Este protocolo tenía como objetivo establecer y optimizar un método LC-MS/MS para la cuantificación relativa de la acumulación de vincristina en células primarias de ALL pediátrica.
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Artículo de método
Desarrollo y estandarización de un micrométodo ex vivo para la cuantificación intracelular de la vincristina en células primarias de ALL por LC-MS/MS
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Resumen
Resumen
Cuantificar la vincristina intracelular (VCR) en células primarias de leucemia linfoblástica aguda pediátrica (LLA) es esencial para comprender las diferencias específicas de la muestra en la absorción de fármacos y para apoyar estudios experimentales utilizando material escaso de pacientes. Aquí presentamos un micrométodo LC-MS/MS optimizado específicamente para células primarias de ALL obtenidas mediante xenoinjertos derivados del paciente (PDX), abordando desafíos clave como la disponibilidad limitada de células, el tamaño reducido de las células y la necesidad de recuperación reproducible tras múltiples pasos de lavado. Los ensayos temporales que oscilan entre 1 y 5 horas demostraron que un periodo de incubación de 3 horas produce los niveles más altos y consistentes de VCR intracelulares, con menor variabilidad entre réplicas. La optimización del método también estableció que usar 2,5 × 106 celdas por condición mejora la robustez analítica en comparación con 1 × 106 celdas, que mostraron mayor dispersión en experimentos repetidos. Otras mejoras críticas incluyeron el uso de metanol frío para mejorar la eficiencia de la precipitación de proteínas y la incorporación de un estándar interno para monitorizar y minimizar la variación procedimental. El método permite una cuantificación sensible y precisa del VCR intracelular a través de rangos de concentraciones relevantes, aunque la dosis más baja probada (0,01 μM) no fue cuantificable tras la incubación de 3 horas. En conjunto, este micrométodo proporciona un enfoque práctico, reproducible y escalable para medir VCR intracelulares en muestras primarias de ALL. Su diseño apoya análisis comparativos, validación de modelos ex vivo y futuras aplicaciones metodológicas destinadas a integrar la cuantificación intracelular de fármacos en evaluaciones farmacológicas más amplias.
Introducción
La leucemia linfoblástica aguda (LLA) representa aproximadamente el 25% de todos los cánceres infantiles y sigue siendo la malignidad pediátricamás común 1,2. Aunque los avances en la terapia han mejorado notablemente las tasas de supervivencia, superando ahora el 90%, la complejidad biológica de la LLA sigue impulsando los esfuerzos para desarrollar herramientas que caractericen mejor la enfermedad a nivelcelular 3.
Los alcaloides de Vinca, especialmente los VCR, son componentes clave de TODOS los protocolos detratamiento 4. Dado que el VCR ejerce sus efectos citotóxicos intracelulares, comprender su absorción y acumulación en células leucémicas es fundamental para estudios que involucran la respuesta a fármacos, la farmacodinámica y el comportamiento celular en sistemas ex vivo. Sin embargo, la mayoría de los enfoques disponibles para evaluar los niveles intracelulares de fármacos se basan en mediciones indirectas o métodos semicuantitativos, limitando la reproducibilidad y la sensibilidad 5,6,7.
Paralelamente, muchas investigaciones siguen dependiendo en gran medida de las líneas celulares de leucemia, que carecen de la heterogeneidad biológica y la relevancia clínica de las células primarias derivadas del paciente. Las muestras primarias suelen presentar desafíos como un número limitado de células, calidad variable de la muestra y la necesidad de técnicas analíticas altamente sensibles capaces de detectar compuestos intracelulares de bajaabundancia 8.
La cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) proporciona la especificidad y sensibilidad necesarias para la cuantificación precisa de agentes quimioterapéuticos, aunque los protocolos estandarizados para medir VCR intracelular directamente en células leucémicas primarias siguen siendo escasos. Establecer micrométodos robustos compatibles con material limitado del paciente puede facilitar una amplia gama de aplicaciones, incluyendo el perfilado farmacológico, la evaluación de interacciones fármaco-célula y estudios comparativos entre subtipos de enfermedades o condiciones terapéuticas.
Aquí, en este protocolo, describimos el desarrollo y la optimización de un micrométodo para la cuantificación ex vivo de VCR intracelulares en células leucémicas primarias utilizando LC-MS/MS. Para obtener material suficiente para el desarrollo del método, se trasplantaron muestras de pacientes en ratones inmunodeficientes NSG para generar los modelosPDX 9. Tras la expansión in vivo , se aislaron y criopreservaron 10 células leucémicashumanas. Después, se descongelaron, incubaron con VCR, se lavaron, se lisaron y se analizaron con LC-MS/MS para determinar los niveles intracelulares de fármacos.
Este método ofrece varias ventajas: requiere un pequeño número de células (2,5 millones), es sensible y rápido, y es compatible con muestras primarias clínicamente relevantes. Debido a que mide directamente el contenido intracelular de fármacos, proporciona una herramienta cuantitativa fiable para investigadores que investigan la absorción de fármacos, las respuestas celulares a quimioterapias u otras cuestiones farmacológicas en malignidades hematológicas.
En conjunto, este protocolo amplía el conjunto de herramientas analíticas disponible para estudiar la LLA pediátrica y puede adaptarse fácilmente a otros fármacos o tipos de muestras, apoyando futuras investigaciones sobre la biología de la leucemia, el comportamiento de los fármacos y la farmacología de precisión.
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Protocolo
Las muestras de leucemia utilizadas en este estudio se obtuvieron de viales bio-bancarios de pacientes tratados en el Centro Infantil Boldrini, quienes permitieron el uso de sus células mediante un formulario de consentimiento informado. El proyecto fue aprobado por el Comité de Ética Institucional (CAAE 34601120.7.0000.5376). Los protocolos para la generación de PDX en animales se llevaron a cabo conforme a las normativas y directrices éticas de la Comisión de Ética no Uso de Animais del Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0011-2020).
1. Preparación de la muestra e incubación del fármaco (Día 1)
- Preparación del material y soluciones de trabajo
- Pesa 2,5 mg de sulfato de vincristina (peso molecular: 923 g/mol) y disuelve en 2,0 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) en un microtubo de 2,0 mL para preparar una solución de 1,354 mM. Vórtice hasta que se disuelva completamente.
PRECAUCIÓN: El DMSO es un irritante; Lleva guantes y maneja la cámara con una campana extractora química. - Prepara la solución de trabajo de 100 μM mezclando 147,71 μL de la solución de VCR con 1.852,28 μL de DMSO en un microtubo de 2,0 mL. Vórtice a fondo.
- Distribuye 500 μL de la solución de trabajo en cuatro microtubos de 0,6 mL y guarda a -20 °C durante varios meses. Evita descongelar las alicuotas más de tres veces.
- Preparar una solución de trabajo de vinblastina (VINB) de 100 μM mezclando 181,81 μL de una solución stock de 1,1 mM (sulfato de vinblastina 1 mg/mL, peso molecular: 909,07 g/mol) con 1.818,19 μL de agua ultrapura estéril en un microtubo de 2,0 mL. Vórtice hasta que sea homogéneo.
- Aliquot la solución VINB funcionando igual que para el vídeo.
- Preparar la solución de metanol + 0,1 μM de VINB mezclando 49,95 mL de metanol con 50 μL de la solución de trabajo VINB en un tubo de 50 mL. Vórtice hasta que sea homogéneo. Guárdalo a -20 °C hasta 3 meses.
PRECAUCIÓN: El metanol es tóxico e inflamable; manejar con el EPI adecuado en una campana extractora. - Preparar una solución de agua + 0,1% de ácido fórmico mezclando 49,95 mL de agua ultrapura con 50 μL de ácido fórmico en un tubo de 50 mL. Vortex well. Guarda a temperatura ambiente (RT).
PRECAUCIÓN: El ácido fórmico es corrosivo; Manija con guantes y protección ocular.
- Pesa 2,5 mg de sulfato de vincristina (peso molecular: 923 g/mol) y disuelve en 2,0 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) en un microtubo de 2,0 mL para preparar una solución de 1,354 mM. Vórtice hasta que se disuelva completamente.
- Descongelación y lavado de células primarias
- Descongelan las muestras de células crioppreservadas girando suavemente el frasco en un vaso de precipitados que contiene 15 mL de agua destilada a 37 °C hasta que se descongele completamente.
NOTA: La información sobre los protocolos de recogida y congelación de células puede encontrarse en publicaciones anteriores 9,10. - Transfiere el contenido del vial a un tubo cónico de 50 mL que contiene entre 10 y 15 mL de PBS estéril 1x con una pipeta Pasteur desechable y estéril. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos en RT.
- Descarta el sobrenadante invirtiendo el tubo.
- Resuspende el pellet en 10 mL de medio AIM V con una piquita Pasteur desechable. Cuenta las células viables y mide el tamaño medio de las células usando un contador automático.
NOTA: Se recomienda utilizar células que muestren al menos un 80% de viabilidad respecto al número total de células recogidas. - Calcula el volumen necesario para recoger 2,5 × 106 celdas viables usando una proporción simple basada en la concentración medida. Por ejemplo, si la concentración es 5 × 106 celdas/mL, el volumen requerido es 0,5 mL.
NOTA: Realizar cada tratamiento en triplicado para garantizar la reproducibilidad de los datos. Guardar el tamaño medio de las celdas proporcionadas en el contador automático de celdas; Úsalo para calcular el volumen de las celdas.
- Descongelan las muestras de células crioppreservadas girando suavemente el frasco en un vaso de precipitados que contiene 15 mL de agua destilada a 37 °C hasta que se descongele completamente.
- Configuración de tratamiento de drogas
- Calcular el volumen de solución de trabajo del VCR necesario para alcanzar una concentración final de 1 μM en un volumen total de 2,0 mL. Haz un vórtice en la solución original antes de pipetear.
- Añade medio AIM V, luego 2,5 × 106 celdas, y finalmente la solución VCR a un microtubo de 2,0 mL. Haz un vórtice breve y gira ligeramente hacia abajo (5 s) para recoger cualquier líquido del tapón del tubo.
- Incubar los tubos abiertos a 37 °C, 5% de CO2 durante 3 horas.
- Tras la incubación, cierra las tapas y centrifuga las muestras a 300 × g durante 5 minutos en RT.
- Desecha cuidadosamente el sobrenadante usando una pipeta, luego añade 1 mL de PBS a RT al tubo.
- Repite la centrifugación a 300 × g durante 5 minutos en RT, retirando el sobrenadante y lavando PBS dos veces más, para un total de tres lavados.
- Retirar cuidadosamente todo el sobrenadante usando una pipeta, volver a suspender el pellet en 100 μL de PBS y hacer un vórtice hasta que el pellet esté completamente resuspendido.
- Añadir 400 μL de metanol frío + 0,1 μM de vinblastina (-20 °C) directamente a la muestra, evitando el contacto con las paredes del tubo.
- Guarda las muestras durante la noche a -80 °C.
NOTA: Las muestras pueden almacenarse a -80 °C durante unas semanas (paro seguro).
2. Procesamiento de muestras para LC-MS/MS (Día 2)
- Extracción de muestras
- Preenfría la centrífuga a 4 °C antes de sacar las muestras del congelador a -80 °C.
- Inmediatamente después de sacar las muestras del congelador, centrifugarlas a 13.000 × g durante 20 minutos a 4 °C.
- Transfiere 300 μL de sobrenadante a un microtubo de 1,5 mL.
- Seque completamente las muestras usando un concentrador de vacío a 40-45 °C durante 1 hora y 40 minutos.
NOTA: Los pellets secos pueden almacenarse a -20 °C durante unas semanas (para evitar con seguridad). - Resuspende cada pellet en 400 μL de agua + 0,1% de ácido fórmico (previamente preparado). Agita el vórtice suavemente hasta que el pellet esté completamente disuelto.
- Centrifugar las muestras de nuevo a 13.000 × g durante 20 minutos a 4 °C.
- Transfiere 300 μL de sobrenadante a un vial de 2,0 mL con tapa de rosca para el análisis LC-MS/MS.
3. Configuración de LC-MS/MS y adquisición de datos
- Preparación de fase móvil y acondicionamiento de columna
- Prepara el disolvente A mezclando agua ultrapura con ácido fórmico al 0,1%.
- Prepara el disolvente B mezclando acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1%.
PRECAUCIÓN: El acetonitrilo es tóxico e inflamable; Maniera en una campana extractora química. - Sonica cada disolvente en un baño ultrasónico durante 5 minutos. Conecta las botellas al módulo de la bomba y purga el sistema a alto caudal para eliminar contaminantes.
- Instala una columna BEH C18 de fase inversa (1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm).
NOTA: Para realizar el análisis, este estudio utilizó un sistema cromatográfico Acquity H-Class acoplado a un espectrómetro de masa triple cuadrupolar Xevo TQS-Micro. - Utiliza un gradiente binario compuesto por los disolventes A y B, ambos previamente preparados.
- Ejecutar el gradiente cromatográfico del 5% al 95% del disolvente B durante los primeros 2 minutos, seguido de 2 minutos de disolvente A para el lavado de columnas y el reequilibrio.
- Ajusta el caudal a 0,2 mL/min durante los 4 minutos de la carrera. Mantener la temperatura de la columna en 40 °C e inyectar 10 μL de cada muestra.
- Configuración del método LC-MS/MS
- Abre el software LC-MS/MS. Haz clic en Archivo > Nuevo > Método MS para iniciar un nuevo método.
- Ve a la pestaña de Función y configura el tipo de función en monitorización de múltiples reacciones (MRM). Introduce las transiciones iónicas y los parámetros listados en la Tabla 1 para VCR y VINB (estándar interno).
- Pon el tiempo de adquisición en 4 minutos. Haz clic en Aplicar para guardar.
NOTA: No excedas los 4 minutos para asegurar el reequilibrio de la columna entre inyecciones. - Configura los parámetros UHPLC bajo Método de entrada > Edita el Método LC y guarda como archivo .mth (Tabla 2).
- Establece los parámetros de la fuente en la pestaña Tune según la Tabla 3. Guarda como archivo .tun.
- Guarda el método completo: Archivo > Guardar como y exportar como archivo .mth.
- Crear una lista de ejemplos y comenzar la partida
- En la pantalla principal del software, abre la Lista de Muestras y crea una lista con los nombres de las muestras, volúmenes de inyección, posiciones de los viales y el método a utilizar.
- Coloca un vial con agua ultrapura en la bandeja del automuestreador y designa que es un blank. Analiza el formulario entre cada serie de inyecciones triplicadas para evitar transferencias.
NOTA: Antes de iniciar la prueba, asegúrese de que la presión en la columna (ΔP) sea estable y inferior a 10 psi. - Selecciona las filas deseadas en la Lista de Ejemplo y haz clic en Ejecutar > OK para comenzar la adquisición de datos.
4. Análisis de datos
- Visualización y exportación de datos
- Una vez finalizada la partida, consulta los cromatogramas seleccionando una muestra y haciendo clic en Cromatografía en la barra superior del menú.
- En la pantalla de inicio, haz clic en TargetLynx, selecciona los archivos que acaban de ejecutarse y haz clic en Procesar > Seleccionar el método vincristina > OK, para generar tablas de salida.
- Haz clic en Reportar > Exportar Tabla y guarda los datos procesados como un archivo .csv o .xlsx.
NOTA: Exportar las áreas de pico en bruto tanto para el analito como para el estándar interno.
- Organización de datos y cálculo de ratios
- Abre el archivo exportado y crea las siguientes columnas:
- Muestra: Añade el nombre de la muestra o del frasco.
- Ejecutar: Indica a qué replica corresponde el valor.
- Área del VCR: Introduce el área por debajo del pico para la vincristina.
- Área VINB: Introduce la zona bajo el pico para vinblastina.
- Relación VCR/VINN: Normaliza cada valor de VCR dividiéndolo por su valor VINB correspondiente.
- Añade columnas para los valores de desviación estándar del área del VCR, área VINB y relación VCR/VINB para cada conjunto triplicado.
NOTA: La normalización mediante el estándar interno permite corregir la variación en el volumen de extracción o inyección.
- Abre el archivo exportado y crea las siguientes columnas:
- Resultados de la trazación
- Abre el software de grafado preferido y selecciona el formato de Tabla Agrupada .
- Elige Introducir o importar datos a una nueva tabla y, en Opciones, selecciona Introducir 3 valores replicados en subcolumnas lado a lado.
- Grafica solo las proporciones normalizadas VCR/VINB para cada muestra, omitiendo los valores de área bruta.
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Resultados
Los resultados cromatográficos representativos obtenidos tras ensayos de acumulación intracelular utilizando células primarias ALL PDX incubadas con VCR y VINB se muestran en la Figura 1. Se prepararon muestras utilizando 2,5 × 106 células por condición. Bajo las condiciones cromatográficas descritas, el VCR se mantuvo consistentemente en 2,85 minutos con un efecto matricial mínimo, y la forma máxima fue simétrica y bien resuelta. Estos perfiles ilustran el comportamiento cromatog...
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Discusión
La evaluación precisa de los niveles intracelulares de fármacos en células leucémicas primarias es esencial para comprender el manejo de fármacos a nivel celular y para apoyar el desarrollo de ensayos funcionales que complementen el perfilado molecular. Los enfoques analíticos existentes suelen requerir un gran número de células, implicar largos pasos de procesamiento o depender de lecturas indirectas que no reflejan la verdadera disponibilidad intracelular de agentes quimioterapéuticos<...
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de interés.
Agradecimientos
Agradecemos al Centro Infantil Boldrini y a todos los pacientes que donaron sus muestras para el estudio. Adrielli C. Soares recibió una beca de la Coordinación de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) y de la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP, 2023/18389-3). José A. Yunes recibió una beca de productividad del Consejo Nacional de Desarrollo Tecnológico y Científico (CNPq, 308399/2021-8). Este trabajo fue apoyado por financiación de investigación del Ministerio de Salud brasileño a través del programa PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vial de tapa de rosca de 2,0 mL | Suministro de caudal | 8-2400 | Usado con insertos de vidrio con muelle (5 x 29 mm) de la misma empresa (Cat. 5-29015) |
| Vial de tapa de rosca de 2,0 mL | Suministro de caudal | 8-2400 | Usado con insertos de vidrio con muelle (5 x 29 mm) de la misma empresa (Cat. 5-29015) |
| Acetonitrilo | Merck (Sigma-Aldrich) | 100030 | |
| Acetonitrilo | Merck (Sigma-Aldrich) | 24010152 | |
| AIM V | Thermo Fisher Scientific | 12055091 | |
| Sistema cromatográfico Acquity UPLC Clase H | Waters Co. | https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW | |
| Condesa 3 FL | Thermo Fisher Scientific | A49892 | |
| DMSO | Merck (Sigma-Aldrich) | D 8418 | |
| Falcon 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Ácido fórmico | Merck (Sigma-Aldrich) | F0507 | |
| Botella de cristal | Merck (Sigma-Aldrich) | 41121800 | |
| Incubadora | PHCBI | MCO-50M-PE | |
| Metanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 34860 | |
| Microtubo 1,5 mL | Eppendorf | 41121702 | |
| Microtubo 2,0 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| PBS | Merck (Sigma-Aldrich) | PPB006 | |
| Speevac miVac | Fisher Scientific | 56340 | |
| El software para la adquisición de datos | Waters Co. | MassLynx | |
| Espectrómetro de masas triple cuadrupolo Xevo TQ-S micro | Waters Co. | https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW | |
| Sonicador ultrasónico | Quimis | Q335D | |
| Vinblastina 1 mg/mL | Libbs | https://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/ | Vinblastina sulfato |
| Vincristine | Cayman Chemicals | 11764 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
