Artículo de método

Imagen de superresolución de célula completa mediante DNA-PAINT en un disco confocal giratorio con reasignación óptica de fotones

1.3K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/69531

⸱

6 de enero de 2026

 ,  ,  , 
1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para realizar la microscopía de localización profunda de molécula única (SMLM) de célula entera utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con reasignación óptica de fotones, permitiendo así la obtención de imágenes DNA-PAINT sin necesidad de óptica personalizada ni iluminación compleja.

Resumen

La microscopía de localización de molécula única (SMLM) permite la obtención de imágenes a nanoescala de estructuras celulares, pero normalmente se limita a imágenes cerca del deslizamiento de cobertura debido a las limitaciones de la fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y la iluminación altamente inclinada y en lámina óptica (HILO). Aquí se presenta un protocolo que aprovecha un microscopio confocal de disco giratorio equipado con reasignación óptica de fotones (SDC-OPR) para realizar SMLM en células completas. Este método permite la obtención de imágenes de una sola molécula de alta precisión a lo largo de todo el volumen celular utilizando la acumulación de puntos de ADN para la imagen en topografía a nanoescala (DNA-PAINT) sin necesidad de ópticas personalizadas ni esquemas complejos de iluminación. El protocolo proporciona una guía paso a paso para configurar un microscopio de disco giratorio comercialmente disponible (por ejemplo, CSU-W1 SoRA) para la obtención de imágenes SMLM, incluyendo parámetros de adquisición optimizados para imágenes profundas. Se detallan los pasos de preparación de la muestra para marcar dianas intracelulares con sondas conjugadas con ADN para realizar imágenes DNA-PAINT, incluyendo estrategias para la imagen multicolor de varios blancos. La adquisición de imágenes es seguida por la localización y reconstrucción de moléculas individuales utilizando paquetes de software estándar. También se discuten consideraciones críticas para minimizar el fondo, optimizar la resolución lateral y garantizar la calidad de imagen a lo largo de toda la profundidad celular. Este protocolo accesible permite a los investigadores realizar SMLM profundo y de células completas utilizando equipos confocales estándar, ampliando el abanico de cuestiones biológicas que pueden abordarse mediante imágenes de molécula única más allá de las regiones cercanas a la membrana.

Introducción

La microscopía de localización de molécula única (SMLM)1 es una familia de técnicas de superresolución que logran resolución a nanoescala separando temporalmente la emisión de fluoróforos individuales y localizándolos con gran precisión. El éxito de la SMLM requiere una alta relación señal-ruido (SNR) para detectar eventos de molécula única, lo que tradicionalmente ha limitado su uso a configuraciones ópticas que proporcionan excitación intensa y localizada. Las configuraciones más comunes son la microscopía de fluorescencia por reflexión interna total (TIRF)2 y la iluminación óptica laminada laminada altamente inclinada (HILO) 3. El TIRF reduce la fluorescencia de fondo creando un campo evanescente que excita selectivamente los fluoróforos a pocos nanómetros del deslizante, suprimiendo así la iluminación desenfocada. Sin embargo, esta restricción hace que el TIRF no sea adecuado para obtener imágenes de estructuras biológicas más profundas, como orgánulos que se extienden al dominio extracelular. La microscopía HILO proporciona mayores profundidades de penetración, permitiendo obtener imágenes varios cientos de nanómetros por encima del sustrato de vidrio. Esto tiene el coste de un campo de visión (FOV) reducido y una iluminación desigual con planos cada vez más altos, limitando su aplicabilidad a estructuras celulares más grandes. Más recientemente, técnicas de microscopía de lámina de luz (LSM) como la lámina de luzen red 5,6,7 y la microscopía de iluminación de plano único objetivo único (soSPIM)8 han extendido la SMLM a la imagen volumétrica y a escala de tejido. Al moldear el haz de excitación en láminas delgadas y estructuradas, el LSM logra la sección óptica con una reducción del fondo y de la fototoxicidad. SoSPIM captura planos focales ortogonales al eje de detección en una sola exposición, permitiendo una imagen volumétrica rápida con resolución casi isotrópica. La aplicación soSPIM ha demostrado SMLM 3D en células enteras y pequeños orgánulos (>20 μm de profundidad) con resolución isotrópica de hasta 40 nm y con un fondo desenfocadomínimo 9. A pesar de sus fortalezas, estos métodos suelen requerir muestras transparentes, óptica especializada y alineación compleja, y siguen siendo sensibles a aberraciones ópticas y dispersión en muestras más gruesas.

La microscopía confocal ofrece una alternativa al rechazar la luz desenfocada mediante el uso de un agujero estenopeico delante del detector, combinado con espejos de barridode haz 10. Esta capacidad de seccionamiento óptico permite la imagen volumétrica profunda con alta resolución de la radiofrecuencia de la comunicación (SNR). En particular, la microscopía confocal de disco giratorio (SDC) combina la velocidad y la detección de campo amplio de la imagen convencional con la capacidad de seccionamiento de los sistemas de escaneo puntual. Esto se consigue en la SDC convencional mediante la incorporación de un disco giratorio con orificios paralelos, a menudo combinados con una matriz de microlentes alineada. Las microlentes recogen una parte sustancial de la fluorescencia emitida y la enfocan a través de los orificios estenopeicos, lo que reduce la señal de fondo. Esta configuración proporciona una sección óptica rápida sin necesidad de ópticas especializadas ni preparación adicional de montaje de muestras, lo que la convierte en una opción robusta que puede implementarse y optimizarse fácilmente para la adquisición de imágenes SMLMvolumétricas profundas 11.

En este estudio, se emplea la unidad de escáner confocal de disco giratorio CSU-W1 equipada con reasignación óptica de fotones (SDC-OPR). A diferencia del SDC estándar, SDC-OPR introduce una segunda matriz de microlentes que proyecta los fotones emitidos sobre un patrónestenopeico complementario 12, para mitigar la dispersión y recuperar fotones que de otro modo serían descartados. Esta reasignación de fotones aclara eficazmente la función de dispersión puntual (PSF), mejorando la resolución lateral más allá de la de la SDC convencional, mientras sigue rechazando la luzdesenfocada 13. Específicamente, la matriz de microlentes SDC-OPR redirige fotones fuera del eje hacia sus puntos de origen más cercanos, aumentando efectivamente el brillo de fluorescencia detectado en comparación con el SDC estándar. Además, los beneficios de resolución de SDC-OPR pueden amplificarse mediante deconvolución de imagen. Los algoritmos iterativos de deconvolución refinan computacionalmente la PSF, reducen el fondo y mejoran la relación señal-fondo sin requerir cambios en la configuración óptica. Este enfoque combinado proporciona una ventaja significativa en términos de precisión de localización frente al SDC estándar para experimentos de localización de moléculaúnica 14.

Aquí se presenta un protocolo robusto y reproducible para la microscopía de localización de molécula única utilizando un microscopio confocal de disco giratorio equipado con reasignación óptica de fotones (SDC-OPR). Este enfoque combina la precisión a nanoescala de DNA-PAINT con la velocidad, el campo de visión y la penetración en profundidad de la imagen de disco giratorio. DNA-PAINT, una adaptación de la acumulación puntual para la topografía a nanoescala (PAINT)15, se basa en la hibridación transitoria de hebras "imager" etiquetadas con fluorescencia con cadenas complementarias de "acoplamiento" ancladas a objetivos moleculares. Estos eventos de unión reversibles generan señales de fluorescencia estocásticas que pueden localizarse con precisión, permitiendo la reconstrucción de alta resolución de la ultraestructura celular. DNA-PAINT permite el uso de fluoróforos altamente fotostables, proporciona cinética de unión ajustable para un control preciso de las condiciones de imagen y mitiga el fotoblanqueo mediante la reposición continua de las hebras fluorescentesdel generador de imágenes 16.

Para garantizar la reproducibilidad y la especificidad, el enfoque se basa en conjugados personalizados de ADN-anticuerpos que enlazan las cadenas de acoplamiento con anticuerpos secundarios. Se presentan pasos detallados de preparación de la muestra, incluyendo la conjugación anticuerpo-ADN, para apoyar resultados experimentales sólidos. El protocolo se valida en estructuras celulares bien caracterizadas como complejos porosos nucleares (NPCs)17 y microtúbulos en muestras fijas, proporcionando un punto de referencia para estimar la precisión de la reconstrucción. Las variaciones en la resolución, cuantificadas mediante precisión de localización como un proxy, se evalúan además en función del campo de visión y la profundidad de imagen.

Además, la eficiencia de este flujo de trabajo para imágenes multiplexadas se demuestra utilizandoExchange-PAINT 18, una estrategia que permite la visualización secuencial de múltiples objetivos con el mismo colorante y una única fuente láser basada en DNA-PAINT. El flujo de trabajo Exchange-PAINT se aplica a la imagen multicolor de superresolución de mitocondrias, microtúbulos y NPCs dentro de la misma muestra.

En conjunto, este protocolo proporciona una guía completa y notas clave sobre adaptabilidad sobre conjugación anticuerpo-ADN, preparación de muestras, condiciones de imagen y análisis de datos, permitiendo a los investigadores realizar imágenes reproducibles de ADN-PAINT en SDC-OPR. Al extender la imagen de alta resolución más allá de las limitaciones de profundidad y campo de visión de los enfoques basados en TIRF, este método amplía la aplicabilidad de SMLM a una amplia gama de contextos biológicos.

Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de los tampones

  1. Preparación del tampón del citoesqueleto (CB):
    1. Prepara 10 mM de MES (pH 6,1) con 150 mM de NaCl, 5 mM de EGTA, 5 mM de D-glucosa y 5 mMde MgCl 2 en 1x solución tampón de fosfato filtrada (PBS).
    2. Guárdalos a 4 °C y filtrar antes de usarlos.
  2. Preparación de stock de ácido protocatecatechi (PCA) 40x:
    1. Disuelve 154 mg de PCA en 10 mL de agua destilada y filtrada.
    2. Ajusta el pH a 9,0 con NaOH.
    3. Alúcalo y guarda a -20°C durante un máximo de 6 meses.
      NOTA: Si alguna alicuela aparece marrón, deséchala, ya que esto indica oxidación.
  3. Preparación del stock de 100x protocatechuato-3,4-dioxigenasa (PCD):
    1. Prepara una solución de glicerol al 50% con 50 mM de KCl, 1 mM de EDTA y 100 mM de tampón Tris.
    2. Disuelve 2,2 mg de PCD en 3,4 mL de la solución de glicerol.
    3. Alicota y guarda a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
  4. Preparación de la culata 100x Trolox:
    1. Disolver 50 mg de Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico) en 215 μL de metanol hasta que la solución se vuelva verde dentro de una campana extractora química utilizando el equipo de protección individual (EPI) adecuado.
    2. Añade 1,6 mL de agua destilada y filtrada. Deja que la solución se ponga blanca y empiece a solidificarse.
    3. Añade 175 μL de 1M NaOH 1M. Deja que la solución vuelva a volverse líquida.
    4. En volúmenes de 10 μL, continúa añadiendo 1 M de NaOH hasta que la solución esté totalmente aclarada (alrededor de 40 μL).
    5. Alicota y guarda a -20 °C durante un máximo de 6 meses. La solución final parece amarillenta.
      NOTA: La solución final de 100x tiene un pH de 11, pero una dilución a 1x da lugar a un pH de 7-8.
  5. Búfer C+
    1. Prepara 1 mM de EDTA, 500 mM de NaCl y una solución Tween-20 al 0,02% en 1x PBS.
    2. Ajusta el pH a 7,4 con HCl y/o NaOH según sea necesario.
    3. Suplemento opcional de Trolox: Añadir los volúmenes necesarios de reservas de PCA (40x), PCD (100x) y Trolox (100x) para obtener diluciones 1x, dejar la solución equilibrada durante 1 hora a temperatura ambiente (23 °C) antes de usarla.
      NOTA: Prepárate fresco cada semana. Si usas Trolox, úsalo en menos de 4 horas después de mezclar.
  6. Amortiguadores de inmunotinción (paraformaldehído PFA, glicina y tritón):
    1. Para una preparación de PFA al 4% de una ampola de 10 mL y 16% de PFA:
      1. Dentro de una campana extractora química, abre cuidadosamente la ampolla.
      2. Decantar 10 mL de PFA al 16% en un tubo centrífugo cónico de 50 mL.
      3. Realiza una dilución 1:4 en 1x PBS para obtener un 4% de PFA, añadiendo cuidadosamente ~30 mL de PBS 1x filtrado al 16% de PFA decantado, para que el volumen final sea de ~40 mL.
      4. Alocuota en tubos microcentrífugas de 1 mL y guarda a -20 °C hasta que sea necesario.
    2. Para 60 mM de glicina en preparación PBS:
      1. Pesa 225 mg de glicina en un tubo centrífugo cónico de 50 mL.
      2. Añade 50 mL de PBS 1x filtrado.
      3. Haz el vórtice hasta que esté completamente mezclado y filtra.
      4. Guárdalos a 4 °C hasta que sea necesario.
    3. Para una preparación del 0,1% del Triton X-100:
      1. Primero, preparar un stock de trabajo de 10% de Triton X-100 diluyendo 1 mL de 100% Triton X-100 en 9 mL de PBS 1x filtrado (volumen final = 10 mL), pipetear y mezclar lentamente para evitar que se sobreburbujee. Guárdalos a 4 °C hasta que sea necesario.
      2. Del material de trabajo del 10%, añadir 0,1 mL de Triton X-100 al 10% a 9,9 mL de PBS 1x filtrado para el stock final al 0,1%, mezclando de nuevo lentamente. Guárdalos a 4 °C hasta que sea necesario.

2. Conjugación anticuerpo-ADN

  1. Concentra el anticuerpo usando una unidad de filtro centrífugo de ultrafiltración de 100 kDa:
    1. Lava la unidad de filtro centrífugo de ultrafiltración de 100 kDa con 100 μL de PBS filtrado 1x durante 30 minutos a 14.000 x g, 4 °C.
    2. Añadir 100 μL de anticuerpos con 200 μL de PBS filtrado 1x a la unidad de filtro centrífugo de ultrafiltración de 100 kDa previamente lavada, centrifugar durante 30 minutos a 14.000 x g, 4° C. Asegúrese de que la concentración de anticuerpos sea superior a 1,5 mg/mL tras la concentración con el filtro centrífugo de ultrafiltración. Con este método, el filtro centrífugo de ultrafiltración suele concentrar el anticuerpo en ~3 veces.
    3. Invierte la unidad de filtro centrífugo de ultrafiltración de 100 kDa en un tubo limpio, centrifuga durante 6 minutos a 1000 x g, 4 °C. Este es el anticuerpo concentrado en PBS.
    4. Mide el volumen del anticuerpo concentrado (1 o 2 μL) para calcular la nueva concentración y ejecuta un espectro de absorción UV-Vis con un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen. Pon el fondo en 1x PBS y guarda los espectros.
  2. Reducir la cadena de acoplamiento de ADN tiolado:
    1. Disuelva 7,7 mg de DTT prepesado en 100 μL de agua filtrada y transfiera a un tubo nuevo.
    2. Añadir 100 μL de 3 mM EDTA en 1 PBS al tubo original de DTT, vórtice y transfiere al mismo tubo que el paso 2.2.1, resultando en 200 μL de 250 mM DTT en 1,5 mM EDTA en 1x PBS.
    3. Disolver la cadena de acoplamiento de ADN tiolado en PBS filtrado 1x para una concentración final de 1 mM. Graba un espectro UV-Vis de la solución de la cadena de acoplamiento de ADN (diluido a 10 μM en 1x PBS) y sálvalo usando el espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen.
    4. Mezclar 13 μL de ADN tiolado (1 mM) con 30 μL de DTT (250 mM), agitar durante 2 h a temperatura ambiente (23 °C).
      NOTA: Almacenar las cadenas de acoplamiento de ADN no utilizadas restantes en alicotas de 13 μL a -20 °C para futuras reacciones.
  3. Conjugación de anticuerpos con el entrecruz:
    1. Disolver el entrecruzamiento de maleimida-PEG2-succinimidil éster en DMSO a 10 mg/mL (23,5 mM). Almacena 10 μL de alicuotas a -20 °C hasta que sea necesario.
    2. Mezcla el anticuerpo concentrado del paso 2.1 con 20x molar de exceso del entrecruzado. Incuba durante 90 minutos, agitando, a 4 °C.
  4. Purificar el filtrado de anticuerpos cruzados con una columna de desalación de espín de 7,0 KDa que contenga resina de exclusión de tamaño (corte de 7 kDa de peso molecular):
    1. Quita el cierre inferior de la columna de desalación de spin de 7,0 kDa y afloja la tapa. Colócalo en un tubo de microcentrífuga de baja unión a proteínas. Centrifugar durante 1 minuto a 1500 x g, 4 °C.
      NOTA: Marca la inclinación de la resina después del primer giro. Para todos los usos posteriores de la columna, coloca la inclinación directamente hacia afuera sobre la centrífuga. Aplica muestras y lavados en el centro y evita el contacto con la cama de resina.
    2. Añade 300 μL de PBS filtrado 1x al filtro de columna de desalación de spin de 7,0 kDa, afloja la tapa y centrifuga durante 1 minuto a 1500 x g, 4 °C. Repite dos veces más.
      NOTA: Dejar la columna de desalación de espín de 7,0 KDa con 300 μL de 1x PBS hasta que la reacción anticuerpo-entrecruzador esté lista; No permitas que la columna se seque.
    3. Retira los últimos 300 μL de lavado PBS centrifugando de nuevo durante 1 minuto a 1500 x g, 4 °C.
    4. Aplica la solución de reticulación de anticuerpos en el centro de la cama de resina, gota a gota. Coloca la columna de desalación de spin de 7,0 kDa en un tubo de microcentrífuga limpio, centrífuga durante 2 minutos a 1500 x g, 4 °C. El producto de reticulación de anticuerpos se encuentra ahora en el tubo de la microcentrífuga; mantén a 4 °C o en hielo.
  5. Purificar la mezcla ADN-DTT con columnas de espín desaladas con Sephadex G-25 (resina de exclusión de tamaño para purificación del ADN):
    1. Vierte las columnas de espín dessalinizadoras (purificación del ADN) para que la resina se distribuya de manera uniforme. Quita el cierre inferior y afloja la tapa, y colócalo en un tubo limpio de microcentrífuga.
    2. Desalar columnas de spin con centrifugadora (purificación de ADN) a 735 x g durante 1 minuto para eliminar el tampón de almacenamiento.
    3. Coloca columnas de spin desalificantes (purificación de ADN) en un tubo microcentrífuga nuevo y añade lentamente la mezcla de ADN/DTT al centro de la resina. Centrifugar a 735 x g durante 2 minutos. El ADN purificado y reducido estará ahora en el tubo de la microcentrífuga.
  6. Combina ADN y productos de reticulación de anticuerpos:
    1. Añadir el ADN reducido al producto de reticulación de anticuerpos a un exceso de ADN:anticuerpo 10 molares. Mezcla el ADN purificado con el producto de reticulación de anticuerpos inmediatamente después de la purificación. Esto impide que el ADN se vuelva a unir.
    2. Incubar toda la noche, agitando, a 4 °C.
      NOTA: Mezcla el ADN y el anticuerpo a última hora de la tarde y purícalos inmediatamente a la mañana siguiente. La incubación prolongada de ADN y anticuerpos puede resultar en una alta relación ADN:anticuerpos.
  7. Eliminar el exceso de ADN con una unidad de filtro centrífugo de ultrafiltración de 100 kDa a la mañana siguiente:
    1. Lava la unidad de filtro centrífugo de ultrafiltración de 100 kDa con 300 μL de PBS filtrado 1x durante 30 minutos a 14.000 x g, 4 °C.
    2. Añadir la mezcla ADN-anticuerpos con 300 μL de PBS filtrado 1x a la unidad filtrante centrífuga de ultrafiltración de 100 kDa y centrifugar durante 30 minutos a 14.000 x g, 4 °C.
    3. Invierte la unidad de filtro centrífugo de ultrafiltración en un tubo limpio, centrifuga durante 6 minutos a 1000 x g, 4 °C. Este es el producto concentrado en PBS.
    4. Diluir el producto a 100 μL en PBS 1x filtrado.
    5. Grabar un espectro UV-Vis del producto (1 o 2 μL) usando el espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen, con un fondo de 1x PBS, y guardar los espectros.
    6. Mide la concentración final y la proporción ADN:anticuerpos a partir de los espectros. Observa un cambio en el pico de absorbancia del anticuerpo de 280 nm a 260 nm, debido a la absorción extra del ADN. Utiliza el paso 2.8 para determinar la concentración y la proporción ADN:anticuerpos.
    7. Almacena el producto en las condiciones originales de almacenamiento del anticuerpo utilizado. Si se congela, evita los ciclos de congelación y descongelación.
  8. Calcular la proporción ADN:anticuerpos a partir de los espectros UV-Vis:
    1. A partir de los espectros de ADN puro (10 μM en 1x PBS), mide los valores de absorbancia a 260 nm (Ecuación 1) y 280 nm (Ecuación 2). Divídelos por la concentración de ADN (10 μM) para encontrar los coeficientes molares de absorción del ADN (Ecuación 3 y Ecuación 4).
    2. Repite para que el anticuerpo encuentre Ecuación 5 y Ecuación 6, recordando dividir por la concentración de anticuerpo utilizado para los espectros.
    3. A partir del espectro del producto, la absorción a 260 nm y 280 nm depende tanto de la absorbancia del ADN como del anticuerpo:
      Ecuación 7
      Ecuación 8
      Donde cDNA y cAb son las concentraciones de ADN y anticuerpo, respectivamente, dentro del producto final. Resuelve estas ecuaciones simultáneamente para encontrar la concentración molar tanto del ADN como del anticuerpo dentro del producto. Calcula la proporción ADN:anticuerpo usando estas concentraciones.
      NOTA: La concentración del anticuerpo para el primer espectro puede calcularse midiendo el volumen de anticuerpo restante tras la filtración con la unidad de filtración centrífuga de ultrafiltración de 100 kDa y comparándolo con el volumen original (con concentración conocida) de anticuerpo utilizado.

3. Cultivo celular

  1. Células HeLa Kyoto mEGFP-Nup107.
    1. Prepara un stock de medio de cultivo celular, el Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, complementado con suero fetal bovino al 10% (FBS) y 1% penicilina/estreptomicina (P/S), y almóntalo a 4 °C. Precalienta el medio 30 minutos antes de usarlo en un baño María a 37 °C. Dependiendo de las condiciones de trabajo, se recomienda alicuar y filtrar la cantidad necesaria para evitar contaminaciones.
    2. Células semilla a 2 x 105 células/mL en 7 mL de medio DMEM suplementado precalentado en matrazas T25. Coloque los frascos celulares en una incubadora adecuada a 37 °C y un ambiente con 5% deCO2 .
    3. Asegura el paso cada 48-72 horas para evitar el hacinamiento.
      1. Tomemos el matraz T25 que contiene el cultivo confluente y aspira el medio del matraz.
      2. Pipett 1 mL de tripsina EDTA (TE), asegurando una cobertura completa inclinando suavemente el frasco. Incubar a 37 °C durante 7 minutos para permitir el desprendimiento celular del matraz.
      3. Añade 2 mL de medios DMEM suplementados y tritura.
      4. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo centrífugo cónico de 15 mL con 7 mL adicionales de medio DMEM suplementado.
      5. Centrifuga a 400 x g durante 5 minutos. Comprueba cuidadosamente la formación de los pellets en la parte inferior del tubo sin molestarlo.
      6. Aspira el medio y vuelve a suspender el pellet celular en medios suplementados de DMEM.
      7. Semilla 2 x 105 células/mL en un nuevo matraz de T25 que contenga 7 mL de medio precalentado. Incubar a 37 °C y 5% deCO2.
        NOTA: Si no se está seguro de la densidad celular, se podría usar un hemocitómetro para determinar el recuento celular. Se recomienda comenzar con una resuspensión de pellets de 1 mL antes de contar con ellas.
  2. Celdas U2OS CRISPR mEGFP-Nup96
    1. Prepara un 10% FBS y un P/S del 1% complementados con los medios 5A de McCoy, según el paso 3.1.1.
    2. Células semilla a 2 x 105 células/mL en 7 mL de medio McCoy's 5A suplementado en frascos T25. Incubar a 37 °C y 5% deCO2.
    3. Paso cada 48 horas para mantener el crecimiento de la cultura por debajo del 80% de confluencia:
      1. Aspira el medio de un matraz y lava suavemente el cultivo adherente con 2 mL de PBS filtrado precalentado (37 °C).
      2. Aspira PBS y añade 2 mL de Accutasa, inclinando lentamente el matraz para asegurar una cobertura completa, y luego incuba a 37 °C durante 7 minutos.
      3. Añade 2 mL de medios McCoy's 5A suplementados y tritura.
      4. Añade 7 mL de medio a la suspensión de la celda y transfierela a un tubo centrífugo cónico de 15 mL o 50 mL para centrifugación. Centrifuga a 400 x g durante 5 minutos y comprueba la formación de pellets en la parte inferior del tubo.
      5. Resuspende el pellet celular en medios 5A de McCoy suplementados.
      6. Siembra a 2 x 105 células/mL en un nuevo matraz T25 con 7 mL de medio precalentado. Incubar a 37 °C y 5% deCO2.
        NOTA: Calienta todas las soluciones añadidas a las células a 37 °C en un baño de agua o de perlas. Para la Accutasa, calienta solo 2 mL de alicuotas durante no más de 5 minutos para evitar degradación.

4. Inmunotinción de Nup96, mitocondrias y microtúbulos

  1. Preparación de celdas U2OS mEGFP-Nup96
    1. Siguiendo los pasos descritos en el paso 3.2, aspira medios de un matraz de T25 y lava suavemente las células adheridas con 2 mL de PBS filtrado 1x.
    2. Aspira PBS y añade 2 mL de Accutasa, inclina lentamente el matraz arriba y abajo, e incuba a 37 °C durante 7 minutos para favorecer el desprendimiento celular.
    3. Añade 2 mL de medios McCoy's 5A suplementados y tritura.
    4. Suspensión de celda superior con 7 mL de medio McCoy's 5A suplementado y transfiere a un tubo centrífugo cónico de 15 mL o 50 mL antes de centrifugar a 400 x g durante 5 minutos. De nuevo, comprueba la formación de los pellets en la parte inferior del tubo.
    5. Resuspende el pellet celular en medios 5A de McCoy suplementados.
    6. Las células semilla a 1 x 105 células/mL en microdiapositivas de 8 pozos e incuban en la incubadora celular (37 °C, 5% CO2) durante la noche.
      NOTA: Aplicar las células de semilla 24 horas antes de los procedimientos de fijación e inmunotinción, para permitir la adherencia.
  2. Inmunotinción de células U2OS mEGFP-Nup96 para imagen Nup96
    1. Tras la incubación nocturna, sustituye el medio McCoy's 5A en las microláminas de 8 pozos por PBS filtrado 1x. En rápida sucesión, aspira el PBS y añade la solución de fijación de PFA al 4% precalentada (37 °C) en una campana extractora química.
    2. Deja que las células se fijen durante 30 minutos a temperatura ambiente (23 °C), preferiblemente dentro de la campana extractora química, antes de lavar el PFA y descartar los residuos. Ahora todos los pasos pueden realizarse a temperatura ambiente, salvo que se indique lo contrario.
    3. Retira la solución de fijación al 4% de PFA y lava el portaobjetos 3 veces 3 minutos con 1 PBS.
      PRECAUCIÓN: Utilice PFA en una campana extractora química mientras se usa el EPI adecuado.
    4. Tras la fijación, permeabiliza la membrana celular añadiendo 0,1% de Triton X-100 en una solución PBS 1x. Déjalo reposar 5 minutos, luego lava 3 x 3 minutos con 60 mM de glicina en 1 PBS, para calmar la autofluorescencia del PFA residual.
      NOTA: La solución de permeabilización de Triton es extremadamente sensible al tiempo y podría alterar la integridad de la estructura celular si se deja reposar demasiado tiempo.
    5. Añade 5% de BSA en 1x PBS durante 1 hora en la oscuridad, para bloquear las células antes de la inmunotinción.
    6. Preparar 20 nM del nanocuerpo anti-GFP conjugado con ADN en solución bloqueante (5% de BSA en 1x PBS) para evitar bloqueos de unión inespecíficos. Incuba la lámina con la mezcla de nanocuerpos durante 1 hora a temperatura ambiente (23 °C), luego lava las cadenas de ADN no unidas durante 3 x 3 minutos con PBS filtrado 1x.
      NOTA: Punto de pausa: Tras la fijación, bloqueo y adición de anticuerpos, las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante la noche. Este punto de pausa se incluye principalmente por el tiempo requerido para la preparación de la muestra, más que por ser una necesidad estricta del protocolo. La imagen puede proceder inmediatamente después de estos pasos si se prefiere.
  3. Inmunotinción de células U2OS mEGFP-Nup96 para imagen de mitocondrias y microtúbulos
    1. Tras una incubación nocturna, se sustituye simultáneamente el medio DMEM en las microláminas de 8 pozos por 200 μL de glutaraldehído al 0,3% y 0,25% de Triton X-100 en el buffer del citoesqueleto (CB) y dejarlo durante 2 minutos para la prefijación.
    2. Sustituir la solución de prefijación por un tampón del citoesqueleto (CB) suplementado con glutaraldehído al 2%. Déjalo reposar 10 minutos para fijar las células, luego lava la lámina 3 x 3 minutos con 60 mM de glicina en PBS, como en el paso 4.2.4.
      PRECAUCIÓN: Utiliza glutaraldehído en una campana extractora química mientras llevas el EPI adecuado.
    3. Añadir ADN de esperma de salmón cortado al 3% en 1 PBS durante 1 hora en la oscuridad, para bloquear las células antes de la inmunotinción.
    4. Añadir 5 μg/mL de antitubulina conjugada con ADN (conjugada como se ha descrito anteriormente), para la imagen de microtúbulos, y/o 1:200 de anticuerpo TOM20, para la imagen de mitocondrias, en un 2% de BSA durante 2 horas a temperatura ambiente (23 °C). Lava 3 x 3 minutos con 1 PBS.
    5. Añade 25 nM de IgG anti-conejo conjugado con ADN sdAb e incuba durante 1 hora a temperatura ambiente (23 °C). Lava 3 x 3 minutos con 1 PBS.
      NOTA: Punto de pausa: Tras la fijación, bloqueo y adición de anticuerpos, las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante la noche. Este punto de pausa se incluye principalmente por el tiempo requerido para la preparación de la muestra, más que por ser una necesidad estricta del protocolo. La imagen puede proceder inmediatamente después de estos pasos si se prefiere.
  4. Preparación de células HeLa Kyoto mEGFP-Nup107
    1. Aspira el medio del matraz T25 de células HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 y lava suavemente el matraz con 2 mL de PBS filtrado 1x.
    2. Aspira PBS y añade 2 mL de tripsina EDTA (TE) y inclina lentamente el matraz hacia arriba y hacia abajo, incuba a 37 °C durante 7 minutos.
    3. Añade 2 mL de medios DMEM suplementados y tritura.
    4. Añadir la solución de celda a un tubo centrífugo cónico de 15 mL con 7 mL adicionales de medio DMEM suplementado y centrifugar a 400 x g durante 5 minutos. Comprueba la formación de pellets en la parte inferior del tubo.
    5. Vuelve a suspender el pellet celular en un medio suplementado de DMEM.
    6. Células semilla a 1 x 105 celdas/mL en microdiapositivas de 8 pozos.
      NOTA: Células semilla 24 horas antes de la imagen.
  5. Inmunotinción de HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 para microtúbulos
    1. Tras una incubación nocturna, se sustituye simultáneamente el medio DMEM en las microláminas de 8 pozos por 200 μL de glutaraldehído al 0,3% y 0,25% de Triton X-100 en el buffer del citoesqueleto (CB) y dejarlo durante 2 minutos para la prefijación.
    2. Sustituye la solución de prefijación por glutaraldehído al 2% en CB y déjala 10 minutos para la fijación celular. Lava 3 x 3 minutos con 60 mM de glicina en 1x PBS.
      PRECAUCIÓN: Utiliza glutaraldehído en una campana extractora química mientras llevas el EPI adecuado.
    3. Añade 5% de BSA en 1x PBS durante 1 hora en la oscuridad, para bloquear las células antes de la inmunotinción.
    4. Añadir 5 μg/mL de antitubulina conjugada con ADN (conjugada como se ha descrito anteriormente), para la imagen de microtúbulos en un 5% de BSA en 1x PBS durante 2 horas a temperatura ambiente (23 °C). Lava 3 x 3 minutos con 1 PBS.
      NOTA: Punto de pausa: Tras la fijación, bloqueo y adición de anticuerpos, las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante la noche. Este punto de pausa se incluye principalmente por el tiempo requerido para la preparación de la muestra, más que por ser una necesidad estricta del protocolo. La imagen puede proceder inmediatamente después de estos pasos si se prefiere.
    5. NOTA: Al trabajar con anticuerpos o líneas celulares alternativas, ajusta los factores de dilución para el anticuerpo o nanocuerpo acoplado al ADN según las recomendaciones del fabricante.
  6. Preparación de imágenes
    NOTA: Este paso es común a todos los protocolos de inmunotinción.
    1. Añade nanopartículas de oro de 90 nm diluidas 1:2 en agua desionizada directamente a cada pozo, utilizando el volumen completo del pozo. Incubar durante 5 minutos para permitir la corrección de deriva futura durante la imagen. Lava los pozos 3 veces con 1 PBS.
    2. Para la imagen de Nup96, añade la hebra deseada del imagador a 1 nM en un buffer C+ complementado con 1x Trolox, 1x PCA y 1x PCD.
    3. Para Exchange-PAINT de mitocondrias y/o microtúbulos, añadir la primera hebra deseada del imagador a 1 nM solo en el buffer de C+. Tras la primera prueba de imagen, lava la muestra a fondo pero con cuidado para eliminar todas las hebras residuales del imagador sin mover la muestra. Normalmente, con 5 lavados y 30 segundos de espera entre ambos es suficiente. Luego añade la segunda hebra del imager a 1 nM solo en el búfer C+ para la segunda ronda de imagen.

5. Configuración y parámetros de imagen: Microscopía de localización de molécula única

NOTA: Las imágenes mostradas en este protocolo se adquirieron en la instalación de microscopía de superresolución LMCB en University College London, Reino Unido, utilizando un microscopio confocal de disco giratorio comercialmente disponible, equipado con una cámara sCMOS y operado mediante el software NIS-Elements.

  1. Utiliza un sistema confocal de disco giratorio con excitación multifocal y una cámara sCMOS.
  2. Enciende el sistema 30 minutos antes de la imagen: enciende el microscopio, la cámara y los láseres, luego enciende el ordenador. Espera a que el software NIS-Elements cargue completamente.
  3. Seleccione el modo de imagen apropiado en NIS-Elements: confocal de disco giratorio estándar o SDC-OPR SoRA super-resolución, antes de establecer parámetros de adquisición.
  4. Elige el objetivo de inmersión en aceite Apo NA 1.49 de 60× para imágenes SDC o SDC-OPR para maximizar la detección de eventos de molécula única y así mejorar el postprocesamiento.
  5. Selecciona la ampliación adecuada (1×, 2,8× o 4×) según el objetivo, los ajustes de la cámara y la muestra a estudiar. Ajusta el binning de la cámara en consecuencia: 1× binning para 1× aumento, 2× binning para 2,8× y 4× binning para 4×. Para esta configuración, esto corresponde a tamaños efectivos de píxeles de 108 nm para 1× (sin binning) o 4× (binning 4×), y 78 nm para binning de 2,8× (2× binning). Se requiere binning para obtener tamaños de píxeles adecuados para SMLM, aproximadamente iguales a la desviación estándar PSF (típicamente 100-150 nm)19,20.
    NOTA: Aumentos más altos (2,8× o 4×) aumentan la densidad de potencia del láser, mejorando la uniformidad de la iluminación. Esto reduce el campo de visión, por lo que el binning debe ajustarse proporcionalmente (es decir, binning 2× para 2,8× aumento; 4× binning para 4× aumento) para mantener el tamaño del píxel.
  6. Ajusta el tiempo de exposición para la adquisición de DNA-PAINT y sincronízalo con la velocidad de rotación del disco giratorio (ajustable desde la almohadilla CSU-W1). Asegúrate de que la velocidad de rotación sea un múltiplo del tiempo de exposición, o pulsa el botón Sync para igualar automáticamente las rpm compatibles más cercanas. Revisa la pantalla en busca de artefactos de rayas, ya que esto indica ajustes no sincronizados. Para los experimentos presentados aquí, se utilizó un tiempo de exposición de 300 ms.
    NOTA: La velocidad de rotación de los discos SoRa mejorados con microlentes de microlente SDC y de centrifugación afecta al perfil de excitación del haz, afectando a la distribución media de densidad de potencia en el área iluminada. Por esta razón, puede que se necesiten tiempos de exposición más largos que en configuraciones TIRF.
  7. Configura la longitud de onda, la potencia y la rueda de filtros del láser (los elementos NIS sugerirán un filtro adecuado). La longitud de onda del láser estará determinada por el espectro del colorante del imerador.
    NOTA: En este trabajo se utilizó Cy3B, que se excita óptimamente con un láser de 561 nm. Cy3B proporciona la mejor relación señal-fondo para DNA-PAINT, lo que lo convierte en la opción preferida para esta aplicación.
  8. Ajusta la potencia del láser mediante la almohadilla láser (0%-100%). Para la imagen de ADN-PAINT, ajusta el láser a potencia máxima (100%). Para este sistema, esto corresponde a 1,75 mW (≈ 65 W/cm2) medido después del objetivo para la ampliación de 4×, 3 mW (≈ 50 W/cm 2) para 2× y 5 mW (≈ 15 W/cm 2) para 1×.
    1. Para registrar la potencia tras el objetivo, utiliza un medidor de potencia láser calibrado y coloca el sensor en la etapa del microscopio lo más cerca posible de donde debe estar el plano de la muestra. Ten cuidado de evitar el contacto con la lente objetivo. Registra la potencia de cada configuración utilizada.
  9. Aplica una gota de aceite de inmersión al objetivo limpio de 60× Apo NA 1.49.
  10. Fija la muestra preparada (de los pasos 4.2-4.5) en el escenario usando un adaptador de escenario. Esto es importante para minimizar el desplazamiento durante la adquisición de imágenes y para evitar movimientos durante intercambios de búfer, especialmente en experimentos multicolor.
  11. Cambia al modo campo claro dentro del método de imagen seleccionado y céntrate en el plano de vidrio usando nanopartículas como referencia. Activa el Sistema de Enfoque Perfecto (PFS). El PFS o un sistema similar para mantener el enfoque durante todo el tiempo de adquisición es crucial porque la deriva en la dirección axial no puede corregirse mediante posprocesado.
    NOTA: El PFS de Nikon mantiene la muestra en enfoque nítido monitorizando y ajustando continuamente la distancia entre un plano de referencia fijo y el plano focal de la muestra utilizando una lente desplazada y un detector de CCD de línea. Al operar de forma independiente a la adquisición de imagen, el sistema corrige la deriva de enfoque en tiempo real (~milisegundos).
  12. Con PFS activo, selecciona el plano de imagen de interés. Para celdas U2OS mEGFP-Nup96 o heLa Kyoto mEGFP-Nup107, utiliza la señal 488 GFP de NPCs etiquetados con GFP para identificar la celda más plana y determinar el plano focal óptimo. Utiliza baja potencia láser (~10% de la potencia máxima del láser) durante este paso para evitar el fotoblanqueamiento.
  13. Define el nombre y la ruta de guardado del experimento. Marca la casilla Tiempo para establecer el intervalo, duración y número de bucles. Para la adquisición continua, se ajusta el intervalo a Sin retraso e introduce solo el número de bucles, que corresponde al número total de fotogramas.
    NOTA: Asegúrate de que la caja PFS en la parte inferior esté seleccionada y luego pulsa Ejecutar. El software proporcionará automáticamente una duración estimada del experimento y guardará los datos al finalizarlo. Para detener el experimento antes de que termine, pulsa Finalizar para guardar el progreso actual, o Abortar para terminar el experimento sin guardar.
  14. Para la primera proteína, adquiere entre 17.000 y 20.000 fotogramas con un tiempo de integración de 300 ms.
    NOTA: La concentración de la hebra del imerizador debe optimizarse en este paso para asegurar que las señales de una sola molécula no se solapen y, al mismo tiempo, se proporcionan localizaciones suficientes para la reconstrucción. Este proceso es similar a una adquisición típica de SMLM, donde la concentración del generador de imágenes se ajusta para lograr un número suficiente de eventos para la reconstrucción minimizando la superposición. La concentración óptima depende de la estructura que se esté a imaginar. Por ejemplo, estructuras altamente marcadas como los microtúbulos suelen requerir concentraciones más bajas en el generador de imágenes (menos de 1 nM).
  15. Retira suavemente el tampón de imagen para la siguiente proteína usando una pipeta, cuidando de no alterar la muestra. Mientras se monitoriza la muestra con la cámara del microscopio, añade cuidadosamente 200 μL de tampón C+ sin el sensor para lavar el primer tinte.
  16. Repite este paso hasta que no sea detectable ninguna señal de fluorescencia de la primera solución del generador de ADN (normalmente 5 lavados).
  17. Añade una segunda solución de imagen y comprueba que se detecten eventos de molécula única de nuevo.
  18. Adquiere entre 17.000 y 20.000 fotogramas con un tiempo de integración de 300 ms para la segunda proteína.
  19. Repite los pasos 5.14-5.18 para cada proteína adicional que se vaya a imaginar.
  20. Para la imagen 3D, adquiere pilas z con un espaciado de 0,5-1 μm a lo largo de toda la altura de la celda. Esto se hizo con un protocoloJOB específico 21 diseñado para el software de adquisición (elementos NIS) que graba un vídeo de un número predefinido de fotogramas en posiciones z específicas, manteniendo el PSF durante todo el tiempo de adquisición.
    NOTA: El paquete de software, junto con instrucciones detalladas para el usuario, se proporciona dentro del protocoloJOB 21. También se incluye una descripción completa del PUESTO. El software, llamado "MultiZ_DNAPaint.bin", puede descargarse desde la pestaña de Materiales de la publicación. Para ejecutar el JOB, descarga este archivo e impórtalo al Explorador de JOBS de NIS-Elements, siguiendo las instrucciones paso a paso proporcionadas.

6. Procesamiento y análisis de imágenes

NOTA: Las imágenes se procesaron primero mediante deconvolución usando un software compatible, seguido de un análisis de localización de molécula única usando el software Picasso desarrollado por el laboratorioJungmann 16.

  1. Abre las pilas de imágenes ND2 en el software NIS-Elements AR.
  2. Para imágenes 2D, selecciona Deconvolución 2D. Para imágenes 3D, repite este procedimiento para cada pila z individual.
  3. Elige deconvolución ciega, un orificio de oro efectivo de 0,01, y pon el nivel de ruido en Ruidoso. Luego, introduce la excitación láser y la tasa de emisión, aquí 560 nm y 571 nm, respectivamente. Otros parámetros se obtienen automáticamente a partir de los metadatos ND2 para proporcionar una estimación aproximada de la función de dispersión puntual (PSF) de la imagen fuente.
  4. Especifica el número de iteraciones (aquí, 12), selecciona Crear Nuevo Documento y pulsa Desconvolcar. Guarda el archivo resultante tras el procesamiento.
    NOTA: El algoritmo mejora iterativamente la calidad de imagen realizando operaciones de convolución que refinan la PSF hasta alcanzar la convergencia o el número especificado de iteraciones. Se recomienda la inspección visual de la imagen desconvolucionada. Se requiere ajustar el número de iteraciones dependiendo de las restricciones computacionales y la calidad de la imagen.
  5. Carga la pila de imágenes desconvolutas en el módulo Picasso Localize.
  6. Desde la barra de menú, selecciona Analizar → Parámetros e introduce los parámetros específicos de la cámara según las especificaciones del fabricante. Para la cámara sCMOS utilizada en este estudio (Hamamatsu ORCA-Fusion BT): ganancia electromagnética: 1, línea base: 100, sensibilidad: 0,23 (factor de conversión, electrones/conteos), eficiencia cuántica: 0,95 (dependiendo de la longitud de onda de excitación utilizada).
    NOTA: La eficiencia cuántica no se utiliza desde la versión 0.6.0 de Picasso y se mantiene solo para compatibilidad hacia atrás.
  7. Ajusta la longitud del lado de la caja a 7. La longitud de la caja se determina usando la fórmula [6× σ PSF + 1], donde σPSF es la desviación estándar de la PSF. Esta optimización mejora la precisión de localización, mejorando la resolución de la imagen reconstruida.
  8. Seleccione el tamaño de píxel adecuado para la configuración de imagen, según el paso de sección 5.5.
  9. A continuación, elige un Gradiente Neto Mínimo adecuado (por ejemplo, ~1000, dependiendo de la muestra) y activa la Vista previa para visualizar las localizaciones detectadas. Inspecciona los resultados y ajusta el umbral de gradiente según sea necesario para minimizar las detecciones de fondo y asegurar una localización precisa.
  10. En la barra de menú, selecciona Analizar → Localizar (Identificar y ajustar) para iniciar la identificación de puntos y el ajuste de todos los fotogramas de la película. Tras la competición, este proceso guarda automáticamente un archivo .hdf5 y .yaml.
    NOTA: El archivo .hdf5 almacena la posición de localización de cada ajuste gaussiano y más parámetros. .yaml guarda información sobre el vídeo y el procedimiento de análisis y puede ser inspeccionado usando un editor de texto.
  11. Carga el archivo .hdf5 en el módulo Picasso Render para visualizar el mapa de localización reconstruido y realizar la corrección de deriva.
  12. En Picasso Render, selecciona Postprocesado → Desenvaer por RCC. Introduce un valor de segmentación, empezando en 1000. Al completarse, aparecerá el gráfico de deriva calculado xy. Repite el proceso secuencialmente con valores de segmentación más bajos (por ejemplo, 500, luego 250), observando mejoras graduales en la deriva temporal.
    NOTA: La corrección por deriva también puede realizarse usando nanopartículas como marcadores fiduciales; sin embargo, al obtener imágenes de planos elevados, la señal de la nanopartícula puede no ser visible. En estos casos, solo se aplica la corrección de deriva por correlación cruzada redundante (RCC).
  13. Asegúrate de guardar el archivo corregido por deriva, seleccionando Archivo → Guardar localizaciones antes de cerrar la ventana de renderizado de Picasso.
  14. Carga el archivo corregido por deriva del paso 6.13 en el módulo Picasso Filter para pasos adicionales de postprocesado, imponiendo umbrales en las métricas de calidad de la localización de moléculas individuales, tales como: (i) Precisión de localización (lpx, lpy); (ii) anchos de las PSF (sx, sy); (iii) Conteo de fotones; y (iv) cualquier criterio adicional para eliminar ruido, valores atípicos o manchas mal resueltas.
    NOTA: lpx y lpy (precisión de localización en x e y) estiman la incertidumbre en la posición localizada a lo largo de los ejes x e y y se calculan en función de la cota inferior de Cramér-Rao (CRLB).
  15. Para filtrar una propiedad, selecciona la columna correspondiente en la cabecera de la tabla y elige Graficar → Histograma en el menú.
    NOTA: Seleccionar dos columnas representa un histograma 2D.
  16. Para filtrar por un rango de propiedades específico, haz clic y arrastra por la región deseada dentro de un histograma 1D o 2D. La región seleccionada aparecerá sombreada en verde, y cualquier evento de localización con valores fuera de este rango será excluido instantáneamente de la lista de localización.
  17. Filtrar los datos por fotones, sx, sy, lpx y lpy, conservando solo el rango central de la distribución de cada parámetro para asegurar la conservación de las localizaciones más fiables.
    NOTA: La parte central de la distribución de ancho PSF suele estar entre 0,4 y 1,2 × tamaño de píxel. Excluye las distribuciones secundarias que suelen ser causadas por señales superpuestas o manchas mal resueltas.
  18. Guarda los datos filtrados seleccionando Archivo → Guardar en el menú.
  19. Repite el proceso del paso 6.1 al 6.18 para todos los vídeos grabados en cada solución de imagen.
  20. Abre el archivo filtrado en el módulo Picasso Render. La intensidad en esta imagen superresuelta representa el número de localizaciones. El contraste puede cambiarse seleccionando Configuración de Vista → Pantalla y cambiando el valor de densidad máxima.
  21. Para guardar la imagen de superresolución de un solo canal, selecciona "Precisión de localización individual" en la sección Desenfoque. También se puede añadir una barra de escala desde la sección de barra de escala.
  22. Para guardar la imagen super-resolución de todos los canales, abre todos los archivos .hdf5 procesados. El color de cada canal puede cambiarse seleccionando Ver → Archivos en el menú.
  23. Alinea todos los canales seleccionando canales de post-procesamiento → Alinear.
  24. Selecciona Archivo → Exportar Imagen Completa para guardar una imagen o archivo .png → Exportar la Vista Actual para un zoom específico de la imagen.
    NOTA: Utiliza prácticas consistentes de nombres y documentación de archivos para la reproducibilidad. El software Picasso añade automáticamente un sufijo a cada archivo guardado. Las métricas Cramer Rao Lower Bound y el análisis basado en vecinos más cercanos (NeNA)22 pueden extraerse seleccionando Ver → Mostrar información desde el menú. El NeNA cuantifica la distribución espacial de fluoróforos localizados evaluando la distancia euclidiana entre localizaciones vecinas. Mientras que el CRLB proporciona un límite inferior teórico para la precisión de localización basado en estadísticas de fotones y ruido de fondo, el NeNA ofrece una estimación experimental de la precisión de localización derivada directamente del propio conjunto de datos. Por esta razón, NeNA se utiliza ampliamente en SMLM como medida complementaria a la CRLB, ya que captura no solo límites teóricos sino también influencias prácticas como la corrección de deriva, errores de ajuste y variabilidad experimental. La métrica NeNA se extrae del módulo Picasso Render. El CRLB del ajuste de una sola molécula se utiliza para determinar los valores de precisión de localización informados (σSMLM). El valor reportado es la media entre σx y σy, para todas las localizaciones, que son el valor de modo de la distribución de la precisión de localización en x e y, respectivamente.

Resultados

Para demostrar las capacidades de imagen de superresolución del sistema SDC-OPR (Figura 1A), se evaluó su resolución en plano realizando experimentos de imagen DNA-PAINT (Figura 1B) en complejos de poros nucleares (NPCs), que son una estructura de referenciabiológica 17. La Figura 1C muestra una imagen representativa de DNA-PAINT SDC-OPR de la nucleoporina 96 (Nup96), marcada con proteína fluorescente verde mejorada por monoméricos (mEGFPs) y marcada con nanocuerpos anti-GFP conjugados con ADN, en células U2OS. Los paneles ampliados muestran la subestructura NUP, y la Figura 1D muestra proteínas Nup96 emparejadas (indicadas por flechas) consistentes con la simetría esperada de 8 veces de los poros nucleares. En la Figura 1E, la distancia euclidiana entre pares Nup96 se midió alineándolos y graficando el histograma de la sección transversal de la imagen sumada (n = 16 pares). El análisis reveló una separación pico a pico de (13 ± 2) nm (Figura 1E), en concordancia con los resultados de los modelos electromagnéticos así como de las imágenes HILO yTIR 23. Cada ajuste de pico mostraba una desviación estándar de 4 nm, confirmando la alta precisión de localización (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) lograda usando DNA-PAINT en SDC-OPR. Cabe destacar que esta precisión se mantuvo a lo largo de todo el campo de visión de 53 × 53 μm², lo cual es excepcional para sistemas basados en confocales.

Para demostrar la capacidad de la imagen multicolor, Nup96, las mitocondrias y los microtúbulos en células U2OS fueron marcados con ADN para su adquisición usandoExchange-PAINT 18. Esta técnica emplea cadenas ortogonales de ADN conjugadas a un solo fluoróforo, permitiendo excitar todos los objetivos con la misma fuente láser (Figura 2A). En lugar de adquirir señales simultáneamente, las separa a través de rondas secuenciales de imagen, facilitando una integración sencilla en cualquier sistema comercial SDC-OPR. La Figura 2B muestra Nup96 en azul marcado con un nanocuerpo anti-GFP, mitocondrias en rojo con un anticuerpo anti-TOM20 secundario y microtúbulos en verde con un anticuerpo primario anti-α-tubulina. Cabe destacar que la sobresaliente precisión de localización de molécula única obtenida para la imagen Nup96 en un solo color se mantuvo en todos los objetivos del experimento multiblanco, dando valores de precisión de localización de 3,9 nm para el NPC, 4,0 nm para α-tubulina y 3,3 nm para mitocondrias (Figura 2B paneles 1, 2 y 3).

Para la imagen de gran FOV, los microtúbulos en las células HeLa se imaginaron utilizando diversas aumentaciones disponibles en el sistema SDC-OPR, combinadas con diferentes ajustes de binning de la cámara para mantener tamaños de píxeles entre 78 nm y 108 nm (Figura 3). La Figura 3A muestra el citoesqueleto microtubular de 10 células HeLa, con colores que representan la precisión de localización. Con una magnificación del 1×, la precisión media de localización es notablemente inferior en comparación con aumentos mayores (Figura 3B-D), observándose una mayor variabilidad. Esto se debe a la menor densidad de potencia láser sobre el FOV mayor, donde el perfil de iluminación gaussiano se hace evidente, lo que lleva a una menor precisión hacia los bordes del FOV. No obstante, lograr una precisión de localización media de 9,5 nm en el amplio FOV de 211 × 211 μm² es impresionante para sistemas basados en confocales y permite una investigación de alta resolución de la heterogeneidad biológica.

Finalmente, se demuestra la posibilidad de obtener imágenes de células enteras mediante la adquisición de imágenes DNA-PAINT de la red de microtúbulos en células HeLa fijas con un volumen confocal de ~500 nm de espesor y un z-step de 1 μm utilizando la mayor ampliación del sistema (FOV 4×, 53 × 53 μm²). La Figura 4A presenta las imágenes de reconstrucción de molécula única para cada plano z, junto con la precisión de localización correspondiente y los valores de NeNA. Además, se ofrece una visualización en color 3D de la red de microtúbulos en la célula HeLa en la Figura 4C. A medida que aumenta la profundidad, el número de fotones detectados disminuye debido a la dispersión y las aberraciones ópticas, lo que resulta en una menor precisión de localización tanto para las precisiones de localización derivadas del Cramér-Rao Lower Bound (CRLB) (Figura 4A, derecha) como para las calculadas usando la métrica NeNA. Aun así, el alto nivel de recogida de fotones posible por el sistema SDC-OPR permite σSMLM ≤ 10 nm para una profundidad de imagen de hasta 9 μm con distribuciones estrechas. De hecho, las estructuras filamentosas de microtúbulos de doble pared se resolvieron claramente a diversas profundidades: cerca de la interfaz coverslip-celda, en posiciones axiales intermedias y en la parte superior de la celda, con distancia pico a pico entre 30 nm y 40 nm (Figura 4C), consistente con los valoresreportados 24. Estos resultados ponen de manifiesto la capacidad del SDC-OPR para ofrecer imágenes de alta resolución a través de grandes FOV y a lo largo de toda la altura de las células.

Figura 1
Figura 1: Microscopía de localización de molécula única en plano de diferentes muestras celulares e imagen multicolor de superresolución. (A) Esquema del sistema confocal de disco giratorio con reasignación óptica de fotones (SDC-OPR), con una matriz de microlentes diseñada para maximizar la recogida de fotones. (B) Esquema de ADN-PAINT: Las cadenas de ADN marcadas con fluorescencia, conocidas como hebras de imagen, se hibridan transitoriamente con secuencias complementarias de ADN (cadenas de acoplamiento) que están ancladas al anticuerpo/nanocuerpo que apunta a la proteína de interés. Estos eventos de unión de corta duración generan señales de fluorescencia que aparecen como parpadeos estocásticos. (C) Imagen representativa de DNA-PAINT en el sistema SDC-OPR usando aumento de 4× del NPC de las celdas U2OS. La capacidad de alta resolución se demuestra en el reco, donde los NPC individuales están claramente resueltos. (D) ADN-PAINT mejorado por SDC-OPR permite la visualización de NPCs individuales, donde flechas blancas resaltan pares característicos de proteínas Nup96 dentro de la arquitectura del poro. (E) Distribución de mediciones de distancia entre dímeros Nup96 (n=16 pares) dentro de unidades de simetría NPC individuales. Esta cifra ha sido modificada respecto a Zaza et al.14. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura. 

Figura 2
Figura 2: Exchange-PAINT para imágenes multicolor usando un microscopio SDC-OPR. (A) Esquema de Exchange-PAINT de tres objetivos fotografiados secuencialmente. Tres dianas proteicas fueron marcadas con anticuerpos funcionalizados por ADN, fragmentos de Fab o nanocuerpos. Las hebras del imerador Cy3B se imaginaron secuencialmente por tipo de hebra, con pasos de lavado entre rondas de imagen. (B) Imagen Exchange-PAINT en tres colores de células U2OS usando microscopía SDC-OPR con aumento de 4×, mostrando microtúbulos (rojo; etiquetados con anti-α-tubulina conjugada con ADN), mitocondrias (verde; nanocuerpos de ADN dirigidos a TOM20), y NPC (azul; Nup96 marcado con mEGFP y nanocuerpos de ADN anti-GFP). Barra de escala: 5 μm. La región ampliada enfatiza la resolución mejorada obtenida en el sistema SDC-OPR, centrándose en (1) mitocondrias, (2) microtúbulos y (3) NUP. Barras de escala = 1 μm. Esta cifra ha sido modificada respecto a Zaza et al.14. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3
Figura 3: Imagen de ADN-PAINT dentro de grandes FOV en un microscopio SDC-OPR. Imágenes de ADN-PAINT de microtúbulos (marcaje anti-α-tubulina) adquiridas a múltiples aumentos: (A) aumento de 1× y 1 binning (FOV de 211 × 211 μm²), (B) 2,8× y 2 binning (FOV de 76 × 76 μm²), (C) aumento de 4× y 4 binning (FOV de 53 × 53 μm²). El color representa la precisión de localización de 0 a 16 nm en el caso de una ampliación 1x y de 0 a 4 nm en los demás. (D) Precisión de localización medida a diferentes distancias (en μm) desde el centro del campo de visión para aumentos de 1× (rojo), 2,8× (amarillo) y 4× (verde). Esta cifra ha sido modificada respecto a Zaza et al.14. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Imagen de ADN de célula entera - PAINT. (A) Izquierda. Imagen volumétrica de microtúbulos en células HeLa mediante DNA-PAINT adquirida mediante SDC-OPR a 4× aumento, mostrando secciones axiales de z = 0 a 9 μm (escalones de 1 μm). Cada plano muestra la posición z , la precisión de localización y la métrica NeNA. Barras de escala: 5 μm (xy). Vale. Precisión de localización frente a profundidad de penetración para todos los planos. (B) Renderizado 3D de la red de microtúbulos en la misma celda HeLa que en (A). El color representa la profundidad de penetración de 0 a 9 μm. (C) Imágenes ampliadas de pequeñas regiones resaltadas de cada profundidad de penetración indicadas en (A). Esta cifra ha sido modificada respecto a Zaza et al.14. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

La microscopía de fluorescencia de superresolución ha roto la barrera de difracción, mejorando drásticamente la resolución espacial. Sin embargo, su adopción generalizada en la investigación biológica se enfrenta a desafíos continuos. Cabe destacar que los compromisos entre campo de visión, resolución y profundidad de penetración dificultan optimizar los tres factores simultáneamente. Estos desafíos se abordaron utilizando las capacidades combinadas de SMLM y microscopía confocal de disco giratorio mejoradas por la reasignación óptica de fotones (SDC-OPR). Al integrar matrices de microlentes en una configuración estándar de SDC, como permitió el sistema comercial SDC-OPR, la recogida de fotones aumentó mientras que el tamaño efectivo del orificio se redujo, lo que llevó a una mejora significativa de la resolución. En comparación con la SDC estándar, el sistema SDC-OPR demostró una mejora notable en la potencia de resolución, distinguiendo con éxito características separadas por 10nm 14 en el plano focal, mientras que la SDC estándar solo podía resolver distancias superiores a 20nm 11. Esta mayor capacidad de resolución subraya el beneficio de la reasignación de fotones para lograr separaciones a escala molecular. Específicamente, se logró una precisión de localización lateral inferior a 2 nm en el plano focal (z = 0 μm), manteniendo la precisión lateral por debajo de 10 nm a profundidades de hasta 9 μm, combinada con un campo de visión altamente adaptable de 53 × 53 μm² o 76 × 76 μm². Incluso con un gran FOV de 211 × 211 μm², el sistema ofrecía una impresionante precisión media de localización en plano de 9,5 nm. Estos resultados destacan la capacidad del sistema para obtener imágenes de alta resolución en células completas.

En cuanto a las reacciones de acoplamiento para los diferentes anticuerpos utilizados, el protocolo debe seguirse cuidadosamente para asegurar una proporción óptima de anticuerpos respecto al ADN. Superar esta proporción puede reducir la precisión de localización y afectar negativamente a las mediciones cuantitativas, como las realizadas enqPAINT 25. Por ello, es fundamental verificar la proporción utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen, asegurando una relación final de 1:1 entre ADN y anticuerpos.

Un paso crítico para obtener imágenes de alta calidad y superresolución de los microtúbulos es la fijación adecuada. Los métodos convencionales de fijación que dependen únicamente de altas concentraciones de PFA suelen alterar las estructuras de los microtúbulos. En cambio, usar glutaraldehído (AG) solo o en combinación con PFA mejora significativamente la preservación estructural26,27.

Para una obtención óptima de imágenes, un objetivo de alta apertura numérica (NA) es esencial para maximizar la colección de fotones por evento de molécula única. En el sistema comercial SDC-OPR, la potencia láser es intencionadamente menor que en los microscopios TIRF convencionales usados para SMLM para minimizar el fotoblanqueo de muestras. Aunque DNA-PAINT elimina los problemas de blanqueamiento fotográfico y teóricamente podría emplear una mayor potencia láser, los sistemas comerciales actuales imponen limitaciones, lo que requiere tiempos de exposición más largos en comparación con la iluminación TIRF. Además, dado que la iluminación en SDC-OPR es confocal, las moléculas no se excitan continuamente durante la exposición. Como resultado, son necesarios tiempos de exposición más largos en relación con la iluminación continua del TIRF; En este estudio se utilizó un tiempo de exposición de 300 ms. Sin embargo, dependiendo de los requisitos de resolución de un experimento dado, se pueden emplear tiempos de integración más cortos (por ejemplo, 150-200 ms) con una pérdida mínima deresolución 28.

Optimizar la concentración de la hebra del generador de imágenes es un paso fundamental para asegurar que las señales de molécula única permanezcan bien separadas, generando al mismo tiempo suficientes localizaciones para una reconstrucción precisa. Este ajuste es análogo a las adquisiciones estándar de SMLM, donde el equilibrio entre densidad de eventos y solapamiento de señales se controla cuidadosamente. La concentración óptima del generador de imágenes debe ajustarse para cada objetivo diferente. Por ejemplo, para microtúbulos, se recomienda una concentración inicial de hebra de imagen inferior a 1 nM, con ajustes realizados según sea necesario.

Mantener un enfoque estable durante adquisiciones prolongadas es fundamental, ya que la deriva axial (z) no puede corregirse después del procesado. La deriva lateral (xy) puede compensarse mediante RCC o marcadores fiduciales. En este montaje, el Sistema de Enfoque Perfecto (PFS) del microscopio garantiza la estabilidad del enfoque durante horas de imagen.

En resumen, la integración de SMLM con SDC-OPR proporciona una plataforma potente para imágenes de alta resolución en profundidad dentro de células completas, superando los compromisos tradicionales entre resolución, profundidad y campo de visión. Sin embargo, para realizar plenamente las capacidades del sistema, es esencial una atención meticulosa a las condiciones experimentales, desde la conjugación y fijación de anticuerpos hasta los ajustes de adquisición y el procesamiento de datos. Cada paso, desde la preparación de la muestra hasta la corrección de deriva, desempeña un papel fundamental para lograr datos fiables y de alta precisión. Con una optimización cuidadosa del protocolo, este enfoque ofrece una solución robusta y versátil para la imagen cuantitativa a nanoescala en muestras biológicas complejas. Se espera que este protocolo ayude a la comunidad a adoptar la microscopía de localización de molécula única y a obtener imágenes superresueltas de planos de muestra difíciles de acceder mediante iluminación convencional TIRF o HILO. Ambos objetivos se facilitan utilizando microscopios comercialmente disponibles que se encuentran típicamente en instalaciones de microscopía en todo el mundo.

En términos de otras aplicaciones y futuras, el método es aplicable tanto a muestras de células completas como a muestras de tejido más complejas a mayores profundidades de imagen, como se demostró en estudiosprevios 14. A diferencia de los enfoques que requieren la sección física, esta técnica permite la imagen volumétrica de tejidos intactos, preservando la arquitectura nativa y minimizando los artefactos introducidos por la sección física. El uso de sondas de afinidad más pequeñas, como los nanocuerpos, mejora aún más la penetración tisular en comparación con los anticuerpos de longitud completa, permitiendo un marcaje más uniforme en muestras gruesas. Este enfoque abre la puerta al estudio de la organización celular y las distribuciones moleculares in situ con mayor fidelidad. Más allá de estas aplicaciones, la estrategia también se presta a un cribado de alto rendimiento de nanoestructuras y ensamblajes biomoleculares, permitiendo investigaciones sistemáticas de la heterogeneidad y función estructural. Además, desarrollos recientes en DNA-PAINT han dado lugar a sondas de imagen auto-apagas, ya sea basadas en interacciones de atenuante o de colorante 29,30,31, que reducen eficazmente las señales de fondo, aumentan la intensidad de fluorescencia y mejoran la resolución espacial, permitiendo tasas de adquisición más rápidas. Integrar estas sondas fluorogénicas en el marco SDC-OPR tiene el potencial de aumentar aún más tanto la velocidad como la resolución de imagen. Combinar estos avances con las fortalezas del sistema SDC-OPR podría ampliar su aplicabilidad a especímenes biológicos más complejos, estableciendo la plataforma como una herramienta flexible para el mapeo detallado de estructuras celulares y moleculares en una amplia variedad de tejidos.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que declarar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por la Human Frontier Science Program Organization (HFSP) a través de una beca postdoctoral interdisciplinar para CZ (LT0025/2023-C) y el Consejo de Investigación en Ciencias Físicas y de Ingeniería para apoyar a M.T. (EP/R513143/1 y EP/W524335/1) y O.P.L.D. (EP/R513143/1 y EP/T517793/1). S.S también reconoce a The Royal Society mediante una beca Dorothy Hodgkin (DHF\R1\191019 y DHF\R\251006). Este trabajo también ha sido apoyado por subvenciones de The Chan Zuckerberg Initiative (2023-321188) y BBSCR (BB/Y513064/1) a S.S.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
(±)-6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromato-2-ácido carboxílicoMerck 238813-5GTrolox
3,4-ácido dihidroxibenzoico  Merck 37580-25G-FPCA
60 y veces; Objetivo Apo NA 1.49Nikon
7.0 KDA columna de desalación de espín que contiene resina de exclusión de tamaño  Fisher Scientific Ltd89882Columnas de desalación Zeba Spin para el paso 2.4
Accutasa - Medio de desprendimiento de células enzimáticasCélula de PromociónC-41310
Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP acoplado a ADN personalizado (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')Fotónica masivaProducto personalizadoNanocuerpo anti-GFP para Drosophila
Alpaca sdAb (1H1) anti-GFP acoplado con ADNFotónica masivaMASSIVE-TAG-Q-FAST anti-GFP - F3Nanocuerpo anti-GFP para NUP
Anti-alfa tubulina (YL1/2)Thermo Fisher ScientificMA1-80017
IgG anti-conejoFotónica masivaMassive-sdAB-FAST 2-Plex, Secundario sdAB F2
Anti-TCR y Zeta; (6B10.2)BioLegend644102
Albúmina sérica bovinaMerck A4503-10GBSA
Tubo centrífugo cónico 15 mLFisher Scientific Ltd17705004
Tubo centrífugo cónico 50 mLVWR Internacional734-0448
CSU-W1 SoRaNikonMicroscopio SDC-OPR
Desalar columnas de espín con Sephadex G-25 (resina de exclusión de tamaño para purificación del ADN) y nbsp;Fisher Scientific Ltd11743309Marca: Cytiva. Columnas G-25 para el paso 2.5
D-glucosaMerck G8270-1KG
Medios DMEMThermo Fisher Scientific11965092
DMSO, anhidroThermo Fisher ScientificD12345
DTT  (Ditiotreitol)Thermo Fisher Scientific15976082
EDTAThermo Fisher Scientific15575020
EGTAMarck324626
Suero fetal bovinoThermo Fisher ScientificA5256701
GlutaraldehídoServa2311402
GlicerolMerck G5516-500ML 
GlicinaMP Biomedicina219482580
Maleimida-PEG2-succinimidyl Merck 746223-50MG
Medios 5A de McCoyFisher Scientific Ltd16600082
MES (ácido 2-(N-morfolino)etanolsulfónico)MerckM3671-50G
MetanolFisher Scientific Ltd32213-25L
MgCl2Fisher Scientific Ltd10418464
Tubos microcentrífugas 0,5 mLFisher Scientific Ltd11508232
Tubos microcentrífugas 1,5 mLEppendorf10509691 
Espectrofotómetro UV-Vis de MicrovolumenThermo Fisher ScientificND-ONE-WNanodrop
NaCl2Sigma-AldrichS6546-1L 
Nanopartículas 90 nm -OroCitodiagnósticoG-90-100
Cámara CMOS Orca Fusion-BTHamamatsu
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher Scientific15070063P/S
Solución salina tamponada con fosfato (solución 1x)Fisher Scientific Ltd11530546PBS
Pierce 16% formaldehído (w/v), libre de metanolFisher Scientific Ltd11586711PFA
Cloruro de potasio  Merck   P9541-500G
Protocatechuto 3,4-Dioxigenasa  Merck P8279-25UN PCD
Sodio  HidróxidoFisher Scientific Ltd12963614
Anticuerpo TOM20AbcamAb186735
Tampón de trisVWR InternacionalA4577.1000
Tritón y la palabra Triton; X-100   VWR Internacional1086031000
Preadolescente-20Merck P9416-50ML
Unidad de filtración centrífuga de ultrafiltración, MWCO de 100 kDaMerck UFC510024Fabricante: Amicon Ultra
μ-Slide 8 pozos de alto fondo de cristalIbidiIB-80807
μ-Slide VI 0.5 Fondo de cristalIbidiIB-80607

Referencias

  1. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  2. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  3. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  4. Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms. Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).
  5. Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
  6. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  7. Wäldchen, F., et al. Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM. Nat Commun. 11 (1), 887(2020).
  8. Zagato, E., et al. Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM). Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).
  9. Galland, R., et al. 3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
  10. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. 236, Springer Science & Business Media. (2006).
  11. Schueder, F., et al. Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).
  12. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  13. York, A. G., et al. Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing. Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).
  14. Zaza, C., et al. Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment. Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).
  15. Jungmann, R., et al. Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).
  16. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  17. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy. Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  18. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  19. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  20. Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. Localization accuracy in single-molecule microscopy. Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).
  21. Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes. , (2025).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).
  23. Schlichthaerle, T., et al. Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT. Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).
  24. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).
  25. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  26. Whelan, D. R., Bell, T. D. M. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).
  27. Xie, Z., et al. Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy. Cytoskeleton. , (2025).
  28. Steen, P. R., et al. The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes. Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).
  29. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy. J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).
  30. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy. Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).
  31. Chung, K. K. H., et al. Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Im genes por DNA PAINTlocalizaci n de mol culas individualesim genes de c lula completaim genes multicoloresmarcaje intracelularim genes celulares profundasreconstrucci n de im genes
Imagen de superresolución de célula completa mediante DNA-PAINT en un disco confocal giratorio con reasignación óptica de fotones
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.