Un flujo de trabajo modular para el análisis cuantitativo, estructural y funcional de biopelículas de Leptospira

Summary

Este protocolo ofrece un flujo de trabajo modular BSL-2 que combina ensayos de biomasa cristal-violeta, cinética de contraste de fase en lapso de tiempo, mapeo confocal 3D/matricial, ultraestructura SEM y un módulo in vivo de infección por hámster para cultivar, cuantificar, caracterizar e investigar el papel funcional de la biopelícula de Leptospira , permitiendo la evaluación estandarizada de mutantes e intervenciones antibiofilm en laboratorios.

Abstract

Aquí presentamos un conjunto integrado de protocolos para el cultivo, monitorización cuantitativa y caracterización estructural y funcional de biopelículas de Leptospira spp. a lo largo del tiempo. Este flujo de trabajo combina ensayos de microtitulación de violeta cristalino para medir biomasa de biofilm en múltiples puntos temporales, con un enfoque de fraccionamiento resuelto en el tiempo que distingue poblaciones bacterianas adheridas (biofilm) y no unidas (fase líquida), imágenes de contraste de fase en lapso de tiempo para observación cinética no destructiva, microscopía láser confocal para generar reconstrucciones 3D completas con lecturas de sonda matricial, y microscopía electrónica de barrido soportada por membrana para análisis ultraestructurales. Paralelamente, detallamos un procedimiento estandarizado para la extracción de agregados de biofilm intactos y su preparación para la inyección intraperitoneal en el modelo de hámster sirio dorado susceptible, permitiendo la evaluación directa de la virulencia asociada a biofilm in vivo junto con controles planctónicos emparejados.

Optimizado para la cepa patógena Leptospira interrogans Manilae L495, cada módulo es fácilmente transferible a otras especies de Leptospira y bibliotecas mutantes para comparar la capacidad formadora de biopelículas. En conjunto, estos módulos coordinados proporcionan una base sólida para el cribado de estrategias antibiofilm, la investigación de determinantes genéticos y la aclaración de la contribución de los biofilms a la persistencia y patogénesis de Leptospira .

Introduction

Los biofilms son comunidades microbianas estructuradas en las que las células están incrustadas en una matriz de sustancia polimérica extracelular (EPS) autosecretada compuesta por polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y^lípidos. Esta matriz proporciona estabilidad mecánica, media la adhesión a las superficies y mejora la supervivencia microbiana al otorgar tolerancia a estrés ambientales como la desecación, el estrés oxidativo y^{los antimicrobianos 2,3}. En bacterias patógenas, las biopelículas facilitan la persistencia, la evasión inmune y la infección crónica ^4,5.

En comparación con las células planctónicas, que son flotantes libres y metabólicamente más homogéneas, las células asociadas a biopelículas presentan alteración en la expresión génica, tasas de crecimiento y actividad^{metabólica 6}. Estas diferencias confieren una mayor tolerancia a los desafíos ambientales, los antibióticos y las defensas del huésped, permitiendo al tiempo que se mantienen comportamientos coordinados como la detección de quórum, la retención de nutrientes y la organización^{espacial 7,8}.

La formación de biopelículas ha sido ampliamente caracterizada en organismos modelo como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Vibrio cholerae, que han moldeado colectivamente nuestra comprensión de las bases genéticas, estructurales y fisiológicas del estilo de vida de biopelícula. Los estudios sobre Pseudomonas han revelado que los exopolisacáridos y la detección de quórum trabajan juntos para moldear arquitecturas complejas de biofilm^{tridimensional 9,10}. La investigación sobre Staphylococcus ha puesto énfasis en los roles de las proteínas superficiales y el ADN extracelular en la mejora de la cohesión de la biopelícula y la tolerancia a los^{antibióticos 11,12}. Las investigaciones sobre especies de Vibrio pusieron de manifiesto aún más la notable diversidad de morfologías de biofilm y su importancia ecológica en ambientes acuáticos¹³. En conjunto, estos sistemas han proporcionado un marco conceptual y metodológico sólido para la investigación en biopelículas, reforzado por los protocolos^{estandarizados 14} y evaluaciones críticas de técnicas^{existentes 15,16}, que en conjunto destacan la necesidad de enfoques armonizados al investigar la formación de biopelículas en bacterias menos estudiadas como Leptospira.

Durante mucho tiempo se presumió que los miembros del género de espiroquetas Leptospira, agentes causantes de la leptospirosis, eran predominantemente planctónicos. Estudios recientes han demostrado experimentalmente la formación robusta de biopelículas en múltiples especies¹⁷. Mientras que algunos estudios sugieren la formación de biopelículas en contextos^{ambientales 18} y asociados^{al hospedador 19}, otros han demostrado experimentalmente la capacidad de las leptospiras para formar biofilm en los túbulos renales de Rattus^{norvegicus 20} y en el humor vítreo de caballos²¹, así como la detección de especies leptoespirales dentro de biopelículas^{ambientales 22,23}. Por tanto, descifrar las condiciones y mecanismos que rigen los biofilms de Leptospira es fundamental para comprender la transmisión ambiental, la persistencia de los reservorios y la patogénesis de la^{enfermedad 24,25}.

Los ensayos existentes de biofilm de Leptospira están fragmentados, abarcando desde observaciones microscópicas^{cualitativas 17,26} hasta tinciones colorimétricas o violeta cristalinas^{finales 27,28}. Aunque estos estudios han proporcionado valiosas perspectivas sobre la formación de biopelículas, a menudo carecen tanto de la resolución cinética necesaria para monitorizar la maduración y dispersión de la biopelícula en tiempo real como del contexto ultraestructural proporcionado por la microscopía confocal o electrónica. Se consideran esenciales la monitorización continua y el análisis estructural 3D para captar la naturaleza dinámica de la formación y dispersión de^{biopelículas 14,15}. Estas limitaciones dificultan la comparabilidad entre estudios y limitan la evaluación sistemática de factores o intervenciones que afectan a la formación y dispersión de biopelículas, lo que pone de manifiesto la necesidad de un flujo de trabajo estandarizado y multilectura que capture tanto la dinámica estructural como funcional de Leptospira biofilms de manera reproducible y completa.

Para cubrir estas lagunas, desarrollamos un flujo de trabajo integrado y modular que unifica seis lecturas complementarias extraídas de la misma serie de culturas. Primero, un ensayo de microtitulación CV de alto rendimiento cuantifica la biomasa unida en múltiples puntos temporales. En segundo lugar, un ensayo de fraccionamiento resuelto en tiempo en placas de 96 pozos divide las poblaciones totales, en fase líquida (no adheridas o parcialmente separadas) y unidas (biofilm) mediante OD₄₀₅ para seguir su evolución durante la formación y dispersión. El término fase líquida se utiliza aquí para abarcar tanto células planctónicas como células separadas, reconociendo el continuo dinámico entre los fenotipos de vida libre y asociados a la^{superficie 29,30}. En tercer lugar, la imagen de contraste de fase en intervalo de tiempo proporciona una cinética no destructiva de adhesión, motilidad agregada y coalescencia. En cuarto lugar, la microscopía láser confocal (CLSM) permite reconstrucciones 3D completas con lecturas en vivo/muerto y de sonda matricial, permitiendo viabilidad dependiente de la profundidad y mapeo matricial. Quinto, la microscopía electrónica de barrido (SEM) soportada por membrana o por slipslip resuelve la arquitectura extracelular y la polaridad basal-apical a alta resolución. Además, se incorporó un módulo in vivo para evaluar la virulencia mediante la inyección intraperitoneal de agregados de biofilm en el modelo de hámster sirio dorado susceptible, un modelo sensible y bien establecido para la leptospirosis 31,32,33. Este enfoque vincula los fenotipos de biofilm con el potencial patógeno, proporcionando un contexto funcional que complementa los análisis in vitro.

En comparación con los enfoques monomodales, esta plataforma ofrece varias ventajas: (i) lecturas cuantitativas sincronizadas (CV y OD fraccionada) y estructurales (CLSM/SEM); (ii) monitorización cinética no destructiva de la adhesión temprana, crecimiento, maduración y dispersión; (iii) viabilidad 3D y caracterización matricial utilizando sondas dirigidas; (iv) visualización ultraestructural de la arquitectura de matrices extracelulares; y (v) evaluación funcional directa de la virulencia asociada a biofilm frente a la planctónica en un modelo de hámster susceptible, cada uno posible con infraestructura estándar de BSL-2. Aprovechando formatos de varios pozos y sustratos extraíbles de vidrio o policarbonato, el flujo de trabajo permite replicar pantallas de variables ambientales, compuestos antimicrobianos o bibliotecas mutantes, manteniendo la esterilidad, el rendimiento y la validación cruzada entre módulos.

Los laboratorios centrados en ecología, persistencia, interacciones huésped-patógeno o descubrimiento de antibiopelículas pueden adoptar módulos individuales o toda la cadena de producción. Los recursos necesarios se limitan a un lector de placas, un microscopio invertido con control ambiental para time-lapse, acceso a un microscopio confocal y a una instalación de SEM, y a instalaciones estándar para animales para el modelo de hámster, lo que permite una adopción amplia y comparaciones reproducibles entre estudios.

Protocol

Declaración ética:
Esta investigación fue aprobada por el Comité de Cuidado y Uso Animal del Institut Pasteur de Nueva Caledonia y realizada conforme a las directrices establecidas por el Comité de Cuidado y Uso Animal del Institut Pasteur de París, y la Recomendación Europea 2007/526/CE. Número de registro de experimento de investigación con animales: IPNC-2018-ARE-001

NOTA: Todos los procedimientos que involucren cultivos vivos de Leptospira deben realizarse en un laboratorio de bioseguridad nivel 2 (BSL-2), en cumplimiento de las directrices institucionales de bioseguridad. Todas las manipulaciones de cultivo deben realizarse bajo un gabinete de seguridad biológica para garantizar la seguridad del operador y prevenir la contaminación ambiental.

La cepa L495 de Leptospira interrogans serovar Manilae utilizada en este estudio fue obtenida originalmente de la colección del Institut Pasteur (París, Francia) y se conserva en el Institut Pasteur de Nueva Caledonia. Para preservar la virulencia, la cepa se vuelve a aislar periódicamente de hámsters infectados. En todos los experimentos in vitro , los cultivos no se mantuvieron más allá de seis subcultivos tras la recuperación del hospedador animal.

Todos los procedimientos animales deben realizarse conforme a las directrices institucionales y ser aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales correspondientes. Los experimentos deben cumplir con las normativas europeas sobre bienestar animal (Directiva de la UE 2010/63) y con las recomendaciones del Servicio de Salud Pública, asegurando que el uso de animales esté justificado y esté éticamente regulado.

1. Preparación del inóculo bacteriano

1. Cultivar células de Leptospira spp. a 30 °C en medios^{EMJH 34} bajo condiciones aeróbicas y sin agitar en tubos de vidrio de fondo plano y tapa roscada hasta que el cultivo alcance la fase media logaritaria. En estas condiciones, la cepa L495 de L. interrogans serovar Manilae, una cepa de bajo paso que se mantiene regularmente in vivo mediante hámsters, normalmente alcanza la densidad celular adecuada en 3-5 días. Asegúrese de que los cultivos alcancen una sobredosis de 0,2-0,4 a 405 nm (2 a 5 x 10⁸ células/mL) antes de diluirlas en medios EMJH frescos y verifique la motilidad y ausencia de agrupaciones mediante microscopía de campo oscuro a 20x de ampliación.
   NOTA: EMJH tiene absorbancia intrínseca. Borra el espectrofotómetro con EMJH estéril y resta este valor de todas las lecturas. El inóculo puede estandarizarse midiendo la densidad óptica o contando células directamente utilizando una cámara de Petroff-Hausser. Una dilución 1:100 de un cultivo verificado de logaritarímetro medio suele dar un OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10⁶ células/mL). Mezclar suavemente por inversión; No hagas vórtice.
2. Examina una alícuota de 10 μL bajo microscopía de campo oscuro a una magnificación de 20 x. Asegúrate de que ≥ 90% de las células sean altamente móviles y que no haya grumos visibles. Diluir el cultivo mediano verificado 1:100 en EMJH fresco para obtener OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10⁶ células/mL). Mezclar suavemente por inversión; No hagas vórtice.
   NOTA: Un inóculo funcional soporta todos los ensayos posteriores detallados en este protocolo (Figura 1). Prepara 36 mL para sembrar una placa de 24 pozos (1 mL/pozo) o 20 mL para sembrar una placa de 96 pozos (200 μL/pozo). Ajusta los volúmenes para que coincidan con el número de placas necesarias.

Figura 1. Flujo de trabajo global para el análisis de biofilm de Leptospira . Los cultivos de Leptospira que crecen exponencialmente primero se evalúan para su crecimiento y se estandarizan mediante densidad óptica. Los cultivos se distribuyen luego en placas que contienen vidrio o membrana, microplatos de microscopía o placas de 96 pozos. El flujo de trabajo incluye siete módulos: (1) preparación del inoculo; (2) tinción de violeta cristalino para cuantificación de biomasa; (3) imagen ultraestructural por SEM; (4) monitorización dinámica de biofilm mediante microscopía de contraste de fase en time-lapse; (5) visualización 3D por CLSM con tinción viva/muerta; (6) cuantificación resuelta en el tiempo de fracciones unidas y no unidas durante la formación de biofilm mediante densidad óptica; y (7) investigación del papel funcional del biofilm durante la infección en hámsters sirios. Este enfoque integrado permite el análisis multimodal del desarrollo, estructura y patogenicidad de la biopelícula. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Cuantificación basada en violeta cristalino de biopelículas en deslizantes o membranas

1. Dentro de una capucha de bioseguridad BSL2, se utilizan pinzas estériles para colocar una cubierta de vidrio estéril de 12 mm o una membrana hidrofílica policarbonatosa estéril de 0,1 μm plana en el fondo de cada pozo, en una placa estéril de 24 pozos con tapa. Pre-remoja la membrana/protectora de vidrio durante 2 horas a 30 °C con 1 mL de EMJH estéril.
   NOTA: Aunque no es imprescindible, pre-remojar el sustrato en EMJH mejora el humedecido y mejora ligeramente la adhesión bacteriana.
2. Retirar la solución de remojo y añadir 1,5 mL de la suspensión bacteriana diluida (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x^{10 6} células/mL) a cada pozo. Asegúrate de que el protector o membrana permanezca firmemente posicionado en la parte inferior.
3. Incubar la placa a 30 °C en condiciones estáticas en una atmósfera húmeda, manteniendo colocando una bandeja llena de agua dentro de la incubadora para evitar la evaporación del medio de cultivo. Para cepas de crecimiento lento, se recomienda una incubación de 3 semanas para permitir la formación de un biofilm maduro y adherente.
4. En el momento deseado, retirar cuidadosamente la mayor cantidad posible de medio de cultivo de cada pozo sin alterar el biofilm. Enjuaga suavemente cada pozo con 1 mL de solución salina estéril con fosfato tamponado (PBS) para eliminar las células residuales no adherentes, manteniendo el deslizante plano contra el fondo del pozo para evitar desprender las frágiles células de biofilm. En estas condiciones, el crecimiento de biofilm ocurre predominantemente en la superficie superior del deslizante de cobertura, con un crecimiento mínimo en la parte inferior, por lo que el enjuague sin levantar es suficiente para enriquecer las células unidas a la superficie para análisis aguas abajo.
   NOTA: Las biopelículas son extremadamente frágiles en esta etapa y pueden aspirarse fácilmente por error. El pipeteo debe realizarse de forma lenta y precisa a lo largo de la pared del pozo para evitar alterar la biopelícula.
5. Fija las muestras de biofilm añadiendo 1 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS a 37 °C durante 30 minutos. Retira el fijador y enjuaga cuidadosamente dos veces con 1 mL de PBS.
   NOTA: Para la fijación, se preparó una solución de formaldehído al 4% (16% de material libre de metanol diluido 1:4 en PBS) y se descartó tras su uso, ya que la polimerización en paraformaldehído reduce la actividad de reticulación.
6. Añade 1 mL de solución de Violeta Cristalina (CV) al 0,1% (p/v) a cada pozo e incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos, asegurando que la membrana o la capa de cobertura esté completamente cubierta.
7. Descarta el tinte y enjuaga dos veces con 1 mL de PBS.
   NOTA: El violeta cristalino y el paraformaldehído (PFA) son tóxicos y pueden irritar la piel y los ojos. Siempre lleva guantes y manipula ambos productos químicos con cuidado, preferiblemente en una campana extractora. Eliminar los residuos en recipientes designados para tintes peligrosos o residuos químicos según las directrices de seguridad institucional.
8. Inclina la placa y vacía el líquido residual. Seca los pozos al aire a temperatura ambiente hasta que el sustrato parezca completamente seco (≥ 4 horas, preferiblemente durante la noche).
   NOTA: En esta etapa, pueden verse estructuras en forma de puntos o reticuladas en la superficie del cobertizo o de la membrana (Figura 2A).
9. Añadir 500 μL de tampón de elución (50% etanol, 50% ácido acético glacial (vol/vol)) a cada pozo. Incuba el plato durante 15 minutos. Pipetea arriba y abajo para disolver completamente el violeta cristalino unido al biofilm.
10. Transfiere 200 μL de cada muestra a una microplaca ópticamente clara de 96 pozos y mide la absorbancia a 570 nm. Se resta un blank solo de sustrato preparado procesando una capa o membrana no inoculada mediante fijación, tinción CV, lavados y elución para eliminar la unión intrínseca/fondo. Registra la desviación media ± estándar para al menos tres réplicas técnicas. Diluir muestras con buffer de elución si la absorbancia excede el rango lineal del espectrofotómetro.

3. Visualización de biofilm usando microscopía electrónica de barrido (SEM)

1. Dentro de una capucha de bioseguridad BSL2, se utilizan pinzas estériles para colocar una cubierta de vidrio estéril de 12 mm o una membrana hidrofílica policarbonatosa estéril de 0,1 μm plana en el fondo de cada pozo, en una placa estéril de 24 pozos con tapa. Pre-remoja la membrana/protectora de vidrio durante 2 horas a 30 °C con 1 mL de EMJH estéril.
2. Retirar la solución de remojo y añadir 1,5 mL de la suspensión bacteriana diluida (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x^{10 6} células/mL) a cada pozo. Asegúrate de que el protector o membrana permanezca firmemente posicionado en la parte inferior.
3. Incubar la placa a 30 °C en condiciones estáticas en una incubadora de control de humedad para evitar la evaporación del medio de cultivo. Para cepas de crecimiento lento, se recomienda una incubación de 3 semanas para permitir la formación de un biofilm maduro y adherente
4. En el momento deseado, retirar cuidadosamente la mayor cantidad posible de medio de cultivo de cada pozo sin alterar el biofilm.
5. Luego enjuaga suavemente cada pozo con 1 mL de PBS estéril para eliminar las células residuales no adherentes, manteniendo el deslizante plano contra el fondo del pozo para evitar que se desprendan células frágiles de biofilm. En estas condiciones, el crecimiento de biofilm ocurre predominantemente en la superficie superior del deslizante de cobertura, con un crecimiento mínimo en la parte inferior, por lo que el enjuague sin levantar es suficiente para enriquecer las células unidas a la superficie para análisis aguas abajo.
   NOTA: Las biopelículas son extremadamente frágiles en esta etapa y pueden aspirarse fácilmente por error. El pipeteo debe realizarse de forma lenta y precisa a lo largo de la pared del pozo para evitar alterar la biopelícula.
6. Añadir una solución de paraformaldehído al 4% (PFA) y glutaraldehído al 1% en un tampón de cacodilato de sodio (0,2 M, pH 7,4) directamente en el pozo para fijar el biofilm.
7. Incuba durante 30 minutos a 37 °C, luego retira el fijador y enjuaga el abrigo o membrana dos veces con PBS. Este enfoque preserva la biopelícula unida a la superficie minimizando el desprendimiento, ya que la mayor parte del crecimiento de la biopelícula ocurre en la superficie superior de la cubierta bajo nuestras condiciones.
   NOTA: Para la fijación, se preparó una solución de formaldehído al 4% y una solución de glutaraldehído al 1% (16% de stock libre de metanol diluido 1:4 en un tampón de cacodilato de sodio) y se descartó después del uso, ya que la polimerización en paraformaldehído reduce la actividad de reticulación.
8. Sumergir el sustrato en tetróxido de osmio al 1% (OsO₄) diluido en PBS durante 1 hora para mejorar el contraste del SEM. Enjuaga dos veces con PBS.
9. Deshidrata las muestras sumergiéndolas secuencialmente en series graduadas de etanol con concentraciones crecientes: 25%, 50%, 70%, 90% y 100% (v/v), cada una durante 10 minutos.
10. Añade 500 μL de hexametildisilazano e incuba durante 5 minutos, luego sustituye por HMDS fresco e incuba otros 5 minutos. Retira el exceso de HMDS y deja que la muestra se seque completamente al aire bajo la campana extractora.
    NOTA: El glutaraldehído, PFA, cacodilato sódico, tetróxido de osmio y hexametildisilazano son tóxicos y deben manipularse bajo una campana extractora química con el equipo de protección personal adecuado.
11. Monta las muestras secas sobre los muñones de SEM usando cinta de carbono conductora de doble cara. Recubre las muestras con una capa fina (~10 nm) de oro o platino, proporcionando suficiente contraste electrónico para la imagen con SEM. Esto permite una visualización de alta resolución de la arquitectura de biopelículas, incluyendo contactos célula-célula, morfología, densidad y heterogeneidad de la matriz extracelular, sin necesidad de tintes o tintes adicionales.
12. Carga los muñones en el SEM usando el soporte de muestras adecuado. Evacuar la cámara durante la noche, cuando sea posible, para mejorar la calidad de imagen, luego adquirir imágenes secundarias de electrones a 5 - 15 kV y aumentos adecuados para revelar la ultraestructura de biofilm (Figura 2).

4. Imagen de contraste de fase en lapso de tiempo de biofilm en crecimiento

1. Pipeta 500 μL del inóculo de trabajo (_{DIM 405} = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ celdas/mL; véase Sección 1) en una antena Hi-Q4 de vidrio estéril de 35 mm con fondo de cristal equipada con una tapa plana paralela para eliminar la distorsión del menisco. Evita introducir burbujas y cierra el plato inmediatamente.
   NOTA: La antena Hi-Q4 con fondo de vidrio de 35 mm contiene 4 áreas de cultivo distintas que pueden usarse para fotografiar simultáneamente 4 condiciones diferentes. Asigna un compartimento a un medio EMJH estéril como control negativo y los otros 3 a réplicas técnicas o diferentes cepas/mutantes.
2. Coloque el plato en el escenario ambiental de un microscopio invertido equipado con óptica de contraste de fase, un motor de enfoque (Biostation IMQ) y un recinto humidificado ajustado a 30 °C y 95% de humedad relativa. Estas condiciones ayudan a minimizar la evaporación durante la imagen prolongada (hasta 8 días).
3. Inicia la aplicación BioStation IMQ y, en la interfaz principal, abre la ventana de Configuración de Nuevo Time-lapse para acceder al panel de configuración. Antes de comenzar el experimento, comprueba los parámetros ambientales en la Pantalla de Estado, asegurando que tanto el indicador de la Cámara como el de temperatura del agua muestren Estable para evitar deriva del bastidor durante la adquisición.
4. En la pantalla de Nuevo ajuste de time-lapse, selecciona la pestaña En directo y configura los parámetros de imagen en el panel de Condición de Observación eligiendo Contraste de Fase (Ph) como filtro y ajustando la Ampliación a 20 X.
5. En modo Manual, ajusta la intensidad de la luz y el tiempo de exposición para optimizar el contraste evitando la saturación. Verifica esto usando el botón de Comprobación de Saturación. Definamos cuatro puntos de adquisición correspondientes a los centros de los cuatro compartimentos.
6. Coloca el escenario secuencialmente sobre cada compartimento usando el Jog Dial o haciendo clic directamente en la Pantalla de Imagen de Observación en Vivo .
7. Refina el enfoque con los botones de enfoque y registra cada posición haciendo clic en el botón de Registro de Puntos de Experimento en Time-lapse . Los puntos registrados aparecen como marcos azules numerados en la pantalla de Verificación de Puntos de Observación y se confirman en la pestaña de Puntos.
8. Programa el calendario de adquisición abriendo la pestaña de Tiempo y haciendo clic en Nuevo para acceder al cuadro de diálogo Timelapse , donde el Ciclo de Adquisición se establece en 30 minutos y el Tiempo Total en 7 días.
9. Tras hacer clic en Aplicar, el software calcula automáticamente el número de rondas de adquisición. Activa el enfoque automático haciendo clic derecho en la barra de título, seleccionando Preferencias y activando el modo AF para asegurar el enfoque en cada posición del escenario. Verifica la consistencia de los ajustes de exposición, ganancia e intensidad de luz en todos los puntos, y guarda toda la configuración usando el botón de guardar .
10. Comienza la adquisición haciendo clic en Iniciar Time-lapse. El software cambia automáticamente a las Imágenes Time-lapse, permitiendo un seguimiento continuo del progreso de adquisición y la estabilidad de la cámara durante los 7 días del experimento. Todas las imágenes se guardan automáticamente en formato TIFF dentro de la carpeta de experimentos creada por el software.
11. Procesa y cuantifica la serie de imágenes importando las pilas de imágenes a FIJI (Figura 3A, B, C).
12. Abre las pilas de imágenes correspondientes a cada posición mediante File > Import > Secuencia de Imágenes, asegurándote de que los fotogramas se carguen en orden cronológico.
13. Convierte las pilas alineadas a escala de grises de 8 bits usando Image > Tipo > 8 bits para estandarizar la intensidad de los píxeles.
14. Aplica umbral usando Imagen > Ajusta > umbral para aislar las regiones de biofilm bacteriano. Aplica ajustes de umbral consistentes en todos los fotogramas seleccionando Aplicar, y luego guarda el resultado como una máscara binaria usando Process > Binary > Make Binary.
15. Realiza cuantificación con Analizar > Analizar Partículas, registrando parámetros como Área, Porcentaje de Área e Intensidad Media.
16. Exporta automáticamente los resultados de cada fotograma a una hoja de cálculo a través de la ventana de Resultados (Archivo > Guardar como > .csv) para análisis cinético. Expresa todas las mediciones como la proporción del área de campo cubierta por el biofilm (cobertura superficial).

5. Visualización de biofilm usando microscopía láser de barrido confocal (CLSM)

1. Inocular 1,5 mL del inóculo de trabajo (DI₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ células/mL; véase Sección 1) en una placa estéril de fondo de vidrio de 35 mm. Incubar estáticamente en una caja humidificada que contenga un depósito de agua en una incubadora a 30 °C hasta alcanzar la etapa de desarrollo deseada (hasta 21 días).
2. En el momento elegido, aspira cuidadosamente el medio lentamente a lo largo de la pared de platos sin alterar la biopelícula. Enjuaga una vez con 2 mL de PBS estéril para eliminar las células planctónicas, teniendo extremo cuidado para no desprenderse ni alterar la biopelícula.
3. Prepara soluciones de tinción que requieran incubación con biopelículas no fijadas (vivas) (actícalo antes de fijarlas).
   1. Para la tinción viva/muerta, añade 3 μL de tinción fluorescente verde SYTO9 (1,67 mM) y 3 μL yoduro propidio (18,3 mM) a 10 mL PBS para crear la solución de tinción. Añade 200 μL de la solución tintora directamente sobre las bacterias formadoras de biopelícula, luego incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y enjuaga una vez en PBS.
   2. También se puede usar un trazador de células vivas para teñir las células antes de su fijación. Incuba las células vivas con un trazador CFDA/SE de 10 μM durante 30 minutos. Alternativamente, también se puede utilizar etiquetar las membranas con FM4-64 a una concentración de 5 μg/mL. Enjuaga una vez en PBS.
4. Fija el biofilm añadiendo 2 mL de una solución de paraformaldehído al 4% en PBS e incuba durante 30 minutos a 37 °C. Quita el fijador y enjuaga dos veces con PBS.
5. Añade una gota de medio antifundido para cubrir el biofilm y evitar burbujas.
6. Adquirir pilas Z en un microscopio confocal invertido equipado con un láser de luz blanca sintonizable (WLL) y un objetivo de inmersión en aceite HC PL APO CS2 de 63×/1,4 NA. Para CFDA/SE, se ajusta la excitación a 488 nm y se recoge la emisión entre 500-550 nm, usando un orificio de 1 unidad de Airy (UA). Para FM4-64, ajusta la excitación a 561 nm y detecta la emisión entre 630-700 nm, también con un orificio estenopeico de 1 UA.
7. Adquiere pilas Z en intervalos de 0,5-1,0 μm a lo largo de todo el grosor de la biopelícula. Ajusta la potencia láser y la ganancia del detector para maximizar el rango dinámico evitando la saturación (<1% de píxeles saturados).
8. Utiliza el promedio de línea (2-4×) para mejorar la relación señal-ruido y mantener todos los parámetros de imagen (potencia láser, ancho de banda del detector, tamaño estenopeico, velocidad de escaneo) constantes entre muestras.
9. Guarda las pilas de imágenes como archivos de 12 bits y expórtalas en formato .lif para análisis cuantitativo en FIJI (ImageJ).
   NOTA: Antes de la imagen, asegúrese de que los ajustes del microscopio (por ejemplo, potencia del láser, ganancia del detector, tamaño del orificio estenopeico) estén estandarizados usando muestras de control teñidas con los mismos tintes. Este paso de calibración es esencial para minimizar la variabilidad entre adquisiciones y permitir una comparación fiable entre experimentos.
10. Procesar y cuantificar pilas de imágenes confocales usando FIJI equipado con el plugin COMSTAT (o software equivalente de análisis 3D⁾¹⁰. Mide el biovolumen, el grosor medio y máximo, la cobertura superficial y las proporciones vivas/muertas (u otras métricas predefinidas). Exporta vistas ortogonales representativas y proyecciones de intensidad máxima para fines ilustrativos (Figura 3D, E).

6. Cuantificación resolta en el tiempo de fracciones unidas y no unidas durante la formación de biofilm en ensayos de microtitulación de 96 pozos

1. Inocular 200 μL del inóculo de trabajo (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ células/mL; véase Sección 1) en los pozos de una placa de 96 pozos. Incubar estáticamente a 30 °C hasta el momento deseado (días 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 o 21).
   NOTA: Los efectos de borde y la evaporación son comunes al usar placas de 96 pozos, especialmente si la incubadora carece de control de humedad. Para minimizar estos efectos, añadir 200 μL de agua destilada estéril a todos los pozos periféricos. Además, se colocaron placas dentro de una caja humidificada que contiene un depósito de agua, que luego se coloca dentro de la incubadora para reducir aún más la evaporación y mantener una humedad constante entre pozos.
2. En cada momento de tiempo, prepara tres tipos de muestras:
   1. Suspensión total - Homogeneizar todo el contenido de un pozo que contiene la biopelícula pipeteando suavemente varias veces, evitando la formación de burbujas. Esta fracción representa la población bacteriana total, incluyendo tanto las leptospiras no adheridas como las que se encuentran dentro del biofilm semiadherente. Este paso de homogeneización ayuda a dispersar los agregados celulares que podrían interferir con mediciones posteriores de absorbancia.
   2. Fase líquida - De un segundo pozo, se extraen cuidadosamente 180 μL del sobrenadante sin alterar la capa de biopelícula. Transfiere a un pozo vacío y añade 20 μL de medio EMJH fresco. Pipetea suavemente varias veces arriba y abajo para dispersar los agregados celulares. Esta fracción representa las células no unidas presentes en la fase líquida, que pueden incluir tanto leptospiras suspendidas libremente como agregados de biofilm separados.
   3. Biofilm - En el mismo pozo utilizado para el paso 2.2, resuspende el biofilm restante añadiendo 180 μL de medio EMJH fresco y pipeteando suavemente varias veces. Esta fracción corresponde a leptospiras dentro del biofilm.
3. Mide la absorbancia de cada suspensión a 405 nm usando un espectrofotómetro, tras asegurarte de que cada pozo ha sido completamente homogeneizado, y grafica los valores para generar un gráfico representativo (Figura 4A).

7. Investigación del papel funcional del biofilm durante la infección del huésped

1. Inocular 200 μL del inóculo de trabajo (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ células/mL; véase Sección 1) en los pozos de una placa de 96 pozos. Incubar estáticamente a 30 °C hasta alcanzar la etapa de desarrollo deseada (hasta 21 días).
2. Para determinar la concentración del inóculo, se dedican pozos específicos de "control de biofilm" que se usarán únicamente para monitorización del crecimiento y no para inyecciones en animales. Una vez que la biopelícula es visible macroscópicamente, se retiran suavemente 180 μL de sobrenadante de un pozo de control sin alterar la biopelícula. Sustituir por 180 μL de medio EMJH fresco, resuspender cuidadosamente los agregados de biofilm sin generar burbujas y medir el OD₄₀₅ para estimar la concentración bacteriana.
   NOTA: En principio, lavar los pozos antes de cuantificar podría ayudar a eliminar las células no adherentes. Sin embargo, dado que las biopelículas de Leptospira presentan una adhesión débil en las placas de 96 pozos, el lavado provocaría una pérdida incontrolada de material biofilmado. Por esta razón, el paso de resuspensión se realizó sin lavado previo para asegurar la reproducibilidad entre pozos y concentraciones bacterianas constantes.
   Los pozos de control de biofilm suelen contener ~2 x 10⁸ leptospiras, que fue elegido como inóculo estándar para experimentos de infección de hámster. Esta concentración también define el número objetivo de leptospiras planctónicas utilizadas como controles. Cuando se incluyen, los controles planctónicos se preparan subcultivando recientemente Leptospira en medio EMJH bajo condiciones de agitación a 30 °C durante hasta 5 días, correspondiente a la fase de crecimiento exponencial medio-tardía que produce una densidad celular similar.
3. Para la inoculación animal, utiliza pozos de biofilm separados (no los pozos de control). Retirar cuidadosamente 180 μL de sobrenadante de los pozos para eliminar la mayoría de las leptospiras en fase líquida.
4. Recoge los agregados restantes de biofilm de 20 μL usando una punta de pipeta de 200 μL para evitar alterar la estructura.
   NOTA: El biofilm es frágil. Asegúrate de que los agregados sean visibles antes y después de la recogida. Prepara pozos extra por si es necesario repetir.
5. Transfiere los agregados a una jeringuilla prellena con 300 μL de medio EMJH fresco. Permite que los agregados se asienten por gravedad.
6. Coloca una aguja de 21 G y expulsa suavemente el exceso de EMJH hasta alcanzar un volumen final de 200 μL. Asegúrate de que no queden burbujas de aire y que los agregados de biofilm sean visibles.
   NOTA: Esperar a que los agregados se asienten minimiza la pérdida durante el ajuste de volumen. Antes del uso in vivo , compruebe que los agregados permanezcan intactos tras pasar por una aguja de 21 G (Figura 4C, D).
7. Realizar la inyección intraperitoneal de 2 leptospiras de 10⁸ en un medio EMJH de 200 μL.
   NOTA: Utiliza hámsters sirios dorados de 7-8 semanas (ambos sexos), mantenidos bajo condiciones de vivienda estándar. Para controles negativos, inyectar solo 200 μL de medio EMJH (un animal por réplica).
8. Vigilar a los animales dos veces al día durante hasta 21 días para detectar signos clínicos de leptospirosis (pelaje despeinado, postración y respuesta reducida a la estimulación). Eutanasia inmediatamente mediante inhalación de dióxido de carbono si se observa sufrimiento y registra el momento de la eutanasia como el momento de la muerte.
9. En el día 21, eutanasiar a todos los animales supervivientes.
   NOTA: Realizar tres réplicas biológicas independientes con cultivos preparados en diferentes fechas. Cada réplica incluye dos animales por condición y un animal de control negativo.

Results

Cuando el inóculo se prepara correctamente, los cultivos entran en fase de logaritarítmica en 3-5 días y muestran valores de OD₄₀₅ de ~ 0,2-0,4, con campos brillantes y altamente móviles bajo microscopía de campo oscuro (≥ el 90% de las células móviles) y sin grumos visibles. Las preparaciones subóptimas se presentan como bacterias lentas y motilidad heterogénea en todo el campo; Estas culturas suelen producir biofilms débiles y deben descartarse. En la práctica, confirmar la motilidad y la OD lado a lado justo antes de la siembra minimiza las pruebas fallidas. Establecer estas compuertas de control de calidad en la etapa del inoculo es el mejor predictor de éxito en aplicaciones posteriores. Aunque la metodología se optimizó para L. interrogans serovar Manilae L495, los mismos procedimientos también se aplicaron a la cepa Leptospira biflexa Patoc para demostrar la aplicabilidad entre especies. L. biflexa generalmente forma biopelículas menos cohesivas y más delgadas en comparación con L. interrogans, pero la secuencia característica del desarrollo y las características estructurales siguen siendo detectables con ajustes adecuados de parámetros. Incluir ambas especies subraya así la adaptabilidad del flujo de trabajo tanto a Leptospira patógenos como saprófitos.

Tras 21 días de incubación estática a 30 °C en una cámara humidificada (o el tiempo adecuado para la especie de Leptospira utilizada), las biopelículas se hacen visibles a simple vista tanto en las cubiertas de vidrio como en las membranas hidrofílicas de policarbonato. El crecimiento exitoso produce patrones CV característicos tras 2-3 semanas, como huellas punticuladas, ramificadas o reticuladas adheridas a la superficie (Figura 2A).

En una partida típica, L. interrogans tipo salvaje Manilae L495 alcanza ~ 50% de cobertura superficial en la semana 3, mientras que los mutantes con bajo biofilm se estancan cerca del ~ 20% y los fenotipos de alto biofilm se acercan al ~ 70-80%, estableciendo un rango dinámico práctico para el cribado. El grado de formación de biofilm también puede variar dependiendo de la especie y la cepa de Leptospira ; por ejemplo, la cepa de L. biflexa Patoc desarrolla biofilms visibles más rápidamente, y estudios previos consideraban estructuras tan pronto como 120 horas después de la inoculación como biopelículas^{maduras 35}.

La tinción de violeta cristalina proporciona un método fiable y reproducible para cuantificar la biomasa de biofilm. En biopelículas bien desarrolladas, la tinción da lugar a una coloración púrpura intensa localizada en la zona de la cubierta o membrana, lo que indica altos niveles de biomasa adherida (Figura 2A). Las señales visuales durante los pasos de tinción y solubilización también proporcionan indicadores útiles del éxito del protocolo. Por ejemplo, una distribución desigual de la CV o la mancha pálida pueden deberse a la subsiembra, evaporación o lavado agresivo que desprende biopelículas tempranas.

Las lecturas de absorbancia a 570 nm reflejan la cantidad de tinte retenido y, por tanto, la densidad relativa de biofilm (Figura 2B). En experimentos representativos, los cultivos de L. interrogans cultivados bajo condiciones óptimas muestran lecturas consistentes y reproducibles de OD₅₇₀ entre réplicas, reflejando una formación estable de biopelículas. En cambio, a menudo se observan grandes variaciones entre réplicas cuando las muestras sufren un pipeteo excesivo durante los cambios de medio, lo que indica una mala adhesión o desprendimiento parcial de biopelícula. Dicha variabilidad debe considerarse un signo de problemas técnicos, y las muestras afectadas deben ser excluidas o el protocolo revisado cuidadosamente. Cabe destacar que L. biflexa Patoc forma biopelículas más extensas tanto en las cubiertas de vidrio como en las membranas de policarbonato bajo condiciones similares, lo que se refleja en valores de absorción CV más altos, demostrando que el protocolo es adaptable y eficaz entre especies de Leptospira .

Una preparación exitosa del SEM puede revelar depósitos de matriz extracelular tan pronto como el día 3, seguidos de una arquitectura notablemente polarizada en biopelículas maduras: una cara basal rugosa y canalizada (a menudo con > canales de 5 μm) que ancla una estructura interna porosa, y una cara apical más lisa donde las espiroquetas yacen entrelazadas en una matriz densa (Figura 2C, D, E, F). Los campos de alta magnificación capturan frecuentemente filamentos extracelulares ramificados y ocasionales protuberancias similares a setas; características que corresponden a la dinámica de coalescencia observada por el time-lapse (vídeo suplementario 1). En preparaciones subóptimas, pueden observarse matrices colapsadas, cargas y contornos celulares indistintos, que suelen reflejar una postfijación inadecuada, un recubrimiento conductor insuficiente o un secado deficiente. Cuando la polaridad basal-apical y los canales penetrantes son evidentes, las lecturas del SEM coinciden estrechamente con las estimaciones confocales de grosor y porosidad, confirmando la ejecución exitosa tanto de la preparación como de la imagen.

En series efectivas de time-lapse, los puntos aislados aparecen en un plazo de 24-72 horas y se agrupan progresivamente en agregados mayores que barren la superficie antes de que las limitaciones de espacio ralenticen su movimiento (Figura 3A, B, C). La segmentación cuantitativa produce un aumento monótono en el área total cubierta, mientras que los conteos agregados aumentan, alcanzan su pico y luego disminuyen a medida que las colisiones y fusiones dominan entre ~12 y 216 horas. Estas cinéticas (área hacia arriba, agregados en número inferior) indican acreción activa en lugar de simple sedimentación. Las carreras fallidas o al borde carecen de puntos tempranos, muestran curvas de área plana a lo largo del tiempo o sufren deriva de enfoque relacionada con temperatura/humedad inestables. Mantener un entorno estabilizado de 30 °C con un 95% de humedad y usar el enfoque automático en cada momento suele restaurar trayectorias claras adecuadas para comparar mutantes o tratamientos.

Pilas Z representativas de biofilms maduros muestran una arquitectura multicapa similar a espuma que suele superar los 50 μm de grosor, con la mayoría de las células teñiendo vivas (SYTO 9-positivo) y ocasionales vacíos centrales indicativos de reordenamientos colectivos durante el crecimiento (Figura 3D). Las sondas matriciales pueden utilizarse para investigar la composición matricial: WGA destaca epítopos polisacáridos, BOBO-3 marca abundante ADN extracelular y las tinciones selectivas para proteínas aportan poco fuera de la señal asociada a la célula (Figura 3E). Los resultados subóptimos incluyen pilas delgadas o discontinuas dominadas por yoduro de propidio, fotoblanqueo fuerte o ajustes de ganancia inconsistentes, cada uno de los cuales socava la comparabilidad cuantitativa. Interpretar conjuntamente el espesor, el biovolumen y las proporciones vivas/muertas (manteniendo constante la potencia láser, la ganancia del detector y el orificio estenopeico en todas las condiciones) confirma el estado de maduración y permite comparaciones directas con la ultraestructura del SEM y la biomasa CV.

El proceso de formación de biofilm de Leptospira suele seguir fases distintas, aunque los tiempos y valores exactos pueden variar según la especie o la cepa. Usando la cepa L. interrogans Manilae L495 como referencia, la progresión esperada durante 21 días incluye una fase inicial (días 0-3) en la que las bacterias permanecen mayormente planctónicas con biofilm mínimo (Figura 4A). Esto es seguido por una fase de crecimiento exponencial (días 3-7) durante la cual tanto las bacterias planctónicas como las asociadas a biofilm aumentan, alcanzando alrededor de 9 x 10⁸ células/mL, acompañadas de la formación y expansión de agregados de biofilm. Entre los días 7 y 12, las bacterias planctónicas disminuyen significativamente, mientras que las células asociadas a biopelículas alcanzan su pico, representando aproximadamente el 80% de la población. Finalmente, durante la fase de maduración (días 12-21), el número de bacterias de biofilm disminuye sin aumentar las células planctónicas, aunque el tamaño y la complejidad de la biopelícula continúan creciendo. Observar esta secuencia de cambios indica que el protocolo captura eficazmente el desarrollo dinámico y la maduración de las biopelículas de Leptospira .

Cuando se realiza correctamente, el protocolo de infección utiliza inóculos que contienen ~2 leptospiras de 10⁸ en 200 μL de EMJH, preparadas a partir de cultivos planctónicos bien definidos (5 días) o biofilm (21 días). Aunque estos dos tipos de cultivo representan estados fisiológicos distintos, esta diferencia es intencionada, ya que el experimento busca determinar si los biofilms de Leptospira —caracterizados por una actividad metabólica reducida y diferenciación estructural— mantienen la capacidad de iniciar la infección. Este contraste está respaldado por estudios transcriptómicos que muestran grandes cambios en la expresión génica entre planctónica y biopelícula Leptospira^35,36. Los agregados de biofilm se cosechan cuidadosamente para preservar su estructura y permanecen intactos tras pasar por una aguja de 21 G, como se confirma antes de la inyección (Figura 4C, D). Tras la inyección intraperitoneal, los hámsters sirios dorados suelen mostrar signos clínicos de leptospirosis en un plazo de 3 a 5 días (por ejemplo, letargo, pelaje despeinado, postración). Los controles negativos inyectados solo con medio EMJH no muestran signos de enfermedad. La progresión y gravedad de los signos clínicos, así como el tiempo hasta la eutanasia, varían según el inóculo: las bacterias planctónicas suelen inducir síntomas más tempranos y agudos, mientras que los agregados derivados de biofilm pueden causar una infección retardada pero persistente (Figura 4B). Monitorizar dos veces al día durante hasta 21 días permite captar el curso completo de la enfermedad.

Figura 2. Tinción, cuantificación e imágenes ultraestructurales de violeta cristalino de biopelículas de Leptospira. (A) Tinción de violeta cristalino (CV) de biofilms crecidos sobre diferentes sustratos. La tinción CV permite visualizar la arquitectura de biofilm y los patrones iniciales de fijación para diferentes especies y sustratos. i. L. interrogantes sobre filtros de policarbonato; ii. L. biflexa en filtro de policarbonato; iii. L. interrogantes sobre la cubierta de cristal; iv. L. biflexa sobre cubierta de cristal. (B) Ejemplo de formación cuantitativa de biofilm evaluada mediante la absorbancia CV (OD570 nm) a lo largo del tiempo para L. interrogans y L. biflexa. Esta lectura cinética captura tanto la dinámica temprana de adhesión como la acumulación de biomasa, destacando diferencias en el crecimiento de biopelículas entre especies patógenas y saprófitas. Esta cifra ha sido modificada respecto a²⁷. (C-E) Microscopía electrónica de barrido (SEM) de biopelículas de L. interrogans: (c) biopelícula de hace 3 días que muestra la formación temprana de microcolonias y la deposición inicial de la matriz extracelular; (d) biofilm de 14 días que muestra arquitectura madura con una extensa organización matricial y tridimensional; (e-f) Biofilm de 3 semanas que ilustra la consolidación estructural y la maduración de la matriz sobre cultivos prolongados. Esta combinación de tinción CV, mediciones cuantitativas de OD e imágenes SEM ofrece una visión completa del desarrollo de biopelículas, desde la inserción temprana hasta la organización ultraestructural madura, permitiendo la comparación directa entre especies y duraciones de cultivo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3. Visualización de la formación de biofilm de Leptospira . Las imágenes de contraste de fase adquiridas con una BioStation muestran el desarrollo de biofilm a (A) 48 h, (B) 96 h y (C) 144 h. (D) reconstrucción CLSM de un biofilm de Leptospira que muestra biovolumen total con cortes ortogonales para visualización 3D. (E) Tinción confocal de una biopelícula madura con DAPI (verde) y WGA (rojo), destacando células bacterianas y componentes de la matriz extracelular. Esta cifra ha sido modificada respecto a³⁷. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4. Cuantificación resuelta en el tiempo de fracciones planctónicas y biofilmadas y evaluación funcional de biopelículas de Leptospira . (A) La cinética de la formación de biofilm medida por absorbancia a 405 nm. Para cada punto temporal, se tomaron lecturas del pozo total, la fracción de biofilm y el sobrenadante que contiene leptospiras planctónicas, permitiendo distinguir entre bacterias adheridas y bacterias que nadan libremente. (B) Ejemplos de curvas de supervivencia de hámsters inyectados con agregados de biofilm, leptospiras planctónicas o control EMJH. Los animales inyectados con biofilm muestran una virulencia reducida, algunos sobreviviendo 21 días, mientras que las leptospiras planctónicas provocan una mortalidad rápida. (C-D) Validación preliminar de la integridad del biofilm: los agregados son visibles en la jeringuilla antes de la inyección (C) y permanecen intactos tras pasar por una aguja de 21 G (D, flechas blancas), confirmando que la estructura del biofilm se conserva durante el manejo. Esta cifra ha sido modificada respecto a³⁶. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discussion

Este protocolo presenta un flujo de trabajo modular e integrador para estudiar biopelículas de Leptospira, integrando biomasa cuantitativa (violeta cristal)^9,27, dinámica (contraste de fase time-lapse), composición tridimensional (microscopía láser confocal con sondas dirigidas⁾³⁸, ultraestructura (microscopía electrónica de barrido) y evaluación funcional (infección de hámster). Al usar la misma serie de cultivos entre módulos, se minimizan los efectos por lotes y se habilita la validación cruzada dentro del experimento, lo cual es especialmente importante para espiroquetas frágiles y de crecimiento lento. Cada módulo complementa los demás: CV cuantifica "cuánto", time-lapse muestra "qué tan rápido", CLSM revela "lo que hay dentro", SEM resuelve "cómo está construido" y las pruebas in vivo proporcionan "prueba de funcionamiento". La inclusión de L. biflexa demuestra adaptabilidad entre especies, destacando una formación de biofilm más rápida y densa y enfatizando la flexibilidad^{metodológica 35}.

El éxito de cada módulo depende de la calidad del inoculo y del estado fisiológico. Los cultivos planctónicos de logaritmia media (3-5 días), altamente móviles y libres de agregados, producen adhesión reproducible y desarrollo de biopelículas. Solo deben utilizarse aislados de bajo paso para asegurar una formación robusta de biofilm y reproducibilidad.

El ensayo CV ancla el flujo de trabajo gracias a su velocidad, escalabilidad y rendimiento ^9,27. Permite un cribado rápido de mutantes, medios o compuestos antibiofilm. Sin embargo, dado que las biopelículas de Leptospira son frágiles y heterogéneas, la manipulación suave y la validación de la replicación son esenciales. CV no puede distinguir arquitecturas compactas de porosas ni detectar composición matricial — de ahí su papel como puerta de filtro para análisis estructurales más profundos.

La imagen en lapso de tiempo cierra esa brecha al revelar la cinética de biofilm en tiempo real. Captura la emergencia, coalescencia e inmovilización de agregados móviles, exponiendo fenómenos transitorios que los ensayos finales fallan. La estabilidad ambiental (temperatura, humedad, enfoque automático) es fundamental. Estos registros han demostrado que, incluso cuando la biomasa CV parece estable, la dinámica puede divergir, lo que indica reordenamientos estructurales o pérdida de viabilidad en estratos más profundos.

El CLSM proporciona información volumétrica y química sin artefactos de^{deshidratación 39}. La tinción viva/muerta revela gradientes de viabilidad celular dentro de la biopelícula, consistentes con informes de difusión limitada de oxígeno y estratificación^{metabólica 6,40}. Las lectinas y los colorantes de ácidos nucleicos exponen abundantes motivos de ADN extracelular y glicanos específicos, lo que permite la cuantificación y caracterización de los componentes de la matriz^41,42. Los datos de CLSM revelan frecuentemente vacíos internos, reflejando los reordenamientos colectivos observados en el^{time-lapse 38}. Aun así, las limitaciones incluyen la especificidad de la sonda, el fotoblanqueo y la resolución axial limitada por difracción; Por lo tanto, los ajustes del microscopio y el rendimiento del tinte deben estandarizarse y probarse previamente para garantizar resultados fiables y comparables entre experimentos.

SEM ofrece una resolución ultraestructural^{complementaria 43}. En las primeras etapas, resuelve agregados incipientes; a la madurez (≈ 15-21 días), revela una arquitectura polarizada: una capa basal rugosa y canalizada para anclaje e intercambio, y una superficie más lisa rica en matriz^{apical 37}. La fijación cuidadosa, el secado del HMDS y la correlación con datos confocales mitigan artefactos debidos a la deshidratación o^{colapso 44}.

En conjunto, estos cuatro módulos permiten la validación cruzada interna: cuando CV, CLSM y SEM convergen, las conclusiones son sólidas; Cuando divergen, las discrepancias en sí son informativas — revelando, por ejemplo, un aumento de biomasa con viabilidad reducida o biomasa inalterada con composición matricial alterada.

Permanecen varias limitaciones intrínsecas. Los biofilms de Leptospira son heterogéneos y delicados, lo que los hace sensibles al manejo y a la deshidratación. CV integra biomasa total pero no^{viabilidad 16}; El CLSM no puede superar los límites^{ópticos 38}; El SEM arriesga artefactos de preparación. Se espera mortalidad en estratos más profundos debido a gradientes de^{oxígeno 6}, pero este sesgo es sistemático y comparable entre condiciones. La maduración de la biopelícula alcanza un estancamiento alrededor de los 15-21 días, asociado a firmas transcripcionales de limitación de^{nutrientes 36}. Las etapas posteriores siguen estando poco caracterizadas.

Los ensayos in vivo proporcionan contexto funcional. La inyección de agregados por peritono examina intraperitonealmente si las células derivadas de biofilm difieren en virulencia o persistencia de las contrapartes planctónicas. Aunque la inoculación intraperitoneal no es una vía natural, ofrece un modelo comparativo^{controlado 36}. La heterogeneidad agregada introduce cierta variabilidad, pero un manejo consistente y el tamaño del inóculo coincidente mitigan esto. Es importante destacar que los rasgos de persistencia de biofilm (por ejemplo, tolerancia al estrés mediada por ECM) no necesariamente se traducen en una virulencia aguda aumentada, lo que pone de manifiesto el papel ecológico más que patogénico de la formación^{de biofilm 24}.

El diseño modular permite un uso escalable. Para un cribado rápido, la CV y el time-lapse son suficientes. Para una visión mecanicista, CLSM y SEM añaden resolución compositiva y arquitectónica. Los módulos pueden integrar perturbaciones enzimáticas o químicas (DNasa, glicosidasa), sondas alternativas para glicanos o ácidos nucleicos, o sistemas microfluídicos para probar respuestas de flujo. El mismo inóculo puede alimentar análisis transcriptómicos o proteómicos, vinculando directamente el fenotipo de biofilm con la regulación (por ejemplo, señalización c-di-GMP, respuesta a la inanición). Este marco también incluye el cribado mutante, pruebas de perturbación ambiental y evaluación de compuestos antibiofilm o antivirulencia.

Este flujo de trabajo integrado transforma observaciones aisladas en una comprensión multidimensional coherente de los biofilms de Leptospira. Al combinar el rendimiento (CV), la dinámica (time-lapse), la química y profundidad (CLSM) y la ultraestructura (SEM), el enfoque capta con fidelidad la naturaleza móvil, porosa y polarizada de las comunidades Leptospira. Ampliando estudios anteriores 17,35,36, demuestra que la experimentación coordinada y modular revela fenómenos invisibles para estudios de un solo método, como el aumento de biomasa a pesar de la disminución de la viabilidad, o la cinética divergente entre especies. En última instancia, este enfoque apoya análisis comparativos, reproducibles y funcionalmente relevantes entre especies, mutantes y condiciones, proporcionando una base para la microbiología mecanicista, la resiliencia ecológica y el diseño de estrategias antibiofilm.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 & micro; Membrana hidrofílica estéril de policarbonato	it4ip	1000M25/861N101/13
Cubierta de vidrio estéril de 12 mm	SPL	330164
16% de paraformaldehído (PFA) y nbsp;	Termo Científica	28908
Aguja de 21G	BD Medicina	304432
Microplaca de 24 pozos	NUNC	143982
Plato de fondo de cristal de 35 mm	Ibidi	81218-200
Plato Hi-Q4 con fondo de cristal de 35 mm	Ibidi	81156
Microplaca de 96 pozos	NIDO	701001
Medio de montaje antifade y nbsp;	Biorad	29410
Recubridor de carbono	Leica Microsystem	Em ACE600
Trazador CFDA/SE	Bioleyenda	423801
Adhesivo carbón conductor	Ciencia de la Microscopía Electrónica	77816
Violeta cristalino (CV)	Sigma	C3886
Microscopio de campo oscuro	Leica Microsystem	11888846	Leica DM4000 B equipada con condensador fiel oscuro (cat n° 11505142)
Etanol	VWR Chemicals	83813.36
FM4-64	Invitrogen	T3166
Ácido acético glacial	Supelco	1.00063
Solución de glutaraldehído	Sigma-Aldrich	G5882
Hexametildisilazano	Acros Organics	120581000
Incubadora	Memmert	IN30
Microscopio confocal invertido	Leica Microsystem	Leica DMI6000 TCS SP8 X	Microscopio confocal SP8
Microscopio invertido equipado con óptica de contraste de fase	Nikon	CELL-S2	BioStation IM-Q
Leptospira Base Media EMJH	Becton Dickinson	BD  279410	Medio EMJH para Leptospira
Tetróxido de osmio (OsO4)	Sigma	BCCG9181
Propidium yodur	Biotium	40017
Microscopio electrónico de barrido	JEOL	JSM-IT300
Amortiguador de cacodilato sódico	Química Termocientífica	15453149
Espectrofotómetro Varioskan Lux	Termo Científica	VLBL00GD0
Solución salina estéril tamponada con fosfato	Biosolve	0016232301BS
Jeringuilla (1 mL)	Chirana	CH03002L
Tinción de ácido nucleico fluorescente verde SYTO9	Invitrogen	S34854