la inicialización. El paso de inicialización indicará si los sensores están correctamente hidratados y funcionan.
  8. Inicia el ensayo y carga y descarga las placas según indica las indicaciones durante el programa.
    NOTA: Al cargar el cartucho o la microplaca en el analizador, ¡asegúrate de que todas las tapas estén retiradas! Mientras que algunos modelos analizadores tienen una función de seguridad que puede detectar tapas, los modelos anteriores no lo tienen. Esto puede dañar la máquina si la tapa permanece intacta durante la prueba de la placa.

7. Métodos de normalización: (SRB) y recuento nuclear (tinción e imagen DAPI)

PRECAUCIÓN: Algunos reactivos del kit de ensayo SRB son corrosivos y se queman si entran en contacto con la piel. DAPI puede causar una reacción alérgica cutánea. Se recomienda el uso de guantes y otros equipos de protección personal, así como la eliminación de materiales en un contenedor o contenedor de residuos químicos aprobado por la institución.

NOTA: Seleccione el método de normalización en función de las características y pretratamientos de las células analizadas. Cualquiera de los dos métodos es adecuado al comparar células con diferentes tasas de proliferación, ya que ambos tienen en cuenta dichas variaciones. Sin embargo, si los tratamientos farmacológicos inducen senescencia, deteniendo la proliferación mientras aumenta el tamaño celular, la tinción DAPI es el enfoque preferido de normalización. DAPI puede no ser adecuado para tipos celulares donde la tinción nuclear es difícil de visualizar (es decir, adipocitos, eritrocitos) o células pueden ser multinucleadas (es decir, hepatocitos parénquimatos, miocitos).

  1. Para normalizar las células utilizando el ensayo SRB (Kit de Ensayo de Citoxicidad de Células B con Sulfohodamina) tras un análisis metabólico en tiempo real, se retira la placa de la máquina y se añade 1/4 del volumen del medio (por ejemplo, 50 μL en 200 μL de medio de cultivo) de la Solución de Fijación a cada pozo.
    1. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora o toda la noche a 4 °C.
    2. Retira la solución y lava suavemente los pozos tres veces con 200 μL de agua libre de RNasa/DNasa, teniendo cuidado de no alterar la capa celular. Para almacenamiento a corto plazo (si es necesario), sustituye el lavado final por PBS y guárdalo a 4 °C.
    3. Para una normalización inmediata usando el ensayo SRB, retira la solución de lavado y deja que la placa se seque completamente al aire a temperatura ambiente.
    4. Añade 25 μL de solución SRB a cada pozo y teñe durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad o envuelve la plancha en papel de aluminio durante el periodo de incubación.
      NOTA: La solución SRB es sensible a la luz, y esta parte del experimento debe realizarse en un área de poca luz.
    5. Retira la solución de manchas y añade 100 μL de 1 solución de lavado para lavar cada pozo 2–3 veces.
    6. Lava lo antes posible para evitar blanqueamiento y elimina las soluciones de lavado tanto como sea posible mediante aspiración al vacío.
    7. Añade 100 μL de 1x solución de solubilización a cada pozo y coloca la placa sobre un agitador durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    8. Mide la Densidad Óptica (O.D.) a 565 nm en un lector de placas para determinar la densidad del pozo en función de la saturación de color (véase la Figura 3 para referencia visual).
    9. Exporta los datos de los valores de O.D. como un archivo Excel. Esta hoja de cálculo se pegará en el software WAVE para su normalización (paso 8).
      NOTA: Si se observa un color intenso (> O.D. 3,5) debido a la sobrecarga celular, puede utilizarse una longitud de onda subóptima (por ejemplo, 490–530 nm) para reducir las lecturas de nuevo al rango lineal del instrumento. Corrige el fondo restando la O.D. del control que contiene solo el medio de cultivo (pozo de control de fondo) de todas las lecturas de las muestras.
  2. Para la tinción DAPI, diluye la solución original DAPI a 300 nM en 1x PBS.
    1. Lava cada pozo de la placa celda 3 veces suavemente con 200 μL 1x PBS.
      NOTA: Si hay células no adherentes, centrifuga la placa a 200 x g durante 3 minutos sin freno para asegurar que las celdas queden suspendidas en el fondo de cada pozo tras cada paso de lavado.
    2. Fijar las células en PFA al 2%–4% diluidas en 1x PBS durante 10–15 minutos a temperatura ambiente.
    3. Lava cada pozo de la placa celda 3 veces suavemente con 200 μL 1x PBS.
    4. Añade aproximadamente 150 μL de esta solución diluida de tinción DAPI a cada uno, asegurando que las celdas estén completamente cubiertas en cada pozo.
    5. Incuba entre 1 y 5 minutos a temperatura ambiente en un área con poca luz (o en una placa de cubierta en papel de aluminio).
    6. Retira la solución de tinte DAPI de cada pozo.
    7. Lava cada pozo de la placa celda 3 veces suavemente con 200 μL 1x PBS.
    8. Elimina cualquier PBS restante.
    9. Fotografía las celdas en cualquier Excitación/Emisión entre 358–461 nm o bajo cualquier ajuste de filtro DAPI en un microscopio.
    10. Exporta los datos de los valores de emisiones como un archivo Excel. Esta hoja de cálculo se pegará en el software WAVE para su normalización (paso 8).

8. Análisis y normalización de los datos

NOTA: Para el análisis de datos, se puede usar "Wave" u otro software. El protocolo proporcionado es aplicable al software Wave.

  1. Abre los resultados del análisis en Wave (véase la Figura 3). La normalización se realiza utilizando valores obtenidos del archivo Excel generado por el lector de microplacas tras la tinción SRB (paso 7).
  2. Haz clic en "Normalizar".
  3. En la ventana abierta, elige "seleccionar todo" seguido de "pegar" para pegar los datos copiados de la hoja de Excel generada durante el paso de normalización. Haz clic en "Aplicar". Este procedimiento normalizaba automáticamente todos los datos experimentales.
  4. Para generar un informe, haz clic en "Exportar a", en el panel que se abre a la derecha, selecciona "Generador de informes de pruebas de estrés de XF Cell Mito". Guarda el archivo generado. Durante el análisis, selecciona solo los pozos asignados a la prueba de estrés de Mito (véase la Figura 3).
  5. Para generar un informe, haz clic en "Exportar a", en el panel que se abre a la derecha selecciona "Generador de informes de pruebas de esfuerzo de glicólisis celular XF". Guarda el archivo generado. Durante el análisis, seleccione solo los pozos asignados a la prueba de esfuerzo de glucólisis (véase la Figura 3).

9. Células adherentes vs. no adherentes

NOTA: Las células adherentes y no adherentes difieren en su comportamiento de crecimiento, fijación superficial y necesidades de manipulación. Las células adherentes (por ejemplo, células cancerosas, BMDMs) se adhieren a la superficie del cultivo, por lo que el blindaje y el lavado no requieren precauciones especiales. Las células no adherentes (por ejemplo, células T, otros linfocitos) permanecen en suspensión y requieren diferentes métodos de centrifugación, resuspensión y blindaje. Comprender estas diferencias es fundamental para una siembra celular precisa, el tratamiento farmacológico y la consistencia del ensayo.

  1. Asegúrate de que todas las células utilizadas para el experimento estén cultivadas en un medio y recipiente de cultivo celular de tu elección justo antes de que se realice el ensayo, pero luego transfieras a la microplaca para realizar el ensayo.
    NOTA: Aunque se recomienda el medio RPMI XF para los tipos celulares descritos en este protocolo, para otros tipos de células, consulte con el fabricante para asegurarse de que se utiliza el medio adecuado.
  2. Para células adherentes (células cancerosas, células BMDM), sembrar las células en la Microplaca de Cultivo Celular Pro XFe96/XF 4–5 horas antes del ensayo a una densidad celular optimizada (véase paso 1) en el medio de volumen 200 μL y colócalas en un incubador deCO2 a 37 °C.
    NOTA: Las células BMDM pueden ser placadas hasta 24 horas antes del ensayo, ya que no proliferan y mantendrán la misma densidad celular. Para las células adherentes de rápido crecimiento, como las líneas celulares cancerosas, se recomienda platar el día del ensayo si no se necesita tratamiento adicional y analizarlas tan pronto como las células se unan para evitar el crecimiento celular adicional. Si este diseño no es posible, la normalización a cantidad/pozo de proteína o a número/pozo de núcleos es un paso necesario.
  3. Asegúrese de que los pozos de las esquinas de cada cuatro esquinas de la microplaca estén libres de celdas pero llenos de medios, ya que esto se mide como los pozos de control en blanco.
  4. Tras 3–5 horas de incubación, observa la microplaca para asegurarse de que las células están unidas a la placa a un nivel uniforme en el fondo de cada pozo.
  5. Si las células aún no están adheridas, la placa puede colocarse en la incubadora deCO-2 a 37 °C durante un tiempo adicional hasta que las células estén completamente adheridas.
  6. A continuación, prepara la microplaca con las células adherentes para lavar como se menciona en el paso 4 para continuar con el ensayo.
  7. Para las células no adherentes (linfocitos T y otros linfocitos), recubre la microplaca con poli-D-lisina antes de añadir células a la placa.
    NOTA: Aunque en este protocolo se recomienda el recubrimiento de poli-D-lisina, dependiendo del tipo celular, otro recubrimiento de placa (por ejemplo, colágeno, fibronectina, gelatina) puede ser más adecuado. Si se utiliza un recubrimiento alternativo, por favor siga las instrucciones del fabricante para su uso.
  8. Para recubrir la microplaca, prepare 2,5 mL de una solución de poli-D-lisina de 20 μg/mL (dilución 50x de 1 mg/1 mL de solución acuosa) en 0,1 M bicarbonato sódico, pH 8,0 (el bicarbonato proporciona el pH óptimo para la adsorción adhesiva). Este paso puede realizarse antes de realizar el ensayo o el mismo día.
  9. Aplica 25 μL de la solución en cada pozo de la placa e incuba en el banco o sobre un balancín de placa a temperatura ambiente durante 20–30 minutos.
  10. Aspira o pipeta la solución restante y lava cada pozo dos veces con 200 μL de agua libre de RNAasa/DNAsa.
  11. Espera a que los pozos estén secos (1–2 horas) antes de sembrar las células en la microplaca.
  12. A continuación, prepara la microplaca con celdas no adherentes para el paso de lavado centrifugando la placa a 200 x g durante 3 minutos sin freno para asegurar que las células queden suspendidas en el fondo de cada pozo.
  13. Procede al paso 4 y continúa el resto del ensayo como se menciona en los pasos 5–7.

Resultados

Este protocolo combinado se desarrolló para permitir que ambos ensayos se realizaran en la misma placa. Por ejemplo, este método se utilizó para dilucidar la señalización interfona mGluR1−TCR sobre la competencia metabólica de las células T CD8+ durante laactivación 10. Esto tenía como objetivo evaluar el impacto de la inhibición de mGluR1 en la transición a la glucólisis y los cambios en la respiración mitocondrial, procesos esenciales para el funcionamiento óptimo de las células T, minimizando al mismo tiempo el número de células T utilizadas en cada experimento. La misma técnica de placa única se aplicó eficazmente a otros tipos celulares, como los macrófagos adherentes derivados de la médula ósea (BMDM; Figura 4 y Figura 5), y a células no adherentes, como las células mononucleares de la sangre periférica humana (PMBCs; Figura 3). Se demostró que el bloqueo de señalización de mGluR1 en células T CD8+ activadas afecta la producción de energía mitocondrial y no mitocondrial. En cambio, las células naïves no mostraron cambios significativos en sus perfiles metabólicos energéticos (Figuras 6A,B). La prueba de esfuerzo de Mito de células T CD8+ activadas mostró una respiración basal alta y maximal, así como una capacidad de reserva respiratoria alta (Figura 6C). Las células T tratadas con CPCCOEt, un antagonista no competitivo que bloquea la señalización posterior al unirse el glutamato a mGluR1, tenían tasas de consumo de oxígeno (OCR) reducidas como las células naïfes y resultaban en una producción disminuida de ATP (Figura 6C). El ensayo de glucólisis también mostró que solo las células T CD8+ activadas no tratadas producían ATP mediante glucólisis, y el tratamiento con CPCCOE mostró una actividad metabólica comparable a la condición naïve (Figura 6D). Estos resultados confirman que la señalización de mGluR1 es esencial para el correcto funcionamiento de las células T CD8⁺ en el momento de la activación.

figure-results-1
Figura 1: Esta figura ilustra la visión general de la configuración de placas de la microplaca que incluye el ensayo de estrés de Mito y el ensayo de glucólisis en la misma placa. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Cargando el cartucho de drogas. (A) Un mapa detallado de los sensores y puertos en la parte trasera y frontal del cartucho, etiquetando qué droga debe cargarse en cada puerto. (B) La orientación recomendada de las guías sobre el cartucho para cargar los puertos correspondientes y la posición recomendada para usar la tubería multicanal sobre las guías. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Uso del programa WAVE para ejecutar y analizar el ensayo. (A) El proceso de implementación del programa incluye seleccionar el tipo de ensayo, asignar grupos, crear el mapa de placas y programar los puertos del fármaco. (B) El orden de los fármacos a cargar en los puertos correspondientes depende de si la muestra es Mito Stress o Glucólisis. (C) Un primer plano de la tinción SRB durante el último paso de normalización. (D) Tras la normalización, los datos de la placa pueden exportarse por separado tanto como glucólisis como prueba de esfuerzo de Mito para la misma placa. (E) Los datos para el Estrés Mito pueden seleccionarse editando la selección actual solo para muestras de Tensión Mito. (F) Los datos para glucólisis pueden seleccionarse editando la selección actual solo para muestras de glucólisis. Los datos de ejemplo utilizados en esta figura provienen de un análisis de células mononucleares de la sangre periférica humana. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Rendimiento simultáneo de Mito Stress corrido en la misma placa. Macrófagos derivados de médula ósea derivados de ratones WT y Tusc2 KO de 2 meses fueron sometidos a ambos tipos de análisis. Las células se dejaron sin tratar (sham) o se estimularon con LPS (100 ng/mL) durante 5 horas antes de la placificación (30.000 células/pozo). Se realizaron pruebas de estrés de mito y glucólisis en paralelo para permitir una comparación precisa, como se muestra en la Figura 1. (A) Perfiles de estrés de Mito para diferentes tipos de células (WT y KO) y condiciones (ingenuas y activadas), generados mediante software Wave. La normalización se realizó mediante tinción con SRB como se describe en el paso 7. (B) Gráficos de barras comparativos de los parámetros analizados en cada prueba. ∗ ≤ 0,05, ∗∗ p ≤ 0,005, prueba T del estudiante. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-5
Figura 5: Realización simultánea de pruebas de esfuerzo de glucólisis realizadas en la misma placa. Macrófagos derivados de médula ósea derivados de ratones WT y Tusc2 KO de 2 meses fueron sometidos a ambos tipos de análisis. Las células se dejaron sin tratar (sham) o se estimularon con LPS (100 ng/mL) durante 5 horas antes de la placificación (30.000 células/pozo). Se realizaron pruebas de estrés de mito y glucólisis en paralelo para permitir una comparación precisa, como se muestra en la Figura 1. (A) Perfiles de estrés de glucólisis para diferentes tipos celulares (WT y KO) y condiciones (ingenuas y activadas), generados mediante software Wave. La normalización se realizó mediante tinción con SRB como se describe en el paso 7. (B) Gráficos de barras comparativos de los parámetros analizados en cada prueba. ∗ ≤ 0,05, ∗∗ p ≤ 0,005, prueba T del estudiante. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-6
Figura 6: Pruebas de estrés de mito y glucólisis en una sola placa utilizando células T CD8⁺ purificadas de esplenocitos de ratón. (A) Perfiles representativos de la prueba de esfuerzo mitocondrial que compara los cambios dependientes de fármacos en la tasa de consumo de ogénigeno (OCR) de células T CD8+ realizadas con grupos de células T inhibidoras de mGluR1 naïves, activadas y activadas. (B) Perfiles representativos de la prueba de glucólisis que compara los cambios dependientes de fármacos en la Tasa de Acidificación Extracelular (ECAR) de células T CD8+ realizadas en grupos inhibidores ingenuos, activados y activados + inhibidores de mGluR1. (C) Gráficos de barras que muestran cambios cuantitativos en diferentes parámetros de la respiración mitocondrial de células T CD8+ en grupos inhibidores ingenuos, activados y activados + inhibidores de mGluR1. Las barras representan la media ± SEM (n = 4). (D) Gráficos de barras que muestran cambios cuantitativos en diferentes parámetros de glucólisis en células T CD8+ CD8+ inhibidoras de la mGluR1 activadas y activadas. Las barras representan la media ± SEM (n = 4). ∗p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, Test-T del estudiante. Esta figura está adaptada de Aquino et al.10. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Pozo final (μM)Volumen de solución de stock (μL)Volumen de medios (uL)Puerto 10x (μM)Volumen añadido al puerto (μL)
Oligomicina del puerto A0.51502850520
1.545025501520
2.563018902520
Puerto B FCCP0.12537.52962.51.2522
0.257529252.522
0.51502850522
130027001022
260024002022
Puerto C Rotenona/Antimicina0.53002700524

Tabla 1: Preparación del compuesto para cargar cartuchos sensores XFe96 para Mito Stress.

Pozo FinalVolumen de solución de stock (μL)Volumen de medios (μL)Puerto 10xVolumen añadido al puerto (μL)
Glucosa Puerto A250 mM100240020
Oligomicina del puerto B0,5 μM15028505 uM22
1,5 μM450255015 uM22
2,5 μM630189025 uM22
Puerto C 2-DG50 mM30000500mM24

Tabla 2: Preparación del compuesto para cargar cartuchos sensores XFe96 para glucólisis.

Discusión

El protocolo presentado aquí permite comparaciones precisas y fiables de dos principales vías productoras de energía, la fosforilación oxidativa (producción mitocondrial de ATP) y la glucólisis anaeróbica (producción de ATP fuera de las mitocondrias, sin necesidad de osígeno), y dos pruebas de esfuerzo diferentes en una sola prueba. Además, el diseño experimental tiene en cuenta el tipo de células analizadas, permitiendo una comprensión más amplia del análisis del metabolismo celular, minimizando la cantidad de muestra y reactivos utilizados.

Las diferencias entre las pruebas de estrés de Mito y las pruebas de estrés de glucólisis realizadas en protocolos de análisis metabólico en tiempo real diseñados y vendidos por Agilent, Inc. son considerables. Estos dos ensayos requieren medios de ensayo distintos, fármacos específicos y diferentes sistemas de instrumentación. La prueba de esfuerzo Mito utiliza medios de ensayo que contienen glucosa, L-glutamina y piruvato, mientras que la prueba de esfuerzo de glucólisis emplea medios libres de glucosa suplementados únicamente con L-glutamina. Los ensayos se examinan con diferentes compuestos: oligomicina → FCCP → Antimicina A + rotenona para la prueba de esfuerzo Mito, y oligomicina → glucosa → 2-DG para la prueba de esfuerzo de glucólisis. Por lo tanto, estas pruebas normalmente se realizan en placas separadas en diferentes momentos, ya que el analizador metabólico en tiempo real solo acomoda una placa a la vez.

Para abordar estas limitaciones, se desarrolló un protocolo combinado que permite realizar ambos ensayos en la misma placa utilizando la configuración de pruebas de estrés Mito en un artículo10 anterior. Se proporcionan recomendaciones para analizar diferentes tipos celulares, incluyendo células inmunitarias, células cancerosas, células adherentes y células en suspensión. Estas directrices pueden aplicarse de forma individual o en combinación, ofreciendo flexibilidad según los objetivos del experimentador y los recursos disponibles.

La normalización de las células mediante ensayo SRB o DAPI también permite mayor flexibilidad, en el caso de usar múltiples tipos celulares con diferentes tasas/tamañosde crecimiento 9,11. Además, dado que esta técnica requiere solo una placa para dos ensayos, puede combinarse con una variedad de tipos de muestras para medir procesos metabólicos.

Factores que influyen en el éxito del método: (1) número óptimo de células por pozo; (2) fijación eficiente de celdas; y (3) carga cuidadosa del cartucho, ya que dos conjuntos distintos de fármacos deben cargarse en secciones separadas del cartucho.

Las ventajas científicas y experimentales del método incluyen la comparación directa dentro del mismo contexto biológico. Utilizar las mismas células bajo condiciones idénticas de cultivo elimina la variabilidad entre placas o corridas y permite una comparación más precisa de la función mitocondrial y glicolítica en la misma muestra. También incluye una visión integrada del metabolismo celular. Medir tanto la fosforilación oxidativa (OXPHOS) como la glucólisis en paralelo proporciona una instantánea completa del metabolismo energético global de una célula y su flexibilidad para cambiar entre vías. Este ensayo paralelo también reduce la variabilidad biológica. Las diferencias en la densidad de las placas celulares, el número de pasajes o las condiciones ambientales se minimizan ya que ambos ensayos se realizan en la misma población celular, lo que conduce a una mejor reproducibilidad. Realizar ambas pruebas simultáneamente reduce la variabilidad de una etapa a otra causada por la calibración del cartucho del sensor, los cambios de temperatura o la preparación del reactivo.

Los beneficios técnicos de esta técnica incluyen una mayor eficiencia mediante la combinación de ensayos, lo que ahorra tiempo, reactivos y consumibles de placa, lo que la hace importante para estudios a gran escala o de alto rendimiento. Esto permite menores requisitos de muestra. Solo se necesita una placa celular, lo cual es ventajoso cuando se trabaja con células primarias limitadas o raras (por ejemplo, linfocitos, células derivadas del cerebro). Se produce una mejor normalización entre ensayos ya que ambos usan la misma placa, normalización (por ejemplo, contenido de proteínas o número de células), y es más consistente y fiable. Con esta consistencia, la correlación de datos se mejora. El emparejamiento directo de parámetros mitocondriales y glicolíticos de la misma muestra facilita el perfilado metabólico y los análisis estadísticos.

La única limitación conocida de esta técnica es que combinar dos protocolos en una sola placa reduce el número de réplicas de pozo disponibles. Se recomienda limitar el número de condiciones por placa para asegurar al menos 8 réplicas de pozo por condición.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional sobre la Salud de las Minorías y las Disparidades en Salud (NIMHD), subvención número 5U54MD007586-37, proyecto piloto de A. Ivanova; El UG3HG013248 proyecto de investigación 2, el proyecto de investigación 2 del Centro de Diversidad del NHGRI para la Investigación del Genoma, PI-Ivanova, también proporcionó cierto apoyo por parte de Genprex Inc.  Además, esta investigación se llevó a cabo en las instalaciones centrales del Meharry Medical College, que reciben apoyo de las subvenciones del NIH MD007586, CA163069 y S10RR025497.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos centrífugos de 15 mL, embolsados con tapón de rosca, estériles, 500 tubos por unidadGenesee Scientific21-408B
Consejos para pipetas Biologix-200 y mu; Extendido (Mochila, Estéril)Biologix USASKU 21-0200
BioTek Sinergia H1BIOSPX
Microscopio de fluorescencia BZ-X700Keyence
Corning  Depósitos de reactivos desechables estériles CostarFisher4873
Solución de D-(+)-glucosa 45% en H2OSigmaG9769
DAPI, cloruro y nbsp;Thermofisher ScientificD1306
Centrífuga Eppendorf 5810 REppendorf
GenClone Suero Bovino Fetal InactivadoGenesee Scientific25-514H
L-Glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081
Olympus Plastics 22-284, Olympus 1,7 ml microtubos, transparente, polipropileno estéril, resistente a ebullición, ster, 50/bolsa, 250 tubos/unidadGenesee Scientific22-284
Olympus Plastics 28-108, tubos cónicos de centrífuga de 50 ml, polipropileno a granel, estériles, 20 bolsas de 25 tubos, 500/unidadGenesee Scientific28-108
Paraformaldehído 16% solución de grado EMCiencia de la Microscopía Electrónica15710
Liofilizado con hidrobromuro de poli-D-lisinaSigmaP6407
Baño de Agua Precision 180Ciencia de Precisión51221060
Incubadora Precision Scientific GCA Modelo 26Thelco51221091
QBI 120-095-671 Mezcla de penicilina/estreptomicina, 100x Mezcla de Pen/Estreptococo, 10 x 10 mL/unidadGenesee Scientific25-827
QBI PBS, 1x, sin Ca, Mg, Fenol Rojo, 0,1 um Estéril FiltradoGenesee Scientific25-507B
RPMI 1640, con L-GlutaminaGenesee Scientific25-506
Seahorse XF RPMI medium, pH 7,4, 500 mLAgilent103576-100
Analizador Seahorse XFe96Agilent
Seahorse XFe96/XF Pro FluxPakAgilent103792-100incluye 18 cartuchos sensores XFe96/XF Pro, 18 microplacas XFe96/XF Pro de cultivo celular, 1 botella de Seahorse XF Calibrant Solution 500mL y 3 pares de guías de carga XF
Bicarbonato de sodioSigmaS6014
Piruvato de sodio (100mM) 100XGibco11360-070
Ensayo SRB (Kit de ensayo de Sulfurhodamina B)Abcamab235935
Pípetor Multicanal Ergonómico de Alto Rendimiento VWR SignatureAvantor89079-956
Kit de prueba de estrés Mito para XF CellAgilent103015-100
Kit de ensayo de tasa glucolítica XFAgilent103344-100

Referencias

  1. Caines, J. K., Barnes, D. A., Berry, M. D. The use of Seahorse XF assays to interrogate real-time energy metabolism in cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 225-234 (2022).
  2. Marinangeli, C., Kluza, J., Marchetti, P., Buee, L., Vingtdeux, V. Study of ampk-regulated metabolic fluxes in neurons using the Seahorse XF Analyzer. Methods Mol Biol. 1732, 289-305 (2018).
  3. Tan, W. J. T., Santos-Sacchi, J., Tonello, J., Shanker, A., Ivanova, A. V. Pharmacological modulation of energy and metabolic pathways protects hearing in the fus1/tusc2 knockout model of mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Antioxidants (Basel). 12 (6), 1225(2023).
  4. Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40, 365-375 (2018).
  5. Hammoud, S., et al. Tubular CPT1a deletion minimally affects aging and chronic kidney injury. JCI Insight. 9 (6), e171961(2024).
  6. Wei, C., Heitmeier, M., Hruz, P. W., Shanmugam, M. Evaluating the efficacy of glut inhibitors using a Seahorse extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1713, 69-75 (2018).
  7. Zhu, Y., et al. The role of PKM2-mediated metabolic reprogramming in the osteogenic differentiation of BMSCs under diabetic periodontitis conditions. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 186(2025).
  8. Liu, J., Zhang, X., Fan, X. Liensinine reshapes the immune microenvironment and enhances immunotherapy by reprogramming metabolism through the AMPK-HIF-1α axis in hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 208(2025).
  9. Van Der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113 (3), 3.16B.1-3.16B.14 (2016).
  10. Teresa P de Aquino, M., et al. Glutamate receptor–TCR signaling potentiates full CD8+ T cell activation and effector function in tumor immunity. iScience. 28 (10), 112772(2025).
  11. Hammoud, S., Kern, J., Mukherjee, S. Assays to enhance metabolic phenotyping in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 328 (4), 563-577 (2025).

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