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Artículo de método

Establecimiento de organoides tumorales, fibroblastos asociados al carcinoma y fibroblastos equivalentes del mismo paciente con cáncer de esófago

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DOI:

10.3791/69548

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3 de abril de 2026

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1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método para aislar simultáneamente organoides cancerosos, fibroblastos asociados al carcinoma (CAFs) y fibroblastos (CF) no asociados al tumor del mismo paciente con carcinoma escamoso esofágico (ESCC). El uso de estos materiales compatibles con pacientes podría evitar problemas derivados de la variabilidad entre pacientes y proporcionar una plataforma experimental adecuada para la investigación en ESCC.

Resumen

En el carcinoma escamoso esofágico (ESCC), la adquisición de resistencia al tratamiento y la recurrencia tumoral siguen siendo grandes desafíos clínicos. Se sabe que los fibroblastos asociados al carcinoma (CAF), componentes clave del microambiente tumoral, influyen en la progresión de la CCE y la respuesta terapéutica. Sin embargo, muchos aspectos del papel de los CAF en la malignidad tumoral siguen siendo desconocidos, presumiblemente debido a la variabilidad entre pacientes en pacientes con CCE. Se cree que varias líneas celulares de ESCC humanas disponibles para la investigación imitan parcialmente la naturaleza del carcinoma humano. También se propagan in vitro durante años y décadas en una placa de Petri, lo que resulta en una adaptación a las condiciones de cultivo. Además, las líneas celulares humanas de ESCC presentan diversas alteraciones genéticas y epigenéticas distintas entre los pacientes originales, lo que resulta en variabilidad entre pacientes. No obstante, líneas celulares cancerosas cultivadas a largo plazo se han empleado en la mayoría de los estudios previos para experimentar con CAFs desajustados entre pacientes. La variabilidad entre pacientes dentro de cada línea celular cancerosa y entre células cancerosas y CAF podría por tanto causar una reducción de la reproducibilidad y fiabilidad de los resultados. Para eliminar la variabilidad entre pacientes, se aislaron tres tipos celulares distintos del mismo paciente: organoides cancerosos y CAFs de una región de ESCC diseccionada quirúrgicamente, y fibroblastos (FQ) equivalentes de una región no tumoral adyacente como controles específicos para los CAFs. Se presenta un protocolo detallado que permite el aislamiento simultáneo de organoides cancerosos, CAFs y FQ. Los organoides cancerosos crecieron bien bajo condiciones tridimensionales. Los CAF y las FQ se coloraron positivamente para vimentina, uno de los marcadores de fibroblastos, apoyando el enriquecimiento de estas células en linajes fibroblásticos. El protocolo descrito nos permite establecer organoides ESCC y fibroblastos compatibles con el paciente, proporcionando una valiosa plataforma experimental que excluye la variabilidad entre pacientes en el estudio de las interacciones tumor-estromal.

Introducción

El cáncer de esófago se asocia con altas tasas de incidencia y mortalidad en todoel mundo. Se clasifica ampliamente en dos subtipos histológicos principales: carcinoma escamoso esofágico (ESCC) y adenocarcinoma esofágico (EAC)2. El CCES es más prevalente que el EAC, con una incidencia particularmente mayor en Asia Oriental yÁfrica 3. Las estrategias de tratamiento para la CCES están relativamente bienestablecidas 4,5. Para lesiones en estadio temprano confinadas a la capa mucosa, la resección endoscópica se indica como una opción curativa y mínimamente invasiva. En pacientes con enfermedad localmente avanzada pero resecable, la combinación de quimiorradioterapia neoadyuvante seguida de esofagectomía ha demostrado eficacia clínica. En casos irresecables o metastásicos, la quimioterapia sistémica sigue siendo la base del tratamiento. No obstante, la resistencia terapéutica y la recurrencia de la enfermedad siguen suponiendo grandes desafíos clínicos.

Los tumores no solo consisten en células cancerosas, sino también en un microambiente tumoral complejo que comprende varios tipos de células estromales. Entre ellos, los fibroblastos asociados al carcinoma (CAFs), componentes celulares principales del microambiente tumoral, han demostrado desempeñar un papel crítico en la progresión tumoral y la respuestaterapéutica 6,7,8,9. En el ESCC, la implicación de los CAF en la malignidad tumoral y la resistencia al tratamiento también ha sido cada vez másinformada. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos de los CAF subyacentes a la malignidad de la CCE siguen siendo en gran medida desconocidos.

En la mayoría de los estudios previos, los efectos de las CAF sobre las células cancerosas se evaluaron utilizando diversas líneas celulares de ESCC propagadas en placas de Petri durante muchos años, o incluso décadas. Dichas líneas celulares se adaptarían a las condiciones del cultivo y apenas se parecerían a los tumoresoriginales 13. Además, las líneas celulares de ESCC se derivan de diferentes pacientes y presentan diversas alteraciones genéticas y epigenéticas, que son evidentemente distintas en las respectivas células ESCC, actuando como variaciones entre pacientes. Los resultados experimentales de una línea celular cancerosa pueden ser a menudo inconsistentes con los de otra línea celular cancerosa. Por lo tanto, los experimentos que emplean diferentes líneas celulares de ESCC y los CAFs desajustados por paciente pueden resultar difíciles para abordar con precisión las interacciones de estas células de manera reproducible y fiable.

Para abordar estas limitaciones, se ha desarrollado un protocolo para aislar simultáneamente organoides tumorales compatibles con el paciente, CAFs y fibroblastos (FQ) no tumorales a partir de la misma muestra quirúrgica de ESCC. Los organoides derivados del paciente generalmente recapitulan características arquitectónicas y fenotípicas clave de los tumores primarios, preservando la heterogeneidad molecular. Los organoides establecidos formaron esferoides bajo condiciones de cultivo tridimensional (3D) y mostraron una capacidad proliferativa estable. Se confirmó que tanto los CAF como los FQ estaban enriquecidos para poblaciones de células fibroblásticas positivas para vimentina, un marcador fibroblasto.

Este protocolo proporciona pasos detallados y reproducibles para el procesamiento de tejidos, disociación enzimática, siembra de organoides, aislamiento de CAF/CF, paso y criopreservación. Para ayudar a los investigadores a evaluar la aplicabilidad antes de la implementación, se ha incluido información práctica: los organoides suelen formarse en 3–5 días, alcanzar la preparación para el paso en 7–10 días y pueden expandirse de forma estable durante más de diez pasajes. Los CAF y CF pueden ser transitados durante al menos ocho generaciones. Los organoides y fibroblastos pueden ser criopreservados en aproximadamente 20 días. Las tasas de éxito de los establecimientos alcanzan aproximadamente el 70% para organoides y el 80% para CAF y CFs. Además, se incluye un ensayo validado de medio condicionado utilizando medio condicionado por CAF o FQ, proporcionando un enfoque sólido para evaluar los efectos paracrinos de las células estromales en el comportamiento organoide tumoral. En conjunto, esta plataforma organoide–estroma tumoral emparejada ofrece un modelo experimentalmente accesible y biológicamente relevante para investigar las interacciones tumor-estroma de la ESCC y apoyar el desarrollo de estrategias terapéuticas de precisión.

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Protocolo

Todos los procedimientos que involucren tejido humano deben realizarse bajo las aprobaciones institucionales adecuadas de bioseguridad y en un gabinete certificado de seguridad biológica. El paciente proporcionó su consentimiento informado por escrito y el proyecto fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad Juntendo. Una visión general del procedimiento desde los protocolos 2 hasta el 6 se muestra en la Figura 1. La composición y concentraciones de cada componente en el medio organoide (Eso_v1) de la ESCC se determinaron basándose en Kijima et al.14 y otros estudios 15,16,17, con solo modificaciones menores. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Reactivos y preparación de tejidos

  1. Prepara reactivos y equipos.
    1. Esteriliza todos los instrumentos, incluidas tijeras, pinzas y pipetas, antes de comenzar el procedimiento.
    2. Prepare 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un tubo de 15 mL.
    3. Prepara tubos de baja unión de 15 mL y etiquetúralos según el origen de la muestra (por ejemplo, Tubo de Lavado Tumoral (A), Tubo de Digestión Tumoral (B), Tubo de Lavado No Tumoral (C), Tubo de Digestión No Tumoral (D)).
    4. Recubre las pipetas de trabajo aspirando y dispensando suero bovino fetal (FBS) 2–3 veces para reducir la adhesión celular durante el procesamiento.
      NOTA: El recubrimiento FBS evita que los fragmentos de tejido se adhieran a superficies plásticas durante la disociación mecánica.
  2. Prepara soluciones enzimáticas
    1. Preparar la Solución Enzimática I para la digestión tumoral mezclando 2,7 mL de Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco con 10% de FBS y 1x penicilina–estreptomicina (PS) (en adelante, DMEM/10% FBS), 0,3 mL de colagenonasa de 10 mg/mL, 0,15 mL de dispase de 10.000 PU/mL y 0,03 mL de 2,5 μg/mL de anfotericina B. Calienta a 37 °C.
    2. Prepara la Solución Enzimática II para la digestión no tumoral mezclando 2,7 mL de DMEM/10% FBS, 0,3 mL de 1 mg/mL de colagénasa y 0,03 mL de 2,5 μg/mL de Anfotericina B. Calienta a 37 °C.
      NOTA: La colagénasa y la dispasa facilitan la disociación del tejido tumoral.
  3. Preparar el medio de cultivo organoide
    1. Preparar un medio organoide ESCC (medio Eso_v1) que contenga 60% de medio basal organoide, 40% de medio condicionadoL-WRN 18 (véase paso 1.4), 50 ng/mL de EGF (factor de crecimiento), 1 mM de N-acetil-L-cisteína (antioxidante), 5 mM de nicotinamida (vitamina hidrosoluble), 500 nM A83-01 (inhibidor de TGF-βR (que previene el crecimiento de fibroblastos)), 1x B-27 (suplemento de cultivo sin suero), 1x N-2 (suplemento de cultivo sin suero) y 10 μM Y-27632 (inhibidor de ROCK).
    2. Equilibra el medio a 37 °C antes de usarlo.
      NOTA: El medio condicionado por L-WRN (Sobrenadante de células L-WRN) proporciona señales de WNT, R-spondin y Noggin esenciales para la iniciación de los organoides. Y27632 está contenido en el medio durante todo el periodo cultural.
  4. Prepara un medio acondicionado L-WRN
    1. Descongela un vial de células L-WRN y siembralas en una bandeja de 100 mm con 10 mL de DMEM/10% FBS y cultiva durante 1–2 días.
    2. Sustituye el medio por 10 mL de DMEM/10% FBS que contenga G418 (500 μg/mL final) e Higromicina B (500 μg/mL final), y cultiva hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.
    3. Pasar las células a dos antenas de 100 mm con 10 mL de DMEM/10% FBS (con G418 e Higromicina B) y cultivar hasta que las células alcancen el 100% de confluencia.
    4. Pasar las células a cinco antenas de 150 mm con 20 mL de DMEM/10% FBS (sin antibióticos) por plato y cultivar hasta la confluencia al 100%.
    5. Aspira y descarta el medio de cada plato de 150 mm.
    6. Añade 25 mL por plato de medio de recogida (medio basal organoide complementado con 5% de FBS).
    7. Incuba durante 24 horas.
    8. Recoge el medio de los cinco platos (25 mL × 5 = 125 mL) en una botella de cristal estéril.
    9. Repite los pasos 1.4.6–1.4.8 para un total de 8 colecciones (volumen objetivo agrupado: ~1.000 mL).
    10. Filtra estéril el CM agrupado usando un filtro de botella.
    11. Alícuota de 40 mL en 25 tubos estériles de 50 mL.
    12. Guarda las alícuotas a −80 °C.
  5. Prepara un medio de cultivo de fibroblastos
    1. Prepara el fibroblasto medio-1.
    2. Equilibra el medio a 37 °C antes de usarlo.
  6. Prepara platos para manipular pañuelos
    1. Dispensa varias (tres a cinco) gotas de FBS con una punta P1000 sobre dos platos de 100 mm para crear un recubrimiento (plato T para tejido tumoral, plato N para tejido no tumoral).
      NOTA: El recubrimiento FBS favorece una picada mecánica más suave y evita la adhesión de pequeños fragmentos de tejido a la superficie del plato.
  7. Manejo de tejidos e identificación de muestras
    1. Confirma que las muestras tumorales y no tumorales se transportan sobre hielo.
    2. Coloca los pañuelos en un plato de 60 mm que contenga una pequeña cantidad de DMEM/10% FBS y guárdalos en hielo hasta el uso. Comenzar el procesamiento en un plazo de 16 horas tras la resección quirúrgica para mantener la viabilidad.
    3. Identificar el tejido tumoral por su textura firme y morfología superficial irregular, que difieren de las del tejido no tumoral.

2. Procesamiento de tejidos, lavado y digestión enzimática

NOTA: Este paso se realiza para digerir secciones de tejido tumoral y no tumoral con diferentes soluciones enzimáticas.

  1. Pica el tumor y los tejidos no tumorales
    1. Transfiere cada muestra de tejido (aproximadamente 5 mm × 5 mm) a su respectivo plato recubierto de FBS (plato T para tejido tumoral y plato N para tejido no tumoral).
    2. Tritura cada tejido en fragmentos de ~0,5 mm usando un bisturí estéril.
      NOTA: Los fragmentos más pequeños aumentan la accesibilidad enzimática y mejoran la eficiencia digestiva.
  2. Lava el pañuelo picado.
    1. Recubre una pipeta de 10 mL con FBS para evitar la adherencia del tejido.
    2. Añade 5 mL de PBS a cada plato usando la pipeta recubierta de FBS y vuelve a suspender suavemente el tejido picado.
    3. Transfiere la suspensión al correspondiente Tubo de Lavado Tumoral (Tubo A) o al Tubo de Lavado no Tumoral correspondiente (Tubo C).
    4. Repite los pasos 2.2.2 y 2.2.3 (volumen total: 10 mL).
    5. Deja reposar los tubos 2 minutos a temperatura ambiente; eliminar el sobrenadante dejando aproximadamente entre 0,5 y 1 mL de PBS y tejido en la parte inferior.
    6. Añadir 10 mL de PBS fresca con una pipeta nueva; Después de recubrir la pipeta con FBS, la suspensión se puede hacer con fuerza evitando la formación de burbujas.
      NOTA: El pipeteo forzado ayuda a la disociación mecánica y a la eliminación de sangre y moco. Evitar las burbujas previene la lisis celular inducida por cizalladura. Todos los pasos de lavado están pensados para eliminar los residuos.
    7. Deja reposar los tubos 2 minutos a temperatura ambiente; eliminar el sobrenadante dejando aproximadamente entre 0,5 y 1 mL de PBS y tejido en la parte inferior.
    8. Repite el procedimiento de lavado (pasos 2.2.6 y 2.2.7) dos veces para un total de tres lavados.
  3. Transfiere los tejidos a tubos digestivos.
    1. Añadir 10 mL de PBS fresca con una pipeta nueva; tras recubrir la pipeta con FBS, transfiere el tejido tumoral al Tubo de Digestión Tumoral (Tubo B) y el tejido no tumoral al Tubo de Digestión No Tumoral (Tubo D).
    2. Deja reposar los tubos durante 2 minutos a temperatura ambiente, retira el sobrenadante dejando aproximadamente 0,5 mL de PBS y tejido en el fondo.
  4. Realiza digestión enzimática.
    1. Digestión de tejido tumoral
      1. Añade todo el volumen de la Solución Enzimática I (colanasa + dispasa) en el Tubo de Digestión Tumoral (Tubo B).
      2. Incubar a 37 °C durante 2 horas con una rotación suave.
    2. Digestión de tejido no tumoral
    3. Añade todo el volumen de la Solución Enzimática II (solo colagénasa) en el Tubo de Digestión No Tumoral (Tubo D).
      1. Incubar a 37 °C durante 4 horas con una rotación suave.
    4. Continúa con el paso 3 (procesamiento de muestras tumorales) o el paso 6 (siembra de fibroblastos equivalente), dependiendo del origen de la muestra.
      NOTA: Los tipos de enzimas utilizadas para digerir tejidos tumorales y no tumorales, así como los tiempos de procesamiento, se determinaron en base a optimizaciones experimentales previas. Los tejidos tumorales suelen contener una matriz extracelular densa; La dispasa combinada con colagénasa mejora la capacidad digestiva.

3. Procesamiento de muestras tumorales para organoides y aislamiento de CAF

NOTA: Este paso se realiza para aislar células tumorales epiteliales para la formación de organoides y fibroblastos estromales (CAFs) a partir de las mismas muestras tumorales digeridas.

  1. Filtrar y recoger células derivadas del tumor.
    1. Coloca un colador de celda de 100 μm sobre un tubo cónico de 50 mL.
    2. Prehumedece el colador pasando 3 mL de DMEM/10% FBS a través de él.
      NOTA: La prehumectación reduce la pérdida celular al evitar la adhesión a las fibras de malla secas.
    3. Transfiere todo el contenido del Tubo de Digestión Tumoral (Tubo B) al colador utilizando una punta P1000 recubierta con FBS para eliminar fragmentos de tejido no digeridos.
    4. Añade 6 mL adicionales de DMEM/10% FBS para enjuagar los racimos residuales a través del colador.
    5. Retira el colador y vuelve a colocar el filtrado en el tubo B (también se puede usar un tubo nuevo de baja unión de 15 mL).
  2. Lava y concentra el filtrado.
    1. Centrifuga el tubo a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
    2. Retira el sobrenadante usando una pipeta desechable.
    3. Añade 10 mL de DMEM/10% FBS, mezcla suavemente por inversión y centrifuga de nuevo a 300 × g durante 5 minutos.
    4. Aspira cuidadosamente el sobrenadante mientras retienes el pellet.
    5. Reduce el volumen restante a 40 μL usando una pipeta P200.
  3. Asigna células para organoides y cultivos de CAF.
    1. Asigna 30 μL para la siembra de organoides.
    2. Asigna 10 μL para la siembra de CAF.
      NOTA: Esta proporción proporciona empíricamente poblaciones epiteliales y fibroblastos suficientes para la expansión paralela.

4. Siembra de organoides (cultivo 3D)

NOTA: Este paso se realiza para establecer organoides de la CCE a partir de una suspensión celular derivada de un tumor.

  1. Prepara las cúpulas de la matriz de membrana basal.
    1. Precalienta una placa estándar de 24 pozos a 37 °C.
      NOTA: El precalentamiento de la placa acelera la solidificación de las cúpulas de la matriz de membrana basal.
    2. Mezclar 30 μL de la suspensión derivada del tumor con 90 μL de matriz de membrana basal helada (relación 1:3).
    3. Aplicar 30 μL por cúpula en cuatro pozos.
    4. Deja que las cúpulas se solidifiquen durante 15 minutos en una incubadora de CO₂.
  2. Añadir medio de cultivo organoide
    1. Prepara un medio organoide con suplementos premezclados (FGF10, SB202190 y antibióticos, como 1× Anfotericina B y 100 μg/mL Primocina, si se utiliza).
      NOTA: Bueno 1: Eso_v1; Pozo 2: Eso_v1 + 10 μM SB202190; Pozo 3: Eso_v1 + 100 ng/mL FGF10; Pozo 4: Eso_v1 + 10 μM SB202190 + 100 ng/mL FGF10 (concentraciones finales).
    2. Añade suavemente 1 mL de medium a cada pozo a lo largo de la pared.
    3. Incubar bajo condiciones estándar de cultivo de CO₂.
    4. Cambia de medio cada 3–5 días.
      NOTA: Premezclar los suplementos evita la necesidad de pipetear pequeños volúmenes directamente sobre frágiles cúpulas de la matriz de membrana basal. Los antibióticos se añaden solo durante los primeros 6 días tras la implantación del organoide. Las condiciones de cultivo (FGF10 +/-, SB202190 +/-) se determinan en función de la tasa de crecimiento y la morfología (preferiblemente esférica).
  3. Monitorizar la formación de organoides.
    1. Observa las cúpulas a diario usando un microscopio invertido.
      NOTA: Morfología esperada: Día 3–5 → esferoides visibles; Día 7–10 → esferoides densos listos para el paso.
    2. Expulsa los organoides cuando alcanzan un tamaño aproximado de 100–200 μm o muestra un apiñamiento en la cúpula del 90% o más.

5. Clasificación de la CAF

NOTA: Este paso se realiza para establecer CAFs a partir de una suspensión celular derivada de un tumor.

  1. Siembra los CAF en un plato recubierto de colágeno.
    1. Prepara un plato de 60 mm recubierto de colágeno que contenga 1,5 mL de medio fibroblasto-1.
    2. Añade 10 μL del filtrado tumoral asignado para la siembra de CAF.
    3. Añade antibióticos como 1× anfotericina B y 100 μg/mL de primocina.
    4. Incubar bajo condiciones estándar de cultivo de CO₂.
    5. Cambia de medio cada 3–5 días.
      NOTA: Empíricamente, el medio de fibroblastos 1 suele ser más adecuado que otros medios para el establecimiento y crecimiento inicial de las FQ y las FQ. Los antibióticos se añaden solo durante los primeros 6 días.
  2. Monitorizar el crecimiento de las CAF
    1. Vigila la aparición de morfología del fuso similar a fibroblastos a partir de los días 3–5.
    2. Fibroblastos del paso en confluencia del 90%–100%.
      NOTA: Si ocurre contaminación por células epiteliales, los fibroblastos pueden aislarse selectivamente ajustando la duración de la tripsinización, ya que los fibroblastos se desprenden más rápido que las células epiteliales durante el paso.

6. Clasificación de CF

NOTA: Este paso se realiza para obtener FQ compatibles con el paciente a partir de tejido adyacente no tumoral.

  1. Lava y prepara la digestión no tumoral.
    1. Centrifuga el tubo de digestión no tumoral (Tubo D) a 300 × g durante 5 minutos.
    2. Retira el sobrenadante usando una pipeta desechable.
    3. Añade 10 mL de DMEM/10% FBS, mezcla suavemente por inversión y centrifuga de nuevo a 300 × g durante 5 minutos.
    4. Aspira cuidadosamente el sobrenadante, reteniendo la pelota.
    5. Repite los pasos 6.1.3 y 6.1.4 una vez más.
  2. Siembra CFs en un plato recubierto de colágeno
    1. Transfiere toda la suspensión a un plato de 60 mm recubierto de colágeno que contenga 1,5 mL de medio fibroblasto-1.
    2. Añade antibióticos como 1× anfotericina B y 100 μg/mL de primocina.
    3. Incubar bajo condiciones estándar de cultivo de CO₂.
    4. Cambia de medio cada 3–5 días.
      NOTA: Los antibióticos se añaden solo durante los primeros 6 días.
  3. Monitoriza el crecimiento de la fibrosis quística.
    1. Observa la morfología del husillo similar a fibroblastos a partir de los 3–5 días.
    2. Fibroblastos del paso en confluencia del 90%–100%.

7. Paso de organoides y criopreservación

  1. Paso organoide.
    NOTA: El propósito de este paso es expandir los organoides una vez que alcanzan una densidad adecuada.
    1. Aspira el medio viejo y lava cada pozo con 1 mL de PBS.
    2. Añade 0,5 mL de tripsina precalentada para organoide a cada pozo.
    3. Pipetear vigorosamente con una punta P1000, usando el borde de la punta para romper la cúpula de la matriz de membrana basal.
      NOTA: El cizalladura mecánica ayuda a descomponer la densa matriz de membrana basal, mejorando el acceso enzimático.
    4. Incuba durante 10–15 minutos en una incubadora de CO₂ hasta que todos los grumos de gel se disuelvan. Disociar los organoides en 20–50 grumos celulares.
      NOTA: Evita la disociación total de células individuales, ya que reduce la viabilidad.
    5. Recoge la suspensión en un tubo de 15 mL de baja fijación.
    6. Enjuaga el pozo cuatro veces con 0,5 mL de DMEM/10% FBS y transfiere todos los enjuagues al mismo tubo de baja fijación.
    7. Centrifuga el tubo a 300 × g durante 5 minutos.
    8. Retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet con DMEM mínimo/10% FBS; ajustar el volumen de la suspensión a 80 μL.
    9. Mezclar 80 μL de la suspensión organoide con 240 μL de matriz de membrana basal helada (proporción 1:3).
    10. Emplatar la mezcla sobre una placa precalentada de 6 pozos (37 °C), con 4–6 cúpulas por pozo.
    11. Deja que las cúpulas se solidifiquen durante 15 minutos y luego añade 3 mL de Eso_v1 medio (la composición óptima en el cultivo inicial en el paso 4.2) por pozo.
    12. Cambia de medio cada 3–5 días.
      NOTA: Los organoides se trasladan cuando alcanzan un diámetro de aproximadamente 100–200 μm o cuando la apiñamiento en la cúpula supera el 90%. No se realiza el recuento celular. Para subculturas rutinarias, los organoides se dividen en una proporción de 1:4 a 1:10. Se espera una rápida reformación de los esferoides en un plazo de 48–72 horas.
  2. Criopreservación organoide
    1. Lava cada pozo con 3 mL de PBS.
    2. Añade 1,5 mL de tripsina para organoide a cada pozo, pipetea vigorosamente e incuba durante 10 minutos.
    3. Recoge toda la suspensión en un tubo de 15 mL de baja fijación y enjuaga el pozo cuatro veces.
    4. Centrifuga el tubo a 300 × g durante 5 minutos y retira el sobrenadante.
    5. Resuspende el pellet en 2 mL de 90% FBS/10% DMSO.
    6. Alícuota 0,5 mL en cada criovial.
    7. Coloque los viales en un recipiente congelante y guárdalos a −80 °C durante la noche.
    8. Transfiere los viales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
      NOTA: Los organoides se repoblan cuando alcanzan un diámetro de aproximadamente 100–200 μm o cuando el apiñamiento en la cúpula supera el 90%.
  3. Recuperación de organoides congelados
    1. Descongela el cryovial rápidamente en un baño maria a 37 °C.
    2. Transfiere el contenido a 5 mL de DMEM/10% FBS en un tubo de 15 mL.
    3. Centrifuga el tubo a 300 × g durante 5 minutos.
    4. Retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en 40–60 μL de DMEM/10% FBS.
    5. Mezcla la suspensión con matriz de membrana basal helada en una proporción 1:3.
    6. Emplatar la mezcla sobre una placa precalentada de 6 pozos (37 °C) como 4–6 cúpulas por pozo.
    7. Deja que las cúpulas se solidifiquen durante 15 minutos y luego añade 3 mL de Eso_v1 medio (la composición óptima en el cultivo inicial en el paso 4.2) por pozo.

8. Paso de fibroblastos y criopreservación

  1. CAFs y CFs en pasaje
    NOTA: El propósito de este paso es expandir los fibroblastos una vez que alcanzan una densidad adecuada.
    1. Lava el plato con 2 mL de PBS.
    2. Añade 0,4 mL de tripsina al 0,25%.
    3. Incubar durante 5 minutos en una incubadora de CO₂, monitorizando el desprendimiento bajo un microscopio.
    4. Neutraliza la tripsina con DMEM/10% FBS y transfiere toda la suspensión celular a una antena de 100 mm que contenga 10 mL de medio.
      NOTA: Los fibroblastos se desvían cuando alcanzan una confluencia del 90%–100%. Para subculturas rutinarias, se dividen en una proporción de 1:3. Empíricamente, la proliferación de fibroblastos se ralentiza o cesa cuando la densidad celular es baja.
  2. Criopreservación de fibroblastos
    1. Lava las células con 5 mL de PBS.
    2. Añade 1 mL de tripsina al 0,25% y luego incuba durante 5 minutos en una incubadora de CO₂.
    3. Neutraliza la tripsina con DMEM/10% de FBS y transfiere toda la suspensión celular a un tubo de 15 mL.
    4. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos.
    5. Resuspende el pellet celular en 2 mL de 90% FBS/10% DMSO.
    6. Alícuota 0,5 mL en cada criovial.
    7. Coloca los viales en un recipiente congelante y guárdalos a −80 °C durante la noche.
    8. Transfiere los viales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

9. Ensayo medio acondicionado

NOTA: El propósito de este paso es evaluar los efectos paracrinos de los fibroblastos sobre organoides tumorales de ESCC utilizando medio condicionado (MC). Este ensayo proporciona un modelo reproducible de interacción estromal-tumor cuando la cocultura directa aún no está optimizada.

  1. Preparación de medio acondicionado CAF/CF
    1. Cultiva el mismo número de CAFs o CFs en 3 mL de DMEM/10% FBS en antenas de 60 mm hasta una confluencia del 80%–90%.
    2. Lava las células una vez con 2 mL de PBS.
    3. Añade 3 mL de DMEM/2% FBS.
    4. Incubar durante 48 horas en una incubadora de CO₂.
    5. Recoge el sobrenadante en un tubo de 15 mL.
    6. Centrifugar a 2000 × g durante 5 minutos para eliminar los restos celulares.
    7. Recoge 2,5 mL del sobrenadante en un tubo nuevo de 15 mL.
    8. Alicuota el medio acondicionado en porciones de 100–500 μL y almacenarlo a -80 °C.
  2. Preparación del medio de ensayo organoide
    1. Prepara el medio organoide ESCC tal y como se describe en el paso 1.3.
    2. Mezcla el medio organoide y el medio acondicionado en una proporción 1:1 (50% v/v).
  3. Cultivo de organoides cancerosos utilizando el medio de ensayo organoide.
    1. Tras el paso de organoides como se describe en el paso 7, semilla los organoides en una única cúpula de matriz de membrana basal de 20 μL por pozo sobre una placa precalentada de 48 pozos (37 °C).
    2. Tras la solidificación de la cúpula, añadir 0,3 mL de medio de ensayo organoide a cada pozo.
    3. Cambia el medio de ensayo organoide cada 3–7 días.
    4. Evalúa la morfología y el tamaño de los organoides cancerosos.
      NOTA: Todos los materiales de origen humano se consideran potencialmente infecciosos. El equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes, mascarillas y gafas de protección, siempre se lleva puesto. La colagenasia, la dispasa y el dimetilsulfóxido (DMSO) pueden causar irritación en la piel, los ojos y las vías respiratorias; por lo tanto, se evita el contacto directo y la inhalación. Todos los procedimientos enzimáticos que involucran tejidos humanos se realizan de acuerdo con las directrices institucionales de bioseguridad. Los residuos líquidos que contienen tejido humano se recogen en recipientes sellados para riesgos biológicos y se autoclavan antes de su eliminación. Los residuos químicos, incluyendo DMSO y soluciones enzimáticas, se eliminan conforme a las directrices institucionales sobre residuos peligrosos. Todos los instrumentos reutilizables se enjuagan con etanol al 70% y se autoclavan antes de reutilizarlos.

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Resultados

Se obtuvieron muestras de tejido de la región tumoral y de una región no tumoral adyacente situada a 3 cm del tumor, extirpadas quirúrgicamente de un paciente con CCE que no había recibido quimioterapia neoadyuvante. Los organoides y CAFs del cáncer se aislaron de la región tumoral, mientras que las FQ se aislaron de la región no tumoral. Los tejidos quirúrgicos se picaron en piezas de aproximadamente 0,5 mm de tamaño (Figura 2A), luego se trataron enzimátic...

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Discusión

Los informes previos emplearon organoides cancerígenos y CAFs emparejados con pacientes para investigar el papel de los CAF en la proliferación y resistencia a fármacos en cánceres humanos de colon, mama, páncreas y cabeza ycuello 20,21,22,23,24. Estos estudios demostraron que los CAF influyen en la proliferación y la resisten...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Premio al Joven Investigador de la Universidad Juntendo (2024 y 2025) otorgado a P. Z. y subvenciones para la investigación científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (23K07362, 21K08693). Queremos agradecer a todos los miembros de los Departamentos de Patología y Oncología, así como de Cirugía Esofágica y Gastroenterológica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Antena parabólica de 100 mmTPP93100
100x Penicilina-Estreptomicina (PS)Nacalai26253-84
Tubo de 15 mlFastGeneFG2001
Placa de cultivo celular de 24 pozosTPP92024
Placa de cultivo celular de 48 pocillosTPP92448
Tubo de 50 mlFastGeneFG2004
Antena parabólica de 60 mmTPP93060
Placa de cultivo celular de 6 pozosTPP92006
A83-01Caimán9001799
DMEM avanzado/F12 Gibco12634010Medio basal organoide = DMEM avanzado/F12 + GlutaMAX + 1x PS
Alexa488 anti-ratón IgGInvitrogenA11029
Anfotericina BThermoFisher15290018
Anticuerpo anti-Vimentina (V9)Santa CruzSC-62601/500 de dilución para uso
B-27ThermoFisher17504044
Filtro de tapa de botellaSartorius180F15
Filtrador celular, 100 y micro; m poreBD Falcon352360
Colagenasa tipo ISIGMAC0130
Dishe recubierto de colágeno de 60 mmIWAKI4010-010
Dimetilsulfóxido (DMSO)Wako043-07216
Dispasa IGODO SHUSEI386-02271
Eagle Medium Modificado (DMEM) de DulbeccoNacalai08459-64
ECLIPSE Ti2Nicon
Suero fetal bovino (FBS)SERANAS-FBS-CO-015
Medio de Crecimiento de Fibroblastos 2PromoCellC-23020Medio de fibroblastos-1 = Medio de crecimiento de fibroblastos 2
G418InvivogenANT-GN-1
GlutaMAX Gibco35050061
HFDM-1KSK87-160Medio fibroblasto-2 = HFDM-1 + 1% FBS + 1 x PS
Hoechst33342 Nacalai04929-82
HigromicinaInvivogenANT-HG-1
Sistema IncuCyteEssen BioScience
Celdas L-WRNATCCCRL-3276
MatrigelCorning354234Matriz de membrana basal = Matrigel
N2ThermoFisher17502048
N-acetil-L-CisteínaWako017-05131
NicotinamidaTCIN0078
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Nacalai14249-24
PrimocinInvivogenANT-PM-05
EGF humano recombinantePEPROTECHAF-100-15
FGF-10 humano recombinantePEPROTECHPEP-100-26
SB202190SelleckS1077
Bisturí, nº 11Pluma8-3086-02
STEMFULLBaquelita sumitomoMS-90150Tubo de baja unión de 15 mL = STEMFULL
TrypLE ExpressGibco12605028Tripsina para organoide = TrypLE Express
TripsinaNacalai35556-44
Y-27632SelleckS1049

Referencias

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