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Artículo de método

Generación y caracterización mediada por CRISPR/Cas9 de una cepa Ent2*/CyO de Drosophila melanogaster

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DOI:

10.3791/69546

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7 de agosto de 2026

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1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

En este artículo

Resumen

El transportador de nucleósidos equilibrados 2 (ENT2) es una proteína transmembrana conservada implicada en el transporte de nucleósidos y el metabolismo celular. En este estudio, se estableció un flujo de trabajo de edición genómica basado en CRISPR/Cas9 para generar un alelo dirigido a Ent2 en Drosophila melanogaster. Se construyó y mantuvo una línea heterocigota estable de Ent2*/CyO utilizando una estrategia de cromosomas equilibradores. Este trabajo describe el diseño, generación y validación molecular de la línea mutante, así como su caracterización fenotípica bajo diferentes condiciones de temperatura. El flujo de trabajo establecido y la cepa mutante proporcionan un marco práctico para estudiar genes con fenotipos letales homocigotos y para investigar la variación fenotípica asociada a la temperatura en Drosophila.

Resumen

En este estudio, se utilizó un enfoque de edición genómica basado en CRISPR/Cas9 para introducir mutaciones en el gen del transportador de nucleósido equilibrado 2 (Ent2) en Drosophila melanogaster. Se diseñaron ARN guía dirigidos a la región codificante de Ent2 e inyectaron conjuntamente con ARNm Cas9 en embriones w1118. Los alelos mutantes fueron identificados mediante secuenciación de Sanger y mantenidos como una línea heterocigota estable de Ent2*/CyO utilizando un cromosoma balanceador. Posteriormente, evaluamos el peso corporal, la capacidad de escalada, la tasa de supervivencia y las actividades de la superóxida dismutasa (SOD) y la catalasa (CAT) en moscas de la fruta a 22 °C y 25 °C, respectivamente. Los resultados indican que tanto a 22 °C como a 25 °C, la longitud corporal y el peso de las moscas de la fruta Ent2*/CyO se redujeron significativamente en comparación con el W1118, y su desarrollo se retrasó. A 22 °C, la vida útil total de las moscas Ent2*/CyO fue ligeramente mayor que la del W1118, mientras que a 25 °C no se observó una diferencia significativa. En cuanto a la capacidad locomotora, el rendimiento de trepada de las moscas heterocigotas fue significativamente menor que el del w1118 a ambas temperaturas, siendo los machos más gravemente afectados. Además, las actividades enzimáticas antioxidantes de CAT y SOD en moscas de la fruta Ent2*/CyO se redujeron significativamente, lo que indica un claro deterioro de la capacidad antioxidante. Estos resultados describen el perfil fenotípico de una línea mutante Ent2 generada por CRISPR y demuestran la viabilidad de combinar la edición genómica con estrategias de cromosomas equilibradores en Drosophila. Este estudio proporciona un marco metodológico y un recurso genético para futuras investigaciones de genes asociados al metabolismo y las respuestas ambientales.

Introducción

Drosophila melanogaster sigue siendo uno de los organismos modelo más utilizados en genética y biología deldesarrollo 1. Se caracteriza por un ciclo de vida corto, reproducción rápida, herramientas de manipulación genética establecidas y un genoma completamenteanotado 2,3. Esta especie se aplica extensamente en estudios sobre la función génica, la regulación metabólica y la adaptabilidad ambiental 4,5. Los nucleósidos y sus derivados, como el ATP, son fundamentales para la generación de energía celular, la síntesis de ácidos nucleicos y la transducción de señales en Drosophila, reflejando una regulación metabólica conservada a través de losmetazoos 6. Las vías de señalización purinérgica en Drosophila, que dependen de los mecanismos extracelulares de transporte de adenosina y nucleósidos, destacan el papel funcional del movimiento de nucleósidos a través de membranas en la coordinación de respuestas de energía y transducciónde señales 7. Entre estos procesos, el transporte de nucleósidos a través de la membrana citoplasmática está mediado principalmente por la familia de transportadores de nucleósidos equilibrados (ENT), con DmENT2 mostrando actividad de transporte funcional en Drosophila8.

La familia ENT comprende múltiples subtipos, entre los cuales ENT2 es un transportador nucleósidotransmembrana 9 ampliamente estudiado. Facilita el transporte transmembrana independiente de la energía de varios nucleósidos de purina ypirimidina 10,11. En mamíferos, ENT2 es un transportador bidireccional expresado de forma ubicua que facilita la absorción celular de nucleósidos y nucleobases de purina y pirimidina. Esta actividad de transporte contribuye al rescate de nucleótidos y ayuda a mantener la homeostasis metabólica celular12. ENT2 también media el transporte de una variedad de fármacos derivados de nucleósidos, extendiendo su relevancia funcional más allá del movimiento endógeno de nucleósidos, lo que destaca su importancia fisiológica y clínica másamplia 13. Además, ENT2 ha sido implicado en trastornos neurológicos14, metabolismotumoral 15, disfunciónvascular 16 y metabolismo energético celularen humanos 17. Sin embargo, los estudios que abordan los roles a nivel de organismo de Ent2 en Drosophila siguen siendo limitados.

Los roles de ENT2 en el crecimiento y desarrollo, metabolismo energético, rendimiento locomotor y capacidad antioxidante bajo condiciones de temperatura variable no se han exploradocompletamente 18. La temperatura afecta fuertemente la tasa metabólica basal y la esperanza de vida en Drosophila, con temperaturas de cría más altas que generalmente aumentan la actividad metabólica y reducen lalongevidad 19. Estos cambios dependientes de la temperatura en la expresión génica pueden influir en las vías fisiológicas y, por tanto, pueden modificar los efectos fenotípicos de mutaciones genéticasespecíficas 20.

La proteína 9 asociada a CRISPR, repeticiones palindrómicas agrupadas regularmente interespaciadas/proteína asociada a CRISPR (CRISPR/Cas9) se ha aplicado ampliamente en Drosophila para diversas operaciones de modificación genómica como eliminación específica del sitio, deleción, reemplazo e introducción de etiquetas, demostrando su eficiencia y fiabilidad 21,22,23. Los últimos avances indican que los editores de bases derivados de CRISPR también pueden utilizarse para modificaciones de base específicas de sitio más finas en Drosophila, proporcionando una nueva herramienta para mutaciones puntuales y control fenotípicopreciso 24. Los métodos tradicionales de mutagénesis, incluyendo la mutagénesis química y de radiación, así como los cribados mediados por transposones, pueden generar mutacionesgenéticas 25. Estos enfoques suelen estar limitados por la baja eficiencia y la alta aleatoriedad en los eventos de mutación. Como resultado, los investigadores deben examinar a grandes cantidades de individuos para aislar alelos específicos deinterés 26. CRISPR/Cas9 permite la escisión dirigida a ARN guía programado (gRNA) en secuencias de ADN específicas. Las rupturas resultantes de doble cadena se reparan mediante la unión de extremos no homóloga o la reparación dirigida por homología, generando mutaciones definidas y hereditarias y reduciendo significativamente las mutaciones de fondo que podrían confundir el análisisfenotípico 27,28. Los alelos mutantes generados mediante CRISPR/Cas9 pueden mantenerse en un estado heterocigoto mediante la vinculación con cromosomas balanceadores, como Curly O (CyO)29. Se ha demostrado que esta estrategia previene eficazmente la pérdida de alelos letales en forma homocigota en la genética de Drosophila. Como resultado, apoya la evaluación fenotípica sistemática y a largo plazo, incluyendo estudios funcionales bajo temperaturas o condiciones ambientales variables 29,30. El diseño sencillo y la alta eficiencia de CRISPR/Cas9 han acortado significativamente el ciclo de construcción de la cepa y mejorado la estabilidad del fondo genético. Esto es especialmente importante para estudiar factores ambientales a largo plazo como la respuesta a la temperatura y la homeostasis del desarrollo.

Sobre esta base, se eliminó el gen Ent2 en Drosophila melanogaster mediante el sistema CRISPR/Cas9, y se estableció una cepa mutante heterocigota Ent2*/CyO heredada de forma estable. Se evaluaron sistemáticamente el ciclo de desarrollo, el peso corporal, la capacidad locomotora y las actividades de las enzimas antioxidantes SOD y CAT. Al comparar fenotipos multidimensionales de w1118 y moscas mutantes bajo condiciones de temperatura variables, este estudio pretende presentar una estrategia reproducible para generar y mantener líneas mutantes derivadas de CRISPR y proporcionar una caracterización descriptiva de los fenotipos resultantes. Este trabajo ofrece un marco metodológico y un recurso genético útil para futuros estudios que investiguen genes implicados en el metabolismo y las respuestas ambientales.

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Protocolo

1. Diseño de objetivos CRISPR/Cas9 para el gen Ent2

  1. Selecciona sitios CRISPR candidatos en los exones 2 y 5 de Ent2 (ID FlyBase: FBgn0263916) usando CHOPCHOP (v3)31 y el CCTop (v1.0)32.
  2. El genoma de referencia se definió como Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (Acceso de ensamblaje RefSeq: GCF_000001215.4). Después, se identificaron sitios candidatos de gRNA. Finalmente, los sitios identificados fueron filtrados para obtener los gRNA óptimos.
  3. Filtrar los objetivos por la puntuación de especificidad del MIT ≥ 80 (CHOPCHOP), la puntuación CFD ≤ 0,1 (CCTop), el contenido de GC del 40%–60% y la distancia mínima del PAM.
  4. Clasifica los objetivos con una puntuación ponderada (eficiencia 50%, especificidad 30%, optimización de GC 20%) y elige dos gRNAs.
  5. Añade un "G" al extremo 5′ de cada gRNA para satisfacer el requisito de promotor T7. Utiliza los siguientes oligonucleótidos directos específicos de gRNA para generar la plantilla de transcripción de sgRNA de longitud completa mediante PCR:
    Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTTTTTTAGAGCTAGAAATAGC
    Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGTTTAGAGCTAGAAATAGC
  6. La secuencia restante del andamiaje de sgRNA es proporcionada por el oligonucleótido inverso universal durante la PCR.

2. Preparación de plantillas de transcripción de sgRNA

  1. Preparación de plantillas de transcripción de sgRNA
    1. Ensamblar una mezcla de reacción PCR de 60 μL utilizando el método de recocido-PCR de doble oligonucleótido33 según las instrucciones del fabricante. Combinar el oligonucleótido directo específico del ARNg (Ent2-sg1-F o Ent2-sg2-F) con un oligonucleótido inverso universal que codifica el andamiaje de sgRNA para obtener la plantilla completa de ADNdd para la transcripción in vitro.
    2. Programa el termociclador: 95 °C 3 min; 35 ciclos de 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 20 s; luego 72 °C 10 min; Mantener a 12 °C.
  2. Purificar la plantilla de transcripción
    1. Añadir 100 μL de acetato de amonio (véase Tabla de Materiales) a un producto PCR de 60 μL; mezcla. Añade 400 μL de etanol anhidro; Invierte para mezclar e incubar a -20 °C durante 20 minutos.
    2. Centrifugar a 4 °C, 20.000 x g durante 15 minutos; Descarta el sobrenadante.
    3. Seca el pellet al aire con el tubo abierto durante 10 minutos. Resuspende el pellet en 10 μL de ddH₂O libre de nucleasa.
  3. Transcripción in vitro de gRNA
    1. Establecer una reacción de transcripción in vitro de T7 de 10 μL siguiendo las instrucciones del kit (véase la Tabla de Materiales).
    2. Incubar a 37 °C durante 35 minutos. Añadir 0,5 μL de DNasa I (proporcionada en el kit de transcripción) e incubar a 37 °C durante 15 minutos.
  4. Purificar gRNA
    1. Diluir la mezcla de transcripción a 60 μL con ddH₂O libre de nucleasas. Añadir 60 μL de fenol/cloroformo saturado en agua (véase Tabla de Materiales); Vórtice brevemente y centrifugar a 4 °C, 16.000 x g durante 5 minutos.
    2. Transfiere 45 μL de la fase acuosa a un nuevo tubo libre de RNasa de 1,5 mL. Añadir 5 μL de acetato de sodio; mezcla.
    3. Añadir 125 μL de etanol anhidro preenfriado; mezcla e incuba a -20 °C durante 20–30 minutos. Centrifugar a 4 °C, 20.000 x g durante 15 minutos; Descarta el sobrenadante.
    4. Lavar el pellet con 200 μL de etanol al 70% (libre de RNasa); centrifugar a 4 °C, 20.000 x g durante 5 minutos; Quita el sobrenadante.
    5. Seca el pellet a 37 °C hasta que el etanol se evapore por completo. Resuspender en 20 μL ddH₂O; alicuota y guarda a -80 °C.
    6. Mide la concentración de gRNA usando un espectrofotómetro NanoDrop y ajusta la concentración a 250 ng/μL para la inyección. Asegura la pureza del gRNA con una proporción A260/A280 de aproximadamente 2,0.
      NOTA: Enfatizamos que los guantes deben usarse durante todo el proceso para proteger a RNasa. Todos los consumibles, incluidos los tubos de centrifugadora y las puntas de pipeta sin RNasa preenfriados, deben usarse de forma constante durante el procedimiento. Los residuos orgánicos generados durante la operación deben recogerse por separado en contenedores designados según el tipo y transportarse regularmente a una instalación certificada para la eliminación de residuos peligrosos para su correcta manipulación.

3. Preparación del ARNm de Cas9

  1. Preparación de la plantilla de transcripción
    NOTA: Utiliza puntas y tubos libres de RNasa durante los pasos relacionados con el ARN.
    1. Descongelar el plásmido de expresión Cas9 MLM3613 (véase Tabla de Materiales) sobre hielo. En un tubo sin RNasa, combina 20 μg de ADN plasmídico, 7,5 μL de tampón de restricción 10x, 1 μL de PmeI (10.000 U/mL) y ddH₂O sin nucleasas a 75 μL.
    2. Incuba a 37 °C durante 30 minutos. Verifica la linealización completa cargando 5 μL sobre un gel de agarosa al 1% a 120 V durante 30 minutos.
  2. Purificación de plantillas de transcripción
    1. Añadir 23 μL de dodecilo sulfato de sodio al 2% (SDS, véase Tabla de Materiales para más detalles) y 0,5 μL de proteinasa K (véase Tabla de Materiales para más detalles) a 70 μL de la digerencia; incubar a 50 °C durante 30 minutos.
    2. Añadir 45 μL de cloroformo y 45 μL de fenol trisaturado; vórtice brevemente; Centrifugadora 13.800 x G, 5 min.
    3. Transfiere la fase acuosa de 90 μL a un tubo nuevo. Añadir 10 μL de acetato de sodio (proporcionado por el kit) y 200 μL etanol anhidro preenfriado; Mix; incubar −20 °C, 30 min.
    4. Centrifugadora 20.000 x g, 4 °C, 15 min; Descarta el sobrenadante. Lava el pellet dos veces con 100 μL de etanol al 70%; centrifugadora 20.000 x g, 2 min cada una; Seca al aire.
    5. Disolver ADN en 20 μL ddH₂O libre de nucleasas; confirmar >500 ng/μL.
  3. Transcripción in vitro con co-caping
    1. Configura la reacción usando un kit de transcripción in vitro T7 con tapado (véase Tabla de Materiales) según las instrucciones del fabricante.
    2. Incubar a 37 °C durante 2 horas para generar ARNm de Cas9 limitado.
    3. Una vez completada la reacción de transcripción, añadir 1 μL de DNasa (proporcionada en el kit, concentración 2 U/μL), mezclar bien e incubar a 37°C durante 15 minutos para degradar la plantilla de ADN.
  4. Añadir una cola poli(A)
    1. Lleva el ARN a 14 μL ddH₂O.
    2. Añadir 2 μL de buffer de polipolimerasa 10x de E. coli , 2 μL de ATP (10 mM), 1 μL inhibidor de RNasa y 1 μL de poli(A) polimerasa.
    3. Incuba a 37 °C durante 45 minutos.
  5. Purificar el ARNm
    1. Aplicar la reacción a un kit de ARN total de columna de spin (véase Tabla de Materiales). Carga la muestra sobre una columna de spin de membrana de sílice de 2 mL; centrifugadora 8.000 x g, 15 s; descartar el flujo a través del juego.
    2. Añadir 500 μL de tampón RPE a la columna RNeasy, centrifugar a 8000 x g durante 15 s y descartar el líquido residual. Repite este paso una vez, luego centrifuga durante 2 minutos y desecha el líquido residual.
    3. Coloca la columna RNeasy en un nuevo tubo centrifugador de 1,5 mL. Añade 30 μL de ddH₂O libre de RNasa, centrifuga a 8000 x g durante 1 minuto para eluir el ARN. Ajusta la concentración de ARNm a 500 ng/μL para la inyección. Almacena el ARN eluído a -80 °C.

4. Microinyección de embriones de Drosophila

  1. Preparación de muestras de inyección
    1. Mezcla 15 μg de ARNm Cas9 con 7,5 μg de ARNg de doble cadena a una relación de volumen de 2:1.
    2. Ajustar a 30 μL con agua libre de RNasa tratada con DEPC; Mantente en hielo.
  2. Crianza de Drosophila
    1. Transfiere la cepa inyectada de Drosophila w1118 a grandes tubos de alimentación para amplificarla. Se utilizaron moscasW 1118 como control de referencia para representar el estado fisiológico basal sin efectos asociados al balanceador.
    2. Mantener las moscas en una cámara climática artificial ajustada a 25 °C con una humedad del 60%–70% y un ciclo de luz a oscuridad de 12:12 durante 14 días.
    3. A las 17:00 del día siguiente al periodo de cría de 14 días (Día 15), recoge moscas adultas para sincronizar la puesta cronometrada de los embriones. Este tiempo específico de recogida garantiza que los embriones utilizados para la inyección estén en una etapa de desarrollo constante. Controlar la hora del día es importante para minimizar los efectos del ritmo circadiano en el desarrollo embrionario y el comportamiento reproductivo, asegurando así la reproducibilidad experimental y reduciendo la variabilidad fisiológica entre lotes.
  3. Microinyección de Drosophila
    1. Recoge moscas adultas para inyectarlas en jaulas para moscas, con aproximadamente 400 adultos por jaula. Recoger embriones en placas de agar recubiertas de levadura; Recoge los embriones en un plazo de 60 minutos tras la puesta y enjuágalos sobre las fundas de la porta. No se realizó decorionación antes de la inyección.
    2. Alinear los embriones en las mantas con los polos posteriores orientados hacia fuera, dispuestos de forma ordenada de arriba hacia abajo. Asegúrese de que la aguja de inyección penetre el polo posterior a una profundidad adecuada (aproximadamente una quinta parte de la longitud del embrión) para una entrega citoplasmática constante. En este estudio se utilizaron un total de 300 embriones.
    3. Bajo un estereomicroscopio, enfoca la punta de la aguja y el embrión en el mismo plano.
    4. Con el instrumento de inyección, perfora el polo posterior e inyecta 0,001 μL de la mezcla en cada embrión.
    5. Transferir embriones inyectados a viales de alimentos; incuban a 25 °C, ~70% de humedad relativa (HR) para obtener generación P₀ (los adultos inyectados que sobreviven para producir descendencia).

5. Construcción de cepas de expresión estable en Drosophila

  1. Cruza P₀ eclosedo con moscas Bc/CyO .
    1. Microinyectar una mezcla de gRNA dirigido al gen de interés y la proteína Cas9 en 300 embriones de la cepa w1118 Drosophila . Después de la inyección, obtén un total de 30 adultos P0 viables y fértiles. Cruza cada adulto P0 (mosaico) individualmente con moscas de la cepa w1118 , dando lugar a 16 cruces de pareja única (8 viales con machos P0 cruzados con hembras vírgenes y 8 viales con hembras P0 cruzadas con machos). Mantener todos los cruces a 25 °C bajo condiciones de cultivo constante.
    2. Tras la aparición de las larvas F1, se eliminan las moscas parentales P0. Extraer ADN genómico de la descendencia F1 y someterlo a análisis PCR para determinar los genotipos adultos F1 (Ent2/+).
    3. Genera descendencia F2 mediante cruces simples entre moscas Bc/CyO . Selecciona adultos individuos F2 y genotipézalos para identificar moscas con el genotipo Ent2/CyO .
    4. Moscas Intercross F3 (Ent2/CyO) para evaluar la presencia de mutantes homocigotos. Si no se recuperan moscas homocigotas, se cruzan moscas Ent2/CyO durante una generación adicional para determinar si el genotipo homocigoto es letal.
  2. Extracción de ADN genómico de Drosophila
    1. Recoge una o dos moscas adultas en un tubo EP de 1,5 mL y añade 110 μL de Plant DNA Extracter Buffer PA.
    2. Homogeneiza bien las muestras usando un triturador de tejido durante al menos 3 minutos.
    3. Incuba los homogenados en un baño metálico a 65 °C durante no menos de 30 minutos.
    4. Añade 100 μL de cloroformo, invierte suavemente la mezcla para mezclar y haz un vórtice durante 10 segundos. Centrifuga las muestras a 14.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    5. Transfiere cuidadosamente aproximadamente 65 μL (o más) del sobrenadante a un nuevo tubo, añade dos volúmenes de etanol absoluto preenfriado (preincubado a 4 °C durante al menos 10 minutos), invierte suavemente para mezclar y incuba a -20 °C durante al menos 15 minutos.
    6. Centrifugar muestras a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C y descartar cuidadosamente el sobrenadante.
    7. Seca al aire la pelota de ADN a temperatura ambiente o en una incubadora hasta que esté completamente seca, y luego vuelve a suspenderla en un volumen adecuado de tampón de PB. Para muestras hembras (f), añadir 50 μL de tampón PB, mientras que para muestras macho (m), añadir 15 μL.
  3. Amplificación por PCR y secuenciación Sanger
    1. Realizar amplificación por PCR utilizando cebadores específicos diseñados para flanquear las regiones aguas arriba y aguas abajo del sitio objetivo del gRNA.
    2. Purifica los productos de PCR y sometelos a la secuenciación de Sanger. Analizar los cromatogramas de secuenciación usando el softwareSnapGene 34 y alinear con la secuencia de referencia wild-type para análisis comparativo.
    3. Examina los gráficos de picos cerca del sitio objetivo del gRNA para detectar picos superpuestos indicativos de mutaciones indeles. Realizar la división de picos para resolver señales mixtas y confirmar el tipo de mutación, incluyendo inserciones o deleciones en el sitio objetivo.
    4. Retrocruzamiento con machos Bc/CyO durante 4 generaciones para establecer Ent2/CyO.
      Nota: Se ha observado que Ent2*/Ent2* y CyO/CyO son letales en las primeras etapas del desarrollo; por lo tanto, se mantienen los heterocigotos Ent2*/CyO .
  4. Tras establecer los heterocigotos Ent2*/CyO , recoge muestras del mismo lote de heterocigotos Ent2*/CyO bajo un estereomicroscopio.
  5. Selecciona al azar 20 moscas adultas y pésalas usando una balanza de precisión con una resolución de 0,001 g. Fotografía las muestras para documentar las características fenotípicas.

6. Caracterización fenotípica descriptiva

  1. Los 120 machos y 120 hembras de la parte trasera (probaron tres viales para cada grupo, con cada frasco conteniendo 20 moscas) de Ent2*/CyO y w1118 a 22 °C y 25 °C.
  2. Registra el número de muertes semanalmente y traza las curvas de supervivencia.
  3. Establecer 30 parejas de apareamiento aleatorias por grupo; permitir un apareamiento de 24 horas;
  4. Transferir adultos a tubos nuevos; descendencia posterior.
  5. A los 7 días de la eclosión, evaluar el éxito de la escalada (≥8 cm en 30 s) con seis réplicas por grupo.
  6. Todas las observaciones se registraron como características descriptivas de la línea mutante y no se utilizaron para inferir la función génica.

7. Medir las actividades enzimáticas antioxidantes

  1. Recoger 300 machos y 300 hembras adultos (analizaron tres viales para cada grupo, con cada vial conteniendo 100 moscas), Ent2*/CyO y W1118 moscas control a los 5 días tras la eclosión, para asegurar la madurez fisiológica y la edad comparable.
  2. Transfiere las moscas a tubos vacíos sin comida y muérete de hambre durante 2 horas para estandarizar el estado metabólico antes de los ensayos bioquímicos.
  3. Añade una cuenta/tubo de acero; homogeneizar a 60 Hz, 2 minutos.
  4. Centrífuga 4 °C, 161 x g, 10 min; Recoge el sobrenadante.
  5. Mide la superóxida total dismutasa (SOD, véase la Tabla de Materiales para más detalles) y la catalasa (CAT, véase la Tabla de Materiales para más detalles) según las instrucciones del kit.

8. Estadísticas y análisis de datos

  1. Expresa todos los datos como media ± error estándar de la media (figure-protocol-1± SEM).
  2. Utilizar ANOVA unidireccional para comparar datos de actividad enzimática; Aplica ANOVA de tres vías (factores: genotipo, temperatura, sexo) para medir el peso corporal, la capacidad de escalada y la longitud corporal. Realizar la prueba HSD de Tukey a posteriori cuando sea apropiado35.
  3. Define la significación como P < 0,05 para todas las pruebas estadísticas.
  4. Analizar los datos de esperanza de vida utilizando curvas de supervivencia y realizar la prueba log-rank (Mantel-Cox), que evalúa si existen diferencias significativas en las trayectorias de supervivencia entre las cohortesexperimentales 36.
  5. Realizar todos los análisis y gráficos en el software GraphPad Prism 9.5.0 siguiendo las directricesdel software 37.
  6. Todos los análisis estadísticos se realizaron únicamente para la comparación descriptiva y no para establecer relaciones causales.

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Resultados

Diseño y análisis de verificación de eficacia de los sitios de dirección génica Ent2
Los sitios objetivo candidatos para el gen Ent2 fueron diseñados utilizando plataformas CHOPCHOP y CCTop (Figura 1). Se seleccionaron dos gRNAs dirigidos a las regiones del exón 2 y del éxón 5 en función de criterios de especificidad y eficiencia. Para verificar la edición genómica exitosa, se amplificó el ADN genómico de individuos seleccionados aleatoriamente de la línea

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Discusión

El otorrinolaringólogo es una proteína conservada evolutivamente que influye en múltiples procesos biológicos38. Cuando se expresa en ovocitos de Xenopus laevis, Ent2 muestra actividad de transporte denucleósidos 8. Los estudios han demostrado que el mutante homocigoto de Ent2 es letal durante la fase larval tardía o en lafase pupal temprana 10. En el presente estudio, se estableció un fluj...

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Divulgaciones

Todos los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Apoyar esta investigación del Programa de Desarrollo Científico y Tecnológico de la provincia de Jilin (Proyecto nº 20230505044ZP).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ammonium acetateSigma A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (Visible Light Method) (Ammonium Molybdate Method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Dodecyl sulfateSigmaL3771
Injection deviceEppendorf FemtoJet 4i
Linearized plasmid: MLM3613Addgene42251
MicroscopeOLYMPUS CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kitThermo FisherAM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitThermo FisherAM1344
PmeI restriction enzymeNEB R0560S
Poly(A) polymeraseNEBM0276S
Protease KThermo FisherEO0491
RNeasy Mini KitQIAGEN74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production SystemPromega P1320
T7 RiboMAX KitPromega P1320
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) assay kit (Hydroxylamine method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-1
w1118 Drosophila Fangjing Biology
Water-saturated phenol/chloroformSigmaP2069

Referencias

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  2. Ogienko, A. A., et al. Drosophila as a Model Organism to Study Basic Mechanisms of Longevity. Int J Mol Sci. 23 (19), (2022).
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