Artículo de método

Generación y caracterización mediada por CRISPR/Cas9 de una cepa Ent2*/CyO de Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/69546

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7 de agosto de 2026

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1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El transportador de nucleósidos equilibrados 2 (ENT2) es una proteína transmembrana conservada implicada en el transporte de nucleósidos y el metabolismo celular. En este estudio, se estableció un flujo de trabajo de edición genómica basado en CRISPR/Cas9 para generar un alelo dirigido a Ent2 en Drosophila melanogaster. Se construyó y mantuvo una línea heterocigota estable de Ent2*/CyO utilizando una estrategia de cromosomas equilibradores. Este trabajo describe el diseño, generación y validación molecular de la línea mutante, así como su caracterización fenotípica bajo diferentes condiciones de temperatura. El flujo de trabajo establecido y la cepa mutante proporcionan un marco práctico para estudiar genes con fenotipos letales homocigotos y para investigar la variación fenotípica asociada a la temperatura en Drosophila.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio, se utilizó un enfoque de edición genómica basado en CRISPR/Cas9 para introducir mutaciones en el gen del transportador de nucleósido equilibrado 2 (Ent2) en Drosophila melanogaster. Se diseñaron ARN guía dirigidos a la región codificante de Ent2 e inyectaron conjuntamente con ARNm Cas9 en embriones w1118. Los alelos mutantes fueron identificados mediante secuenciación de Sanger y mantenidos como una línea heterocigota estable de Ent2*/CyO utilizando un cromosoma balanceador. Posteriormente, evaluamos el peso corporal, la capacidad de escalada, la tasa de supervivencia y las actividades de la superóxida dismutasa (SOD) y la catalasa (CAT) en moscas de la fruta a 22 °C y 25 °C, respectivamente. Los resultados indican que tanto a 22 °C como a 25 °C, la longitud corporal y el peso de las moscas de la fruta Ent2*/CyO se redujeron significativamente en comparación con el W1118, y su desarrollo se retrasó. A 22 °C, la vida útil total de las moscas Ent2*/CyO fue ligeramente mayor que la del W1118, mientras que a 25 °C no se observó una diferencia significativa. En cuanto a la capacidad locomotora, el rendimiento de trepada de las moscas heterocigotas fue significativamente menor que el del w1118 a ambas temperaturas, siendo los machos más gravemente afectados. Además, las actividades enzimáticas antioxidantes de CAT y SOD en moscas de la fruta Ent2*/CyO se redujeron significativamente, lo que indica un claro deterioro de la capacidad antioxidante. Estos resultados describen el perfil fenotípico de una línea mutante Ent2 generada por CRISPR y demuestran la viabilidad de combinar la edición genómica con estrategias de cromosomas equilibradores en Drosophila. Este estudio proporciona un marco metodológico y un recurso genético para futuras investigaciones de genes asociados al metabolismo y las respuestas ambientales.

Introducción

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Drosophila melanogaster sigue siendo uno de los organismos modelo más utilizados en genética y biología deldesarrollo 1. Se caracteriza por un ciclo de vida corto, reproducción rápida, herramientas de manipulación genética establecidas y un genoma completamenteanotado 2,3. Esta especie se aplica extensamente en estudios sobre la función génica, la regulación metabólica y la adaptabilidad ambiental 4,5. Los nucleósidos y sus derivados, como el ATP, son fundamentales para la generación de energía celular, la síntesis de ácidos nucleicos y la transducción de señales en Drosophila, reflejando una regulación metabólica conservada a través de losmetazoos 6. Las vías de señalización purinérgica en Drosophila, que dependen de los mecanismos extracelulares de transporte de adenosina y nucleósidos, destacan el papel funcional del movimiento de nucleósidos a través de membranas en la coordinación de respuestas de energía y transducciónde señales 7. Entre estos procesos, el transporte de nucleósidos a través de la membrana citoplasmática está mediado principalmente por la familia de transportadores de nucleósidos equilibrados (ENT), con DmENT2 mostrando actividad de transporte funcional en Drosophila8.

La familia ENT comprende múltiples subtipos, entre los cuales ENT2 es un transportador nucleósidotransmembrana 9 ampliamente estudiado. Facilita el transporte transmembrana independiente de la energía de varios nucleósidos de purina ypirimidina 10,11. En mamíferos, ENT2 es un transportador bidireccional expresado de forma ubicua que facilita la absorción celular de nucleósidos y nucleobases de purina y pirimidina. Esta actividad de transporte contribuye al rescate de nucleótidos y ayuda a mantener la homeostasis metabólica celular12. ENT2 también media el transporte de una variedad de fármacos derivados de nucleósidos, extendiendo su relevancia funcional más allá del movimiento endógeno de nucleósidos, lo que destaca su importancia fisiológica y clínica másamplia 13. Además, ENT2 ha sido implicado en trastornos neurológicos14, metabolismotumoral 15, disfunciónvascular 16 y metabolismo energético celularen humanos 17. Sin embargo, los estudios que abordan los roles a nivel de organismo de Ent2 en Drosophila siguen siendo limitados.

Los roles de ENT2 en el crecimiento y desarrollo, metabolismo energético, rendimiento locomotor y capacidad antioxidante bajo condiciones de temperatura variable no se han exploradocompletamente 18. La temperatura afecta fuertemente la tasa metabólica basal y la esperanza de vida en Drosophila, con temperaturas de cría más altas que generalmente aumentan la actividad metabólica y reducen lalongevidad 19. Estos cambios dependientes de la temperatura en la expresión génica pueden influir en las vías fisiológicas y, por tanto, pueden modificar los efectos fenotípicos de mutaciones genéticasespecíficas 20.

La proteína 9 asociada a CRISPR, repeticiones palindrómicas agrupadas regularmente interespaciadas/proteína asociada a CRISPR (CRISPR/Cas9) se ha aplicado ampliamente en Drosophila para diversas operaciones de modificación genómica como eliminación específica del sitio, deleción, reemplazo e introducción de etiquetas, demostrando su eficiencia y fiabilidad 21,22,23. Los últimos avances indican que los editores de bases derivados de CRISPR también pueden utilizarse para modificaciones de base específicas de sitio más finas en Drosophila, proporcionando una nueva herramienta para mutaciones puntuales y control fenotípicopreciso 24. Los métodos tradicionales de mutagénesis, incluyendo la mutagénesis química y de radiación, así como los cribados mediados por transposones, pueden generar mutacionesgenéticas 25. Estos enfoques suelen estar limitados por la baja eficiencia y la alta aleatoriedad en los eventos de mutación. Como resultado, los investigadores deben examinar a grandes cantidades de individuos para aislar alelos específicos deinterés 26. CRISPR/Cas9 permite la escisión dirigida a ARN guía programado (gRNA) en secuencias de ADN específicas. Las rupturas resultantes de doble cadena se reparan mediante la unión de extremos no homóloga o la reparación dirigida por homología, generando mutaciones definidas y hereditarias y reduciendo significativamente las mutaciones de fondo que podrían confundir el análisisfenotípico 27,28. Los alelos mutantes generados mediante CRISPR/Cas9 pueden mantenerse en un estado heterocigoto mediante la vinculación con cromosomas balanceadores, como Curly O (CyO)29. Se ha demostrado que esta estrategia previene eficazmente la pérdida de alelos letales en forma homocigota en la genética de Drosophila. Como resultado, apoya la evaluación fenotípica sistemática y a largo plazo, incluyendo estudios funcionales bajo temperaturas o condiciones ambientales variables 29,30. El diseño sencillo y la alta eficiencia de CRISPR/Cas9 han acortado significativamente el ciclo de construcción de la cepa y mejorado la estabilidad del fondo genético. Esto es especialmente importante para estudiar factores ambientales a largo plazo como la respuesta a la temperatura y la homeostasis del desarrollo.

Sobre esta base, se eliminó el gen Ent2 en Drosophila melanogaster mediante el sistema CRISPR/Cas9, y se estableció una cepa mutante heterocigota Ent2*/CyO heredada de forma estable. Se evaluaron sistemáticamente el ciclo de desarrollo, el peso corporal, la capacidad locomotora y las actividades de las enzimas antioxidantes SOD y CAT. Al comparar fenotipos multidimensionales de w1118 y moscas mutantes bajo condiciones de temperatura variables, este estudio pretende presentar una estrategia reproducible para generar y mantener líneas mutantes derivadas de CRISPR y proporcionar una caracterización descriptiva de los fenotipos resultantes. Este trabajo ofrece un marco metodológico y un recurso genético útil para futuros estudios que investiguen genes implicados en el metabolismo y las respuestas ambientales.

Protocolo

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1. Diseño de objetivos CRISPR/Cas9 para el gen Ent2

  1. Selecciona sitios CRISPR candidatos en los exones 2 y 5 de Ent2 (ID FlyBase: FBgn0263916) usando CHOPCHOP (v3)31 y el CCTop (v1.0)32.
  2. El genoma de referencia se definió como Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (Acceso de ensamblaje RefSeq: GCF_000001215.4). Después, se identificaron sitios candidatos de gRNA. Finalmente, los sitios identificados fueron filtrados para obtener los gRNA óptimos.
  3. Filtrar los objetivos por la puntuación de especificidad del MIT ≥ 80 (CHOPCHOP), la puntuación CFD ≤ 0,1 (CCTop), el contenido de GC del 40%–60% y la distancia mínima del PAM.
  4. Clasifica los objetivos con una puntuación ponderada (eficiencia 50%, especificidad 30%, optimización de GC 20%) y elige dos gRNAs.
  5. Añade un "G" al extremo 5′ de cada gRNA para satisfacer el requisito de promotor T7. Utiliza los siguientes oligonucleótidos directos específicos de gRNA para generar la plantilla de transcripción de sgRNA de longitud completa mediante PCR:
    Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTTTTTTAGAGCTAGAAATAGC
    Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGTTTAGAGCTAGAAATAGC
  6. La secuencia restante del andamiaje de sgRNA es proporcionada por el oligonucleótido inverso universal durante la PCR.

2. Preparación de plantillas de transcripción de sgRNA

  1. Preparación de plantillas de transcripción de sgRNA
    1. Ensamblar una mezcla de reacción PCR de 60 μL utilizando el método de recocido-PCR de doble oligonucleótido33 según las instrucciones del fabricante. Combinar el oligonucleótido directo específico del ARNg (Ent2-sg1-F o Ent2-sg2-F) con un oligonucleótido inverso universal que codifica el andamiaje de sgRNA para obtener la plantilla completa de ADNdd para la transcripción in vitro.
    2. Programa el termociclador: 95 °C 3 min; 35 ciclos de 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 20 s; luego 72 °C 10 min; Mantener a 12 °C.
  2. Purificar la plantilla de transcripción
    1. Añadir 100 μL de acetato de amonio (véase Tabla de Materiales) a un producto PCR de 60 μL; mezcla. Añade 400 μL de etanol anhidro; Invierte para mezclar e incubar a -20 °C durante 20 minutos.
    2. Centrifugar a 4 °C, 20.000 x g durante 15 minutos; Descarta el sobrenadante.
    3. Seca el pellet al aire con el tubo abierto durante 10 minutos. Resuspende el pellet en 10 μL de ddH₂O libre de nucleasa.
  3. Transcripción in vitro de gRNA
    1. Establecer una reacción de transcripción in vitro de T7 de 10 μL siguiendo las instrucciones del kit (véase la Tabla de Materiales).
    2. Incubar a 37 °C durante 35 minutos. Añadir 0,5 μL de DNasa I (proporcionada en el kit de transcripción) e incubar a 37 °C durante 15 minutos.
  4. Purificar gRNA
    1. Diluir la mezcla de transcripción a 60 μL con ddH₂O libre de nucleasas. Añadir 60 μL de fenol/cloroformo saturado en agua (véase Tabla de Materiales); Vórtice brevemente y centrifugar a 4 °C, 16.000 x g durante 5 minutos.
    2. Transfiere 45 μL de la fase acuosa a un nuevo tubo libre de RNasa de 1,5 mL. Añadir 5 μL de acetato de sodio; mezcla.
    3. Añadir 125 μL de etanol anhidro preenfriado; mezcla e incuba a -20 °C durante 20–30 minutos. Centrifugar a 4 °C, 20.000 x g durante 15 minutos; Descarta el sobrenadante.
    4. Lavar el pellet con 200 μL de etanol al 70% (libre de RNasa); centrifugar a 4 °C, 20.000 x g durante 5 minutos; Quita el sobrenadante.
    5. Seca el pellet a 37 °C hasta que el etanol se evapore por completo. Resuspender en 20 μL ddH₂O; alicuota y guarda a -80 °C.
    6. Mide la concentración de gRNA usando un espectrofotómetro NanoDrop y ajusta la concentración a 250 ng/μL para la inyección. Asegura la pureza del gRNA con una proporción A260/A280 de aproximadamente 2,0.
      NOTA: Enfatizamos que los guantes deben usarse durante todo el proceso para proteger a RNasa. Todos los consumibles, incluidos los tubos de centrifugadora y las puntas de pipeta sin RNasa preenfriados, deben usarse de forma constante durante el procedimiento. Los residuos orgánicos generados durante la operación deben recogerse por separado en contenedores designados según el tipo y transportarse regularmente a una instalación certificada para la eliminación de residuos peligrosos para su correcta manipulación.

3. Preparación del ARNm de Cas9

  1. Preparación de la plantilla de transcripción
    NOTA: Utiliza puntas y tubos libres de RNasa durante los pasos relacionados con el ARN.
    1. Descongelar el plásmido de expresión Cas9 MLM3613 (véase Tabla de Materiales) sobre hielo. En un tubo sin RNasa, combina 20 μg de ADN plasmídico, 7,5 μL de tampón de restricción 10x, 1 μL de PmeI (10.000 U/mL) y ddH₂O sin nucleasas a 75 μL.
    2. Incuba a 37 °C durante 30 minutos. Verifica la linealización completa cargando 5 μL sobre un gel de agarosa al 1% a 120 V durante 30 minutos.
  2. Purificación de plantillas de transcripción
    1. Añadir 23 μL de dodecilo sulfato de sodio al 2% (SDS, véase Tabla de Materiales para más detalles) y 0,5 μL de proteinasa K (véase Tabla de Materiales para más detalles) a 70 μL de la digerencia; incubar a 50 °C durante 30 minutos.
    2. Añadir 45 μL de cloroformo y 45 μL de fenol trisaturado; vórtice brevemente; Centrifugadora 13.800 x G, 5 min.
    3. Transfiere la fase acuosa de 90 μL a un tubo nuevo. Añadir 10 μL de acetato de sodio (proporcionado por el kit) y 200 μL etanol anhidro preenfriado; Mix; incubar −20 °C, 30 min.
    4. Centrifugadora 20.000 x g, 4 °C, 15 min; Descarta el sobrenadante. Lava el pellet dos veces con 100 μL de etanol al 70%; centrifugadora 20.000 x g, 2 min cada una; Seca al aire.
    5. Disolver ADN en 20 μL ddH₂O libre de nucleasas; confirmar >500 ng/μL.
  3. Transcripción in vitro con co-caping
    1. Configura la reacción usando un kit de transcripción in vitro T7 con tapado (véase Tabla de Materiales) según las instrucciones del fabricante.
    2. Incubar a 37 °C durante 2 horas para generar ARNm de Cas9 limitado.
    3. Una vez completada la reacción de transcripción, añadir 1 μL de DNasa (proporcionada en el kit, concentración 2 U/μL), mezclar bien e incubar a 37°C durante 15 minutos para degradar la plantilla de ADN.
  4. Añadir una cola poli(A)
    1. Lleva el ARN a 14 μL ddH₂O.
    2. Añadir 2 μL de buffer de polipolimerasa 10x de E. coli , 2 μL de ATP (10 mM), 1 μL inhibidor de RNasa y 1 μL de poli(A) polimerasa.
    3. Incuba a 37 °C durante 45 minutos.
  5. Purificar el ARNm
    1. Aplicar la reacción a un kit de ARN total de columna de spin (véase Tabla de Materiales). Carga la muestra sobre una columna de spin de membrana de sílice de 2 mL; centrifugadora 8.000 x g, 15 s; descartar el flujo a través del juego.
    2. Añadir 500 μL de tampón RPE a la columna RNeasy, centrifugar a 8000 x g durante 15 s y descartar el líquido residual. Repite este paso una vez, luego centrifuga durante 2 minutos y desecha el líquido residual.
    3. Coloca la columna RNeasy en un nuevo tubo centrifugador de 1,5 mL. Añade 30 μL de ddH₂O libre de RNasa, centrifuga a 8000 x g durante 1 minuto para eluir el ARN. Ajusta la concentración de ARNm a 500 ng/μL para la inyección. Almacena el ARN eluído a -80 °C.

4. Microinyección de embriones de Drosophila

  1. Preparación de muestras de inyección
    1. Mezcla 15 μg de ARNm Cas9 con 7,5 μg de ARNg de doble cadena a una relación de volumen de 2:1.
    2. Ajustar a 30 μL con agua libre de RNasa tratada con DEPC; Mantente en hielo.
  2. Crianza de Drosophila
    1. Transfiere la cepa inyectada de Drosophila w1118 a grandes tubos de alimentación para amplificarla. Se utilizaron moscasW 1118 como control de referencia para representar el estado fisiológico basal sin efectos asociados al balanceador.
    2. Mantener las moscas en una cámara climática artificial ajustada a 25 °C con una humedad del 60%–70% y un ciclo de luz a oscuridad de 12:12 durante 14 días.
    3. A las 17:00 del día siguiente al periodo de cría de 14 días (Día 15), recoge moscas adultas para sincronizar la puesta cronometrada de los embriones. Este tiempo específico de recogida garantiza que los embriones utilizados para la inyección estén en una etapa de desarrollo constante. Controlar la hora del día es importante para minimizar los efectos del ritmo circadiano en el desarrollo embrionario y el comportamiento reproductivo, asegurando así la reproducibilidad experimental y reduciendo la variabilidad fisiológica entre lotes.
  3. Microinyección de Drosophila
    1. Recoge moscas adultas para inyectarlas en jaulas para moscas, con aproximadamente 400 adultos por jaula. Recoger embriones en placas de agar recubiertas de levadura; Recoge los embriones en un plazo de 60 minutos tras la puesta y enjuágalos sobre las fundas de la porta. No se realizó decorionación antes de la inyección.
    2. Alinear los embriones en las mantas con los polos posteriores orientados hacia fuera, dispuestos de forma ordenada de arriba hacia abajo. Asegúrese de que la aguja de inyección penetre el polo posterior a una profundidad adecuada (aproximadamente una quinta parte de la longitud del embrión) para una entrega citoplasmática constante. En este estudio se utilizaron un total de 300 embriones.
    3. Bajo un estereomicroscopio, enfoca la punta de la aguja y el embrión en el mismo plano.
    4. Con el instrumento de inyección, perfora el polo posterior e inyecta 0,001 μL de la mezcla en cada embrión.
    5. Transferir embriones inyectados a viales de alimentos; incuban a 25 °C, ~70% de humedad relativa (HR) para obtener generación P₀ (los adultos inyectados que sobreviven para producir descendencia).

5. Construcción de cepas de expresión estable en Drosophila

  1. Cruza P₀ eclosedo con moscas Bc/CyO .
    1. Microinyectar una mezcla de gRNA dirigido al gen de interés y la proteína Cas9 en 300 embriones de la cepa w1118 Drosophila . Después de la inyección, obtén un total de 30 adultos P0 viables y fértiles. Cruza cada adulto P0 (mosaico) individualmente con moscas de la cepa w1118 , dando lugar a 16 cruces de pareja única (8 viales con machos P0 cruzados con hembras vírgenes y 8 viales con hembras P0 cruzadas con machos). Mantener todos los cruces a 25 °C bajo condiciones de cultivo constante.
    2. Tras la aparición de las larvas F1, se eliminan las moscas parentales P0. Extraer ADN genómico de la descendencia F1 y someterlo a análisis PCR para determinar los genotipos adultos F1 (Ent2/+).
    3. Genera descendencia F2 mediante cruces simples entre moscas Bc/CyO . Selecciona adultos individuos F2 y genotipézalos para identificar moscas con el genotipo Ent2/CyO .
    4. Moscas Intercross F3 (Ent2/CyO) para evaluar la presencia de mutantes homocigotos. Si no se recuperan moscas homocigotas, se cruzan moscas Ent2/CyO durante una generación adicional para determinar si el genotipo homocigoto es letal.
  2. Extracción de ADN genómico de Drosophila
    1. Recoge una o dos moscas adultas en un tubo EP de 1,5 mL y añade 110 μL de Plant DNA Extracter Buffer PA.
    2. Homogeneiza bien las muestras usando un triturador de tejido durante al menos 3 minutos.
    3. Incuba los homogenados en un baño metálico a 65 °C durante no menos de 30 minutos.
    4. Añade 100 μL de cloroformo, invierte suavemente la mezcla para mezclar y haz un vórtice durante 10 segundos. Centrifuga las muestras a 14.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    5. Transfiere cuidadosamente aproximadamente 65 μL (o más) del sobrenadante a un nuevo tubo, añade dos volúmenes de etanol absoluto preenfriado (preincubado a 4 °C durante al menos 10 minutos), invierte suavemente para mezclar y incuba a -20 °C durante al menos 15 minutos.
    6. Centrifugar muestras a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C y descartar cuidadosamente el sobrenadante.
    7. Seca al aire la pelota de ADN a temperatura ambiente o en una incubadora hasta que esté completamente seca, y luego vuelve a suspenderla en un volumen adecuado de tampón de PB. Para muestras hembras (f), añadir 50 μL de tampón PB, mientras que para muestras macho (m), añadir 15 μL.
  3. Amplificación por PCR y secuenciación Sanger
    1. Realizar amplificación por PCR utilizando cebadores específicos diseñados para flanquear las regiones aguas arriba y aguas abajo del sitio objetivo del gRNA.
    2. Purifica los productos de PCR y sometelos a la secuenciación de Sanger. Analizar los cromatogramas de secuenciación usando el softwareSnapGene 34 y alinear con la secuencia de referencia wild-type para análisis comparativo.
    3. Examina los gráficos de picos cerca del sitio objetivo del gRNA para detectar picos superpuestos indicativos de mutaciones indeles. Realizar la división de picos para resolver señales mixtas y confirmar el tipo de mutación, incluyendo inserciones o deleciones en el sitio objetivo.
    4. Retrocruzamiento con machos Bc/CyO durante 4 generaciones para establecer Ent2/CyO.
      Nota: Se ha observado que Ent2*/Ent2* y CyO/CyO son letales en las primeras etapas del desarrollo; por lo tanto, se mantienen los heterocigotos Ent2*/CyO .
  4. Tras establecer los heterocigotos Ent2*/CyO , recoge muestras del mismo lote de heterocigotos Ent2*/CyO bajo un estereomicroscopio.
  5. Selecciona al azar 20 moscas adultas y pésalas usando una balanza de precisión con una resolución de 0,001 g. Fotografía las muestras para documentar las características fenotípicas.

6. Caracterización fenotípica descriptiva

  1. Los 120 machos y 120 hembras de la parte trasera (probaron tres viales para cada grupo, con cada frasco conteniendo 20 moscas) de Ent2*/CyO y w1118 a 22 °C y 25 °C.
  2. Registra el número de muertes semanalmente y traza las curvas de supervivencia.
  3. Establecer 30 parejas de apareamiento aleatorias por grupo; permitir un apareamiento de 24 horas;
  4. Transferir adultos a tubos nuevos; descendencia posterior.
  5. A los 7 días de la eclosión, evaluar el éxito de la escalada (≥8 cm en 30 s) con seis réplicas por grupo.
  6. Todas las observaciones se registraron como características descriptivas de la línea mutante y no se utilizaron para inferir la función génica.

7. Medir las actividades enzimáticas antioxidantes

  1. Recoger 300 machos y 300 hembras adultos (analizaron tres viales para cada grupo, con cada vial conteniendo 100 moscas), Ent2*/CyO y W1118 moscas control a los 5 días tras la eclosión, para asegurar la madurez fisiológica y la edad comparable.
  2. Transfiere las moscas a tubos vacíos sin comida y muérete de hambre durante 2 horas para estandarizar el estado metabólico antes de los ensayos bioquímicos.
  3. Añade una cuenta/tubo de acero; homogeneizar a 60 Hz, 2 minutos.
  4. Centrífuga 4 °C, 161 x g, 10 min; Recoge el sobrenadante.
  5. Mide la superóxida total dismutasa (SOD, véase la Tabla de Materiales para más detalles) y la catalasa (CAT, véase la Tabla de Materiales para más detalles) según las instrucciones del kit.

8. Estadísticas y análisis de datos

  1. Expresa todos los datos como media ± error estándar de la media (figure-protocol-1± SEM).
  2. Utilizar ANOVA unidireccional para comparar datos de actividad enzimática; Aplica ANOVA de tres vías (factores: genotipo, temperatura, sexo) para medir el peso corporal, la capacidad de escalada y la longitud corporal. Realizar la prueba HSD de Tukey a posteriori cuando sea apropiado35.
  3. Define la significación como P < 0,05 para todas las pruebas estadísticas.
  4. Analizar los datos de esperanza de vida utilizando curvas de supervivencia y realizar la prueba log-rank (Mantel-Cox), que evalúa si existen diferencias significativas en las trayectorias de supervivencia entre las cohortesexperimentales 36.
  5. Realizar todos los análisis y gráficos en el software GraphPad Prism 9.5.0 siguiendo las directricesdel software 37.
  6. Todos los análisis estadísticos se realizaron únicamente para la comparación descriptiva y no para establecer relaciones causales.

Resultados

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Diseño y análisis de verificación de eficacia de los sitios de dirección génica Ent2
Los sitios objetivo candidatos para el gen Ent2 fueron diseñados utilizando plataformas CHOPCHOP y CCTop (Figura 1). Se seleccionaron dos gRNAs dirigidos a las regiones del exón 2 y del éxón 5 en función de criterios de especificidad y eficiencia. Para verificar la edición genómica exitosa, se amplificó el ADN genómico de individuos seleccionados aleatoriamente de la línea Ent2*/CyO establecida y sometido a secuenciación Sanger. Los cromatogramas de secuenciación mostraron picos superpuestos que comenzaban cerca del sitio objetivo, consistentes con mutaciones de inserción/deleción (indel). Un análisis de secuencias adicional reveló mutaciones de desplazamiento de marco que conducen a codones de parada prematuros (Figura 2). Estos resultados confirman que el sistema CRISPR/Cas9 introdujo con éxito mutaciones en el locus Ent2 objetivo y demuestran la viabilidad del flujo de trabajo de edición genómica.

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Figura 1. El diagrama esquemático del sitio de eliminación del gen Ent2 y la ubicación del cebador de detección en el genoma. Este esquema ilustra la estructura genómica del locus Ent2, destacando el CDS (verde), los codones de inicio y parada (rojo), el motivo del PAM del gRNA (gris), la secuencia objetivo del gRNA (azul) y la secuencia del cebador de amplificación del gRNA (amarillo). Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2. El gráfico máximo de secuenciación resulta de la descendencia de Drosophila de Ent2*/CyO de línea estable y autoendogámica. Cromatografía de secuenciación que confirma el genotipo de descendencia obtenida al autocruzar la línea heterocigota estable Ent2*/CyO. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Observaciones morfológicas descriptivas de la línea Ent2/CyO
Observamos diferencias en la forma corporal entre los dos genotipos de moscas de la fruta entre sexos bajo condiciones de 22 °C y 25 °C utilizando un estereomicroscopio (Figura 3). En ambas condiciones de temperatura, tanto machos como hembras mostraban una forma corporal típica de "huso largo". Los abdomenes de las hembras eran anchos y en forma de huso, con las puntas de las alas que se extendían ligeramente más allá de la punta abdominal. La unión tórax-abdomen en los machos estaba claramente definida, y la pigmentación oscurecida en el extremo del abdomen —una característica distintiva de los machos— era visible. Las alas de las moscas W1118 de ambos sexos eran transparentes con venas claramente definidas, y no se observó curvatura en el borde de las alas ni rotura de venas. En contraste, los heterocigotos Ent2*/CyO mostraron una flexión notable de la base del ala y curvatura del borde del ala. A 22 °C, independientemente del sexo, la longitud corporal de las moscas de la fruta era significativamente mayor que la del mismo genotipo, que alcanzaba 25 °C. Además, la longitud corporal de las hembras era significativamente mayor que la de los machos a la misma temperatura. Además, a 22 °C y 25 °C, el tamaño corporal de los heterocigotos Ent2*/CyO era menor que el de las moscas correspondientes w1118 . Para investigar la base morfológica, medimos simultáneamente la longitud corporal de las moscas (Figura 3E, Tabla 1). Una ANOVA triple reveló efectos principales significativos del genotipo (F(1,16)=230,1, P<0,0001), temperatura (F(1,16)=19,50, P=0,0004) y sexo (F(1,16)=166,9, P<0,0001). También se observaron una interacción significativa entre genotipo y sexo (F(1,16)=14,96, P=0,0014) y una interacción significativa entre genotipo x temperatura x sexo (F(1,16)=6,231, P=0,0239).

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Figura 3. La morfología de control de adultos W1118 y Ent2*/CyO . Imágenes representativas que muestran características de postura de Drosophila femenina (A, C) y masculina (B, D) a 22 °C y 25 °C, junto con comparación cuantitativa de la longitud corporal (E). ** P < 0,01. Barra de escala: 1 mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Análisis de supervivencia bajo diferentes condiciones de temperatura
Analizamos estadísticamente las curvas de supervivencia de heterocigotos Ent2*/CyO y de lasmoscas W 1118 a 22 °C y 25 °C (Figura 4). Los resultados mostraron que la curva de supervivencia de las hembras heterocigotas Ent2*/CyO fue la más alta, con dos individuos aún vivos a la semana 14. Todas las 1118 mujeres murieron antes de la semana 14. Todos los hombres heterocigotos Ent2*/CyO murieron a la semana 12, mientras que todos loshombres con 1118 hombres murieron a la semana 11. Estos hallazgos indican que, a 22 °C, la esperanza de vida total de las hembras es mayor que la de los machos, y dentro del mismo sexo, la capacidad de supervivencia de los heterocigotos Ent2*/CyO es ligeramente mayor que la del tipo w1118.

Bajo condiciones de 25 °C, el periodo de supervivencia global se acortó significativamente. Las curvas de supervivencia de W1118 hembras y machos heterocigotos Ent2*/CyO bajaron a cero en la décima semana. Las curvas de supervivencia de las hembras heterocigotas Ent2*/CyO y delos machos de W 1118 disminuyeron a 1–2 individuos en la octava semana y alcanzaron cero en la novena semana. La diferencia entre el mutante y elw 1118 no fue estadísticamente significativa (P > 0,05). Estas observaciones describen las características de supervivencia de la línea mutante bajo diferentes condiciones ambientales.

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Figura 4. Curvas de supervivencia de Drosophila bajo diferentes condiciones de temperatura. Análisis de supervivencia comparando la esperanza de vida de moscas Ent2*/CyO y w1118 a 22 °C y 25 °C. n=3. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Evaluación de la actividad locomotora
Se compararon las capacidades de escalada de las moscas de la fruta w1118 y Ent2*/CyO bajo dos condiciones de temperatura: 22 °C y 25 °C (Figura 5, Tabla 2). Los resultados muestran que a 22 °C (Figura 5A), el 98,15% de las mujeresde W 1118 lograron escalar con éxito más de 8 cm en 30 s, mientras que esta proporción descendió al 89,74% en mujeres heterocigotas Ent2*/CyO (P < 0,05). Todos los hombres de 1118 hombres pudieron escalar más de 8 cm, mientras que la tasa de éxito en la escalada en machos heterocigotos Ent2*/CyO fue del 98,14% (P < 0,05). A 25 °C (Figura 5B), todas las1118 hembras (100%) subieron más de 8 cm en 30 s, pero esta proporción disminuyó al 91,31% en hembras heterocigotas Ent2*/CyO (P < 0,05). Entre loshombres de W 1118, el 77,28% logró escalar con éxito más de 8 cm (P < 0,01), mientras que solo el 63,57% de los hombres heterocigotos Ent2*/CyO lo lograron (P < 0,01). Para evaluar más a fondo el rendimiento locomotor, se analizó la proporción de moscas que suben más de 15 cm (Figura 5C). Una ANOVA de tres vías reveló efectos principales altamente significativos del sexo (F(1,16) = 201,7, P < 0,0001) y la temperatura de crianza (F(1,16) = 72,60, P < 0,0001) sobre el rendimiento en la escalada. Sin embargo, el efecto principal del genotipo no fue significativo (F(1,16) = 0,59, P = 0,4545). Estos resultados indican que el rendimiento locomotor varía según las condiciones experimentales y puede variar entre grupos de manera dependiente del contexto.

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Figura 5. Comparación de la capacidad de escalada de Drosophila a diferentes temperaturas. Cuantificación del rendimiento de escalada a 22 °C (A) y 25 °C (B) y estadísticas para individuos con distancia de escalada > 15 cm (C). ** P < 0,01. n=3. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Medición del peso corporal
El peso corporal se midió en moscas de la fruta heterocigotas W1118 y Ent2*/CyO a 22 °C y 25 °C (Figura 6). Nuestros resultados muestran que, en comparación con W 1118 moscas, el peso de los heterocigotos Ent2*/CyO se redujo significativamente tanto a 22 °C como a 25 °C (P < 0,05 o P < 0,01). Observamos que el peso de los machos dew1118 moscas era significativamente menor que el de las hembrasw 1118 moscas (P < 0,01). De manera similar, el peso de los heterocigotos masculinos Ent2*/CyO fue significativamente menor que el de las heterocigotas Ent2*/CyO femeninas (P < 0,01). Realizamos una ANOVA triple para evaluar los efectos independientes e interactivos del genotipo, la temperatura de cría y el sexo sobre el peso corporal en Drosophila. El análisis mostró efectos principales significativos del genotipo (F(1,16) = 32,38, P < 0,0001), temperatura (F(1,16) = 23,31, P = 0,0002) y sexo (F(1,16) = 25,52, P = 0,0001) (Figura 6; Tabla 3). Además, hubo una interacción bidireccional significativa entre temperatura y sexo (F(1,16) = 24,76, P = 0,0001), lo que indica que el efecto de la temperatura sobre el peso corporal difería según el sexo. Sin embargo, no se encontraron interacciones significativas entre genotipo y temperatura (F(1,16) = 0,40, P = 0,538), genotipo y sexo (F(1,16) = 1,31, P = 0,269), ni la interacción triple (genotipo x temperatura x sexo: F(1,16) = 0,48, P = 0,497), lo que sugiere que la respuesta de los mutantes Ent2*/CyO a la temperatura y el sexo fue similar a la del tipo salvaje.

Dada la significativa temperatura × interacción sexual, realizamos un análisis de efectos sencillo para aclarar su patrón específico. Los resultados mostraron que, en las hembras de mosca, los individuos criados a 22 °C tenían un peso corporal significativamente mayor que los criados a 25 °C (P = 0,00¹²); sin embargo, en los machos no hubo diferencias significativas en el peso corporal entre ambas temperaturas (P > 0,9999). Esto indica que bajar la temperatura de 25 a 22 °C aumentó específicamente el peso corporal de las moscas hembras, sin tener un efecto significativo en los machos.

Aunque no hubo interacciones significativas entre el genotipo y otros factores, el fuerte efecto principal del genotipo indicó que los mutantes Ent2*/CyO tenían generalmente un peso corporal menor en todas las condiciones en comparación con el tipo salvaje. Las comparaciones a posteriori revelaron además que, a 22 °C, las hembras de tipo salvaje (w1118:22 °C Hembras) tenían un peso corporal significativamente mayor que todos los grupos mutantes (P < 0,0001), y dentro de la misma temperatura, ambos genotipos mostraron un dimorfismo sexual significativo (hembras > machos, P < 0,01). A 25 °C, la diferencia de peso corporal entre el tipo salvaje y los mutantes mostró una tendencia similar, pero no alcanzó significación estadística. Estos hallazgos describen las características del peso corporal de la línea mutante bajo diferentes condiciones ambientales y biológicas.

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Figura 6. La comparación del peso corporal en Drosophila a diferentes temperaturas. Medidas de peso corporal a 22 °C y 25 °C. ns P > 0,05, * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Actividad enzimática antioxidante
Se compararon las actividades enzimáticas antioxidantes de W1118 y Ent2*/CyO heterocigotas Drosophila a 25 °C (Figura 7). Nuestros resultados mostraron que, en comparación con wmoscas 1118, tanto machos como hembras de heterocigotos Ent2*/CyO mostraron una reducción significativa de las actividades de catalasa (CAT) y superóxido dismutasa (SOD) (P < 0,01). También encontramos que las actividades de CAT y SOD en el W1118 machos fueron significativamente mayores que en el W1118 hembras (P < 0,05 o P < 0,01). De manera similar, las actividades enzimáticas antioxidantes en hombres heterocigotos Ent2*/CyO fueron significativamente mayores que en mujeres heterocigotas Ent2*/CyO (P < 0,01).

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Figura 7. La comparación de la capacidad antioxidante de Drosophila a la temperatura óptima de alimentación. Ensayos de actividad enzimática que muestran la actividad CAT (A) y SOD (B) en moscas Ent2/CyO en comparación con W1118 moscas. * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

SSDFMSF (DFn, DFd)Valor P
Genotipo0.802610.8026F (1, 16) = 230,1P<0.0001
Temperatura0.0680310.06803F (1, 16) = 19,50P=0,0004
Género0.582210.5822F (1, 16) = 166,9P<0.0001
Genotipo x Temperatura0.00579810.005798F (1, 16) = 1,662P=0,2156
Genotipo x Género0.0521810.05218F (1, 16) = 14,96P=0.0014
Temperatura x Género0.0132310.01323F (1, 16) = 3,793P=0,0692
Genotipo x Temperatura x Género0.0217310.02173F (1, 16) = 6,231P=0,0239
Residual0.05581160.003488

Tabla 1: Análisis de varianzas de las mediciones de longitud corporal en Drosophila.

Tabla ANOVASSDFMSF (DFn, DFd)Valor P
Género0.148310.1483F (1, 16) = 201,7P<0.0001
Genotipo0.000431910.0004319F (1, 16) = 0,5877P=0,4545
Temperatura0.0533610.05336F (1, 16) = 72,60P<0.0001
Género x Genotipo0.0141810.01418F (1, 16) = 19,30P=0.0005
Género x Temperatura0.00713410.007134F (1, 16) = 9,708P=0.0067
Genotipo x Temperatura0.013510.0135F (1, 16) = 18,37P=0,0006
Género x Genotipo x Temperatura0.00590310.005903F (1, 16) = 8,032P=0,0120
Residual0.01176160.0007349

Tabla 2: Análisis de varianza de la capacidad de trepar (> 15 cm) en Drosophila.

SSDFMSF (DFn, DFd)Valor P
Genotipo4.363E-0714.363E-07F (1, 16) = 32,38P<0.0001
Temperatura3.141E-0713.141E-07F (1, 16) = 23,31P=0,0002
Género3.439E-0713.439E-07F (1, 16) = 25,52P=0,0001
Genotipo x Temperatura5.333E-0915.333E-09F (1, 16) = 0,3958P=0,5381
Genotipo x Género1.765E-0811.765E-08F (1, 16) = 1,310P=0,2692
Temperatura x Género3.336E-0713.336E-07F (1, 16) = 24,76P=0,0001
Genotipo x Temperatura x Género6.513E-0916.513E-09F (1, 16) = 0,4834P=0,4968
Residual2.156E-07161.347E-08

Tabla 3: Análisis de varianza de las mediciones de peso corporal en Drosophila.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El otorrinolaringólogo es una proteína conservada evolutivamente que influye en múltiples procesos biológicos38. Cuando se expresa en ovocitos de Xenopus laevis, Ent2 muestra actividad de transporte denucleósidos 8. Los estudios han demostrado que el mutante homocigoto de Ent2 es letal durante la fase larval tardía o en lafase pupal temprana 10. En el presente estudio, se estableció un flujo de trabajo de edición genómica basado en CRISPR/Cas9 para generar alelos dirigidos a Ent2 en Drosophila melanogaster. La letalidad observada de mutantes homocigotos durante el establecimiento de la cepa es coherente con estos informes previos, lo que respalda la validez de la estrategia de edición genómica. Dentro de este marco, la línea heterocigota Ent2*/CyO generada en este estudio proporciona un modelo para documentar características fenotípicas asociadas a la pérdida parcial de Ent2. Bajo las condiciones experimentales probadas, se observaron diferencias en el tamaño corporal, peso corporal, actividad locomotora y niveles de enzimas antioxidantes entre las moscas Ent2*/CyO y w1118 . Estas observaciones describen el perfil fenotípico de la línea mutante establecida.

En cuanto a desarrollo y tamaño corporal, los individuos heterocigotos Ent2*/CyO fueron significativamente más pequeños que los deW 1118 moscas, a 22 °C y 25 °C. Esta diferencia puede atribuirse a una reducción en la eficiencia del transporte de nucleósidos resultante de la ausencia del gen Ent2, lo que a su vez afecta la estabilidad del metabolismo energético y la regulación de la ecdisona. Además, los efectos negativos se hicieron más pronunciados a partir de 25 °C. Las investigaciones han indicado que la esperanza de vida animal está influida por la tasa metabólica, un concepto conocido como la teoría de la tasametabólica 19. Los hallazgos de este estudio sugieren que la tasa metabólica elevada de las moscas de la fruta a temperaturas más altas puede estar estrechamente relacionada con las deficiencias nutricionales y los retrasos en el desarrollo derivados de un metabolismo de nucleósidos deteriorado. Sin embargo, dado el uso de un único alelo derivado de CRISPR, estos hallazgos deben interpretarse como observaciones descriptivas más que como evidencia directa de la función génica.

También se observó variación dependiente de la temperatura en múltiples lecturas fenotípicas. El mutante muestra una extensión de vida modesta a 22 °C, especialmente en hembras, un hallazgo coherente con estudiosprevios 39,40. En cambio, a 25 °C, la diferencia en la esperanza de vida disminuye o incluso desaparece. Como organismos poiquilotérmicos, las moscas de la fruta presentan una tasa metabólica más alta y, en consecuencia, una vida útil más corta a temperaturaselevadas 41,42, lo que coincide con los hallazgos de este estudio. En este contexto, los patrones observados pueden reflejar respuestas fisiológicas generales a la temperatura.

El rendimiento locomotor y las actividades enzimáticas antioxidantes también variaron entre genotipos, sexos y condiciones de temperatura. Se observaron un rendimiento de escalada reducido y menores actividades de SOD y CAT en moscas Ent2/CyO bajo ciertas condiciones. Estudios previos han vinculado los transportadores de nucleósidos con el metabolismo de NAD⁺, la función mitocondrial y la regulación del estrésoxidativo 17,43,44,45,46,47. Aunque estos informes proporcionan un posible contexto biológico, los datos actuales se limitan a la caracterización fenotípica y no establecen vínculos mecanicistas entre Ent2 y estas vías.

Nuestros resultados también muestran que, en las mismas condiciones, los machos de la mosca de la fruta suelen mostrar una mayor actividad enzimática antioxidante que las hembras39,48. Esto significa que los factores relacionados con el género pueden regular la respuesta antioxidante a través de diferentes vías de señalización. Los factores de transcripción relacionados con las respuestas antioxidantes, como Nrf2/CncC y sus genes diana posteriores, muestran diferencias de expresión entre distintos géneros, afectando así la capacidad antioxidantetotal 49. Esta observación es coherente con los informes de diferencias sexuales en la resistencia al estrés oxidativo y las defensas antioxidantes en Drosophila, donde las hembras suelen mantener niveles bajos de ROS y mayores actividades enzimáticas antioxidantes basales en comparación con los machos, lo que puede contribuir a diferencias en la resistencia al estrés y la longevidad entre lossexos. Estas observaciones subrayan aún más la importancia de considerar variables biológicas como el sexo al caracterizar los fenotipos mutantes.

Desde una perspectiva metodológica, este estudio describe un flujo de trabajo reproducible para generar y validar mutaciones mediadas por CRISPR/Cas9 en Drosophila. El diseño y la selección precisos del gRNA son esenciales, ya que los gRNAs efectivos determinan la eficiencia de la clivación dirigida por Cas9 y minimizan modificaciones nointencionadas 21,51. La microinyección de alta precisión de componentes de Cas9 y gRNA en embriones también es crucial, ya que las inyecciones ineficientes pueden conducir a bajas tasas de edición o mosaicismo52. Una confirmación exhaustiva del genotipo mediante secuenciación garantiza que las ediciones previstas estén presentes y excluye las ediciones fuera del objetivo o incompletas, fortaleciendo así la integridad del modelo53. Cabe destacar que el uso del cromosoma balanceador CyO fue esencial para mantener el alelo mutante Ent2 debido a la letalidad de los mutantes homocigotos. Este enfoque se utiliza ampliamente en genética de Drosophila para preservar mutaciones perjudiciales y permitir análisis posteriores. El presente estudio demuestra la aplicación práctica de esta estrategia dentro de un marco de edición CRISPR/Cas9.

Deben reconocerse varias limitaciones. En primer lugar, se realizaron análisis fenotípicos utilizando una única línea mutante derivada de CRISPR. Es bien reconocido que la edición CRISPR/Cas9 puede generar alelos heterogéneos, y generalmente se recomienda el análisis de múltiples líneas independientes para fortalecer las conclusiones genéticas. Por lo tanto, los hallazgos aquí reportados deben interpretarse como caracterización preliminar de un alelo mutante. Serán necesarios futuros estudios que incorporen alelos Ent2 generados de forma independiente adicionales para mejorar la robustez de las conclusiones. Segundo, la línea mutante se mantuvo usando el cromosoma balanceador CyO, mientras que el grupo control (w1118) no lleva un cromosoma balanceador. Como los propios cromosomas balanceadores pueden influir en rasgos del desarrollo y fisiológicos, la falta de un control compatible con el balancer representa una posible fuente de confusión. Esta limitación debe tenerse en cuenta al interpretar diferencias fenotípicas entre genotipos. En tercer lugar, las condiciones ambientales como la humedad, el ciclo de luz y la dieta se mantuvieron bajo entornos estándar de laboratorio, pero no se variaron sistemáticamente. Como estos factores pueden influir en el metabolismo y las respuestas al estrés, futuros estudios que incorporen gradientes ambientales controlados proporcionarían una evaluación más completa de las interacciones fenotipo-ambiente.

En resumen, este estudio establece un flujo de trabajo basado en CRISPR/Cas9 para generar y mantener alelos mutantes Ent2 en Drosophila melanogaster y proporciona una caracterización descriptiva de la línea heterocigota resultante bajo diferentes condiciones ambientales. Los resultados ponen de manifiesto la aplicabilidad de este enfoque para estudiar genes con fenotipos letales y subrayan la importancia de las consideraciones del diseño experimental, incluyendo el fondo genético, los cromosomas equilibradores y las variables ambientales.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apoyar esta investigación del Programa de Desarrollo Científico y Tecnológico de la provincia de Jilin (Proyecto nº 20230505044ZP).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ammonium acetateSigma A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (Visible Light Method) (Ammonium Molybdate Method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Dodecyl sulfateSigmaL3771
Injection deviceEppendorf FemtoJet 4i
Linearized plasmid: MLM3613Addgene42251
MicroscopeOLYMPUS CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kitThermo FisherAM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitThermo FisherAM1344
PmeI restriction enzymeNEB R0560S
Poly(A) polymeraseNEBM0276S
Protease KThermo FisherEO0491
RNeasy Mini KitQIAGEN74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production SystemPromega P1320
T7 RiboMAX KitPromega P1320
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) assay kit (Hydroxylamine method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-1
w1118 Drosophila Fangjing Biology
Water-saturated phenol/chloroformSigmaP2069

Referencias

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