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Artículo de método

Patología estriatal inducida por lentivirales como modelo preclínico de ataxias poliglutaminas, espinocerebelosas

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DOI:

10.3791/69550

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13 de marzo de 2026

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1ABC-RI, Algarve Biomedical Center Research Institute, 2Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 3ABC Collaborative Laboratory: Integrated Ageing and Rejuvenation Solutions (ABC CoLAB - Ageing Better)

En este artículo

Resumen

Las ataxias espinocerebelosas de poliglutamina son causadas por expansiones CAG que producen proteínas propensas a la agregación. Este protocolo describe la producción vectorial, la entrega estereotaxica y el análisis de inclusiones y pérdida de marcadores neuronales, proporcionando una plataforma controlada para investigar mecanismos y evaluar terapias dirigidas para enfermedades neurodegenerativas.

Resumen

Las ataxias espinocerebelosas de poliglutamina son un grupo de seis enfermedades neurodegenerativas causadas por una mutación en el tracto trinucleótidico CAG dentro de la región codificante de cada gen causal. Esta mutación provoca una expansión anormalmente extendida de la poliglutamina en la proteína, lo que la hace propensa a la agregación y conduce a la formación de inclusiones intraneuronales, que son una característica distintiva de estas enfermedades. Los mecanismos moleculares que subyacen a la patogénesis de estas enfermedades son complejos y no se comprenden completamente. Hasta ahora, estas enfermedades siguen siendo incurables. Comprender los mecanismos moleculares en regiones cerebrales vulnerables es esencial para el desarrollo terapéutico. Se necesitan plataformas experimentales flexibles y específicas de cada región para probar rápidamente mecanismos e intervenciones sin el tiempo ni el coste de generar múltiples líneas transgénicas, aunque no aborden la vulnerabilidad selectiva. En los últimos años, nosotros y otros hemos desarrollado varios modelos basados en lentivirales para estudiar el impacto de la expansión de la expresión proteica en regiones específicas del cerebro. Estos modelos muestran características neuropatológicas y conductuales que imitan algunas características de la enfermedad, destacando su importancia para comprender la patogénesis y en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. En este artículo, describimos el desarrollo de un modelo estriatal usando SCA2 como ejemplo. Destacamos el desarrollo y producción de vectores lentivirales, así como la inyección estereotáxica de los vectores que expresan la forma expandida de la ataxina-2 (la proteína causante de la enfermedad). Por último, caracterizamos dos principales características neuropatológicas: la formación de inclusiones y la pérdida de marcadores neuronales. Al proporcionar una plataforma controlada que reproduce estas características patológicas clave, este modelo es una herramienta valiosa para diseccionar mecanismos específicos de la neurodegeneración por región y evaluar intervenciones terapéuticas dirigidas.

Introducción

Las ataxias espinocerebelosas de poliglutamina (polyQ SCA) son un grupo de seis trastornos neurodegenerativos autosómicos dominantes causados por expansiones repetidas de trinucleótidos CAG en varios genes causales, lo que resulta en tractos tóxicos de poliglutamina (polyQ) dentro de proteínascodificadas 1. Entre ellas, las SCA poliQ más frecuentes son SCA3/enfermedad de Machado-Joseph y SCA22. Estos trastornos afectan principalmente a las células neuronales en regiones cerebrales específicas, incluyendo el cerebelo y el tronco encefálico, así como el estriado y otras áreas. En consecuencia, provocan una descoordinación motora progresiva, alteraciones de la marcha, neurodegeneración severa y muerteprematura 3.

Se han desarrollado múltiples modelos animales para estudiar las ECA poliQ y probar enfoques terapéuticos. Se han utilizado ratones transgénicos, líneas knock-in y modelos de ratones de expresión condicional para dilucidar la base molecular de la progresión de la enfermedad y las vías celularesimplicadas 4,5. Sin embargo, generar un nuevo modelo animal de enfermedad es laborioso y costoso, y a menudo no es adecuado para estudiar la implicación regional cerebral en la patogénesisde la enfermedad 6.

Los modelos murinos basados en lentivirales (LV) ofrecen una alternativa complementaria a los modelos convencionales, con costes reducidos y la posibilidad de estudiar regiones específicas delcerebro 7,8. Los vectores lentivirus permiten la entrega de transgenes grandes (hasta 8 kb), lo que conduce a una rápida inducción de patologías en regiones cerebrales definidas sin necesidad de modificar la línea germinal, y pueden usarse en animales de diferentes edades. La inyección directa de vectores lentivirales en la región cerebral objetivo puede lograr la expresión específica de genes patógenos o terapéuticos por región con una inmunogenicidad reducida en comparación con otros vectoresvirales 4. Además, el parto posnatal evita la compensación del desarrollo para investigar los mecanismos de la enfermedad en condiciones que se asemejan más al inicio humano9. Los niveles de expresión pueden ajustarse ajustando la dosis viral, produciendo fenotipos de severidad controlada y facilitando el modelado de la progresión gradual de la enfermedad. Además, este método permite una expresión específica del tipo celular dependiendo del promotorelegido 4,7.

Varios estudios han demostrado la practicidad y utilidad de los modelos murinos basados en LV para la modelización de los SCApolyQ 10,11,12,13. Nosotros y otros hemos desarrollado modelos basados en el VE para SCA111, SCA212, SCA311,12 y SCA714, constituyendo plataformas para la expresión rápida y específica de regiones o silenciamiento de genes de la enfermedad, reproduciendo aspectos clave de la neuropatología.

En resumen, el enfoque lentiviral descrito aquí proporciona una herramienta versátil y eficiente para modelar la patogénesis de las SCA polyQ. Al superar algunos de los principales inconvenientes de los modelos animales actuales, este método acelera los estudios de prueba de concepto y proporciona un mayor control sobre el inicio de la enfermedad, localización y gravedad, características que lo hacen muy adecuado para el cribado terapéutico y el estudio de mecanismos moleculares. Aquí describimos un método reproducible para generar y caracterizar un modelo lentiviral estriatal de la ataxia espinocerebelosa poliglutamina, permitiendo un análisis detallado de eventos patogénicos tempranos y la evaluación de terapias candidatas.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de Investigación Animal: Reporte de Experimentos In Vivo (ARRIVE) y con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El presente estudio fue aprobado por la Direção-Geral da Alimentação e Veterinária (DGAV). En este estudio se utilizaron ratones C57BL/6J y fueron alojados en grupo en jaulas estándar bajo un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con comida y agua proporcionadas ad libitum.

NOTA: Los materiales utilizados en este protocolo se describen más adelante en la Tabla de Materiales.

1. Empaquetado de vectores lentivirales

NOTA: Todos los procedimientos que involucren vectores lentivirales deben realizarse en un laboratorio BSL-2 siguiendo las directrices de seguridad de la institución. Utilizamos el sistema de transfección de 4 plásmidos debido a su mayor bioseguridad en comparación con otros sistemas productores de lentivirales (véase la Figura 1 para los detalles sobre el plásmido de transferencia).

  1. Descongelar las células HEK 293T en baño maria y sembrarlas en un matraz T75 usando el medio Eagle Medium modificado (DMEM) de Dulbecco, complementado con 2 mM de L-glutamina, 10% FBS y 1% Pen-Streptocócico. Este medio DMEM completo se utilizó en todas las etapas del protocolo. Utiliza células en el número de paso ≤10 para asegurar altos niveles virales y resultados consistentes.
    NOTA: Siempre comprueba la contaminación por micoplasma antes de continuar.
  2. Cuando las células alcancen una confluencia del 80%-90%, amplíalas en 2 frascos de T175 dividiendo el cultivo inicial 1:2. Siembra 20 platos de cultivo de 100 mm con 3,8 x 106 células por plato (volumen final 10 mL) e incubalos durante 24 horas a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. Contar células por exclusión de azul de tripán usando un hemocitómetro de Neubauer.
    NOTA: Considere excluir Pen-Strep del medio para reducir el estrés celular y, en consecuencia, maximizar la transfección celular.
  3. Al día siguiente, prepara la mezcla de transfección como se describe en la Tabla 1. Vórtice y girar brevemente hacia abajo para homogeneizarse. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10–20 minutos para permitir que se formen complejos de ADN: PEI.
  4. Después del ADN: los complejos PEI se dejaron formar durante 15 minutos a temperatura ambiente, ajustando la mezcla a 5 mL con DMEM completo.
    Retira 5 mL de medio de cada cuenca de cultivo (la mitad del volumen total) y reemplácelos por los 5 mL de mezcla de transfección. Esto mantiene el volumen final de cultivo en 10 mL durante la transfección.
  5. Transfecta las células con los tres plásmidos de empaquetado y el plásmido de transferencia tal como se describe en la Tabla 1.
    NOTA: Todos los plásmidos utilizados para la producción de lentivirales deben prepararse utilizando kits de purificación sin endotoxinas. Además, la integridad del plásmido debe verificarse mediante análisis enzimático de restricción para confirmar la corrección de las regiones LTR y del casete transgénico antes de la transfección.
  6. Añade 5 mL de la mezcla de transfección gota a gota a cada plato e incuba durante 6 horas. Aspira todo el medio y retitúyelo por 10 mL de medio fresco. Incubar durante 48 horas.
    NOTA: Para aumentar el título viral, recoge el medio a las 48 horas, añade 10 mL de medio fresco a cada placa y recoge de nuevo después de 24 horas. El medio previamente recogido puede almacenarse a 4 °C durante hasta 24 horas. Esto permitirá una concentración del doble de volumen y aumentar el título viral.
  7. Filtrar todo el medio acondicionado que contenga vectores lentivirales usando una unidad de filtro de 0,22 μm.

2. Purificación y titulación de vectores lentivirales

  1. Transfiere el sobrenadante filtrado a tubos cónicos de ultracentrífuga apropiados y centrifugar a 65.000 x g durante 1 h 30 min a 4 °C, utilizando, por ejemplo, un rotor de cubeta oscilante.
  2. Descarte cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda cada pellet en 400 μL de BSA al 1% diluido en 1x PBS, evitando la formación de burbujas. Incuba en hielo al menos 1 hora.
  3. Tras 1 hora de incubación, mezcla suavemente cada tubo para asegurarte de que los pellets quedan completamente resuspendidos y homogéneos, y luego agrupa todos los pellets resuspendidos en un solo tubo.
  4. Llena el tubo con un 1% de BSA/PBS hasta que esté al menos dos tercios lleno para evitar el colapso durante la centrifugación.
  5. Centrifugar de nuevo a 65.000 x g durante 1 hora y 30 minutos a 4 °C para pelletar los vectores lentivirales. Descarta cuidadosamente el sobrenadante y seca el borde del tubo con papel estéril.
  6. Resuspende el pellet que contiene los vectores lentivirales en 45 μL de 1% BSA/PBS, evitando burbujas. Sella el tubo con una película transparente e incuba a 4 °C durante 24 horas.
  7. Al día siguiente, preparar 10 μL de alícuotas de los vectores lentivirales. Mantén una alicota de 10 μL para la titulación: 5 μL para el kit ELISA p24 y 2 μL para el kit qPCR. Titula los vectores lentivirales usando ELISA y qPCR según las instrucciones del fabricante.
    NOTA: La elección del método de titulación depende de las necesidades experimentales, por ejemplo, una evaluación rápida o cuantificación precisa de las unidades infecciosas. ELISA basado en p24 cuantifica la proteína de la cápside y, por tanto, mide partículas físicas totales; Es rápida, menos costosa que otros métodos y altamente reproducible. Sin embargo, no distingue partículas infecciosas de no infecciosas, lo que puede llevar a una sobreestimación del título funcional. La titulación basada en qPCR mide el número de genomas virales (vg) empaquetados en partículas, proporcionando una estimación más precisa de los viriones que contienen genomas y permitiendo la comparación directa entre preparaciones vectores. Sin embargo, aún no puede evaluar la efectividad de la infección de las partículas virales. Finalmente, los ensayos basados en la infectividad, como la citometría de flujo para vectores fluorescentes o la formación de colonias de resistencia a antibióticos, miden directamente las unidades transductoras funcionales (TU/ml) y son las más relevantes biológicamente, aunque son más laboriosas, dependientes del tipo celular, tardadas ymás costosas 15,16.

3. Cirugía estereotáxica para la administración bilateral de lentivirales en el estriado del ratón

  1. Preparación animal
    1. Pesa al animal y calcula la dosis de anestesia requerida. Administrar anestesia intraperitonealmente a una dosis de 10 μL/g de peso corporal utilizando una solución preparada. Esta solución se prepara combinando 7,5 mL de NaCl al 0,9%, 500 μL de medetomidina (1,0 mg/mL), 1,0 mL de midazolam (5,0 mg/mL) y 1,0 mL de fentanilo (0,05 mg/mL), para un volumen final de 10 mL. Permitir aproximadamente 10 minutos para la inducción completa de la anestesia.
    2. Confirma la profundidad de la anestesia (por ejemplo, el pellizco del dedo del pie). Aplica pomada oftálmica en ambos ojos y afeita el cuero cabelludo.
    3. Coloca al animal en el marco estereotáxico sobre una almohadilla térmica. Coloca la cabeza usando las barras de los oídos y la barra de mordida.
      NOTA: El número de animales a inyectar y la cronología dependen del experimento y deben determinarse mediante un análisis estadístico a priori basado en las hipótesis específicas y los tamaños de efecto esperados. Por ejemplo, en nuestro estudioanterior 12, los cerebros inyectados se analizaron a las 4, 8 y 12 semanas después de la inyección para evaluar la progresión de los cambios neuropatológicos.
  2. Preparación de jeringuillas y carga viral
    1. Utiliza la aguja estándar de Hamilton para la carga y una aguja de punta roma de 26G para la inyección. Carga 2 μL de solución vectorial lentiviral en la jeringuilla. Asegúrate de que la dosis viral por lugar de inyección sea de 400 ng de antígeno p24/mL, o 5 x 109 UI/mL 10,12,17.
    2. Monta la jeringuilla en la bomba automática de microinyección (por ejemplo, Stoelting). Imprima la jeringuilla en modo de infusión hasta que aparezca una gota de líquido en la punta de la aguja. Asegúrate de que el bisel esté orientado hacia adelante.
    3. Ajusta los parámetros de la bomba: velocidad: 0,25 μL/min, volumen por hemisferio: 2 μL, tipo de jeringuilla: adecuado a lo que se está utilizando.
      NOTA: El volumen a inyectar depende de la especie de roedor y del área cerebral objetivo a transducir. Las inyecciones de 1 μL conducen a una expresión focal, mientras que volúmenes totales mayores (hasta 10 μL) requieren tasas de inyección muy lentas y conllevan un mayor riesgo de alteración o reflujo tisular.
  3. Segmentación e inyección estriatal
    1. Desinfecta el cuero cabelludo con etanol al 70%. Realiza una incisión en la línea media (~1–1,5 cm) usando una hoja de bisturí estéril desde entre las orejas hasta los ojos.
    2. Expone y limpia el cráneo, retirando el periosteo con hisopos de algodón. Localiza Bregma y graba el punto cero estereotáxico (manualmente o digitalmente).
    3. Determinar las coordenadas de inyección relativas a Bregma (para un ratón de 8-12 semanas de edad con aproximadamente 18-20 g): Antero-posterior (AP) +0,6 mm; Mediolateral (ML) ±1,8 mm; Dorsoventral (DV): –3,3 mm.
    4. Practica cuidadosamente en las coordenadas AP/ML marcadas. Procede despacio para evitar penetrar en el cerebro. Alternativamente, detente una vez que el hueso esté suficientemente delgado; esto se indica mediante la visualización de los vasos sanguíneos en la duramadre a través del cráneo. Perfora cuidadosamente la duramadre con una aguja pequeña.
    5. Comprueba que el orificio esté en la posición correcta bajando la aguja de inyección. Prueba la obstrucción de la aguja inyectando una parte de la solución hasta que una gota sea claramente visible.
    6. Baja la aguja de inyección lentamente hasta la coordenada DV. Inyectar 2 μL de solución viral por hemisferio a 0,25 μL/min. Después de la inyección, espera 5 minutos antes de retraer lentamente la aguja para evitar el reflujo.
    7. Inyectar lentivirus que codifica la proteína salvaje (ATXN2WT o ATXN3WT) en un hemisferio y el lentivirus que codifica la proteína mutante/expandida (ATXN2MUT o ATXN3MUT) en el lado contralateral (aleatorio o predefinido)12,13.
      NOTA: Utilizando el atlas cerebraldel ratón 18, prácticamente todas las regiones cerebrales pueden ser atacadas estereotácticamente más allá del estriado, incluyendo la corteza, el hipocampo, la sustancia nigra y el cerebelo. Dado que el cerebelo es el principal sitio de patología en los SCAs, representa un objetivo especialmente relevante para la entrega de vectores. Para el desarrollo de este modelo cerebeloso SCA3 en ratón, utilizamos coordenadas de 1,6 mm rostral a lambda, 0 mm desde la línea media y 1 mm ventral a la superficie del cráneo, con la barra bucal ajustada a −3,3, asegurando una dirección precisa de la cortezacerebelosa 12,15.
  4. Monitorización durante la cirugía
    1. Monitoriza el movimiento de los bigotes y los reflejos. Si se observa movimiento, administre una dosis suplementaria de anestesia (un tercio del volumen inicial).
  5. Cierre y recuperación de la herida
    1. Cierra la incisión con suturas de nylon 5-0 interrumpidas. Administra una mezcla de fármacos antagónicos por vía subcutánea con una dosis de 10 μL/g de peso corporal para revertir los efectos de la anestesia inicial. Esta solución se prepara combinando 1,5 mL de NaCl al 0,9%, 500 μL de atipamezole (5,0 mg/mL), 5,0 mL de flumazenil (0,1 mg/mL) y 3,0 mL de naloxona (0,4 mg/mL), para un volumen final de 10 mL.
    2. Coloca al animal en una jaula de recuperación limpia sobre una almohadilla térmica y vigílalo durante la noche.
      NOTA: La sala de inyección debería estar idealmente equipada con un armario de seguridad biológica para el manejo de vectores. Los investigadores deben llevar el equipo de protección individual (EPP) adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes y protección ocular. Todos los residuos (por ejemplo, agujas, jeringuillas y materiales contaminados) deben ser eliminados en recipientes de riesgo biológico según la normativa institucional y nacional.

4. Recolección, preparación y procesamiento de tejidos

  1. Preparación
    1. Preparar todos los instrumentos de disección y las soluciones necesarias para la eutanasia y la recogida de tejidos en ratón (por ejemplo, anestesia, paraformaldehído al 4% [PFA] en PBS).
    2. Prepara un 4% de PFA con antelación, guárdalo congelado y descongela no más de 24 horas antes de su uso. Asegúrate de que la solución esté bien fría antes de la perfusión.
      PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico. Maneja solo dentro de una campana extractora, con el equipo de protección individual (EPI) y entrenamiento adecuados.
    3. Administre una dosis letal de pentobarbital (100–200 mg/kg, intraperitoneal) para anestesiar al animal. Confirmar anestesia profunda por ausencia del reflejo de pellizco en el dedo del pie; Si el reflejo persiste, administra una dosis adicional.
  2. Perfusión transcárdica
    1. Coloca y asegura al animal en el aparato de disección. Con pinzas, levanta la piel abdominal y haz una incisión vertical ascendente con tijeras (Figura 2A, flecha rosa).
    2. Levanta la fascia superficial y haz una incisión superior hasta que el hígado sea visible, evitando lesiones en los órganos abdominales.
    3. Corta el diafragma horizontalmente y luego extiende la incisión hacia la axila (Figura 2A, flecha blanca). Refleja y fija la pared torácica.
    4. Inserta una aguja de perfusión en el vértice del ventrículo izquierdo, asegurando que no perfore la pared ventricular. Haz una pequeña incisión en la aurícula derecha con unas tijeras finas (Figura 2B).
    5. Inicie la perfusión transcárdica utilizando 50 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% helado a un caudal de 1-2 mL/min.
      NOTA: A menudo, la solución fría provoca curvatura de la cola y espasmos musculares, lo que es un indicador de buena perfusión.
  3. Disección cerebral
    1. Prepara un tubo que contenga suficiente PFA al 4% para sumergir completamente el cerebro. Decapita al ratón con unas tijeras grandes. Desecha el cuerpo en una bolsa sellada de biohazard para incinerarlo.
    2. Refleja el cuero cabelludo para exponer el cráneo. Identifica el foramen magnum y comienza a extraer el cráneo cortando lateralmente con tijeras finas, paralelo al cerebro (Figura 2C).
    3. Repite en el lado contralateral, luego corta el cráneo entre los ojos por encima de los bulbos olfativos.
    4. Eleva el cráneo desde el cerebelo hacia los bulbos olfativos para exponer el cerebro. Utilizando una espátula, retira cuidadosamente el cerebro de posterior a anterior y sumérgelo en un PFA al 4% durante no más de 24 horas a 4 °C.
    5. Sustituye la solución de incrustación por un 20%-30% de sacarosa en PBS e incuba a 4 °C hasta que la infiltración esté completa. El cerebro inicialmente flota y luego se hunde una vez completamente infiltrado, normalmente en menos de 24 horas. Si permanece a flote, extiende la incubación hasta que se asiente en el fondo del tubo.
      NOTA: Este paso de crioprotección minimiza los artefactos de congelación al reducir el contenido de agua del tejido.
      Seca suavemente el cerebro y el tubo, y luego guarda a -80 °C hasta que se use de nuevo.
  4. Criosección y recogida de tejido flotante
    1. Antes de seccionar, ajusta el criostato a -20 °C y al grosor deseado.
      NOTA: Para el estriado, las secciones coronales con un espesor de 20-25 μm ofrecen un compromiso ideal entre la preservación estructural y la penetración de anticuerpos, produciendo secciones lo suficientemente robustas para su manipulación, manteniendo una alta calidad de tinción y resolución espacial. Las condiciones de criosección también deben especificarse para otras regiones cerebrales, ya que el grosor óptimo puede variar según la citoarquitectura. Para el cerebelo, generalmente se recomiendan secciones sagitales de 25–35 μm, ya que este grosor preserva la organización estratificada de la corteza cerebelosa.
    2. Transporta el cerebro sobre hielo seco y deja que se equilibre dentro del criostato durante 5-10 minutos. Este paso es importante para prevenir daños en los tejidos.
    3. Eliminar los bulbos olfativos con un bisturí; Deben ser blandas y fáciles de cortar. Aplica una gota del tamaño de un guisante de O.C.T. fresco sobre el disco de muestra y coloca el cerebelo en contacto (Figura 1D). Coloca el cerebro para la sección coronal. Una vez congelado, añadir T.O.C. adicional para incrustar todo el cerebro.
      NOTA: EL O.C.T. es transparente a temperatura ambiente y se vuelve opaco blanco cuando está completamente congelado; Si sigue brillando, permite más tiempo de congelación en el criostato.
    4. Montar el disco de muestra en el soporte y recortar hasta que el estriado (dos círculos blancos en cada hemisferio) sea visible. Si los hemisferios recibieron tratamientos diferentes, perforar uno con una aguja para mantener la orientación. Anota esto para un análisis posterior.
    5. Cambia a modo de seccionamiento y recoge secciones flotantes en una placa de 48 pozos usando un cepillo fino o una pipeta Pasteur de cristal pulido al fuego.
      NOTA: El método de flotación libre mejora la penetración de anticuerpos, reduce el fondo, permite el almacenamiento a largo plazo y asegura secciones espaciadas uniformemente para una cobertura estriatal completa.
    6. Llenar los pozos con PBS que contenga azida de sodio al 0,05%.
      PRECAUCIÓN: La azida de sodio es tóxica: manténgalo con EPI y deshazte de los residuos adecuadamente.
    7. Coloca la primera sección en el pozo A1, la segunda en A2 y continúa secuencialmente. Cuando la placa está llena, continúa en una nueva placa o vuelve al pozo A1 y continúa hasta que todo el estriado esté seccionado (~3 placas completas de 48 pozos). Sella las placas con película transparente y guárdalas a 4 °C hasta su uso.
      NOTA: Para el análisis de estriados completos, seleccionar una columna de la placa produce secciones espaciadas uniformemente representativas de toda la región.

5. Inmunohistoquímica con tinción DAB

  1. Lava las secciones 3 veces con PBS para eliminar la azida residual de sodio. Incubar en solución de fenilhidrazina (0,2 - 0,3 mg/mL en PBS) durante 30 minutos a 37 °C.
    PRECAUCIÓN: La fenilhidrazina es cancerígena: realiza este paso en una campana extractora y elimina los residuos como peligrosos.
  2. Lava 3 veces en PBS durante 5 minutos, 10 minutos y 10 minutos de forma secuencial. Bloquear el tejido durante 1 hora en TR en PBS que contiene un 10% de suero normal de cabra (NGS) y un 0,1% de Triton X-100.
  3. Incubar durante la noche a 4 °C con anticuerpo primario en la dilución recomendada (por ejemplo, anti-ataxina de ratón, 1:1000 en solución bloqueadora) bajo una agitación suave. Lava 3 veces en PBS durante 5 minutos, 10 minutos y 10 minutos de forma secuencial.
  4. Incubar con anticuerpo secundario biotinilado (1:200 en solución bloqueante) durante 2 horas en RT bajo agitación suave. Lava 3 veces en PBS durante 5 minutos, 10 minutos y 10 minutos de forma secuencial.
  5. Incubar en el complejo ABC durante 30–40 minutos en tiempo de descanso. Lavar 3 veces en PBS durante 5 minutos, 10 minutos y 10 minutos secuencialmente.
  6. Preparar la solución de DAB fresca: para 2,5 mL de agua ultrapura, añadir 1 gota de tampón y vórtice; añadir 2 gotas de DAB y vórtice; Añade 1 gota de H₂O₂ y vuelve a usar vórtice.
    PRECAUCIÓN: El DAB es cancerígeno: maneja en una campana extractora y desecha los residuos correctamente.
  7. Desarrollar secciones en solución de DAB individualmente hasta alcanzar la intensidad de tinción deseada (normalmente entre 1 y 10 minutos). Detén la reacción inmediatamente transfiriéndola a PBS.
    NOTA: La reactividad al DAB disminuye con el tiempo; Trabaja de forma eficiente. Si hay más de una sección en el pozo a la vez, asegúrate de que no estén en contacto, ya que influirá en el proceso de tinción.
  8. Lava 3 veces en PBS durante 5 minutos, 10 minutos y 10 minutos de forma secuencial. Monta secciones sobre portaobjetos recubiertos de gelatina y déjalas secar completamente. No etiquetes las láminas con lápiz de grafito, ya que podría interferir con la imagen.
  9. Deshidratar, transparente y deslizar de la siguiente manera: Sumergir en agua destilada durante 30 segundos, deshidratar mediante serie de etanol: 75%, 96%, 100% (3 min cada uno). Limpia en un sustituto de xileno durante 5 minutos y seca al aire. Aplica el slip de cobertura usando un medio de montaje de endurecimiento rápido y deja que cure dentro de la campana durante al menos 24 horas antes de hacer la imagen o almacenarlo.

6. Cuantificación del volumen agotado por DARPP-32 en el estriado del ratón usando FIJI (ImageJ)

  1. Adquisición de imágenes
    1. Capturar imágenes de secciones coronales del cerebro que abarcan todo el estriado (aproximadamente Bregma +1,0 a –0,5 mm). Mantén una iluminación, aumento (por ejemplo, 10x) y resolución constantes. Guarda imágenes en formato TIFF con nombres de archivo secuenciales (por ejemplo, Striatum_Bregma_+0.5.tif).
  2. Preparación de imágenes en FIJI
    1. Abre cada imagen en FIJI. Calibra el tamaño del píxel: Ve a Analizar > Ajustar escala. Utiliza una escala conocida de un micrómetro o los metadatos de la imagen (por ejemplo, 1 píxel = 1 μm).
    2. Convertir imágenes a 8 bits: Tipo > imagen > 8 bits. Ajusta el brillo/contraste si es necesario para una visualización óptima del área agotada (evita el umbral en este paso).
  3. ROI selección de áreas agotadas
    1. Utiliza la herramienta Polygon, Freehand o Brush para delinear la región con DARPP-32 agotada (normalmente más clara o sin tinte en el estriado). Ve a Analizar > Medida para registrar el área en μm2.
    2. Guarda el ROI yendo a ROI Manager > Añadir > más > Guardar o usar la función Multimedida para análisis por lotes.
    3. Repite para todas las secciones cerebrales relevantes.
  4. Cálculo del volumen agotado
    1. Multiplica el área agotada en cada sección por la distancia entre secciones (típicamente 120 – 240 μm, dependiendo del grosor y el espaciado de la sección).
      Volumen por sección (mm3) = área agotada (mm2) × Intervalo de sección (mm)
    2. Suma el volumen en todas las secciones:
      Volumen total agotado (mm3) = Σ (área × intervalo)
    3. Opcional: Superposición para visualización. Utiliza > Imagen > Superposición de ROI para visualizar las regiones agotadas entre secciones. Exporta una imagen resumen o animación de las figuras.
  5. Siempre comprueba la alineación con el atlas cerebral del ratón para un mapeo rostro-caudal preciso. Analizar cada hemisferio por separado para distinguir efectos unilaterales (por ejemplo, WT vs inyección mutante).

7. Cuantificación de agregados proteicos en el estriado del ratón

  1. Cuantificación manual usando FIJI
    1. Carga y calibra la imagen. Abre la imagen en FIJI. Calibra el tamaño del píxel (sáltate este paso si usas imágenes con metadatos).
    2. Ve a Analizar > Establecer escala, introduce la distancia conocida (por ejemplo, 1 píxel = 0,5 μm). En FIJI, ve a Plugins > Analizar > contador de celdas > contador de celdas. Haz clic en Inicializar y luego selecciona la imagen.
    3. Elige un tipo de marcador (por ejemplo, Tipo 1) para los agregados. Haz clic manualmente en cada agregado visible para etiquetarlo. Datos de registro: FIJI mostrará el recuento en el panel de Contador de Celdas. Recuento de registros para cada imagen/sección. Exporta los recuentos manualmente o usa una macro para recopilar los resultados.
  2. Cuantificación semi-automatizada usando IHCAggreCount
    1. Sube y procesa imágenes. Abre IHCAggreCount y haz clic en Subir imagen (Figura suplementaria 1).
      NOTA: La aplicación IHCAggreCount fue desarrollada por nuestro laboratorio como una herramienta científica independiente diseñada para agilizar y estandarizar la cuantificación de agregados celulares a partir de imágenes microscopicas. El software se construyó íntegramente en Python utilizando una arquitectura modular que separa el manejo de imágenes, el procesamiento, las correcciones de selección, el cálculo de mediciones y otros. IHCAggreCount es totalmente compatible con Windows 10 y Windows 11, así como con macOS 13 Ventura y macOS 14 Sonoma, y ha sido probado con éxito en ambas plataformas. En comparación con los métodos convencionales de inspección manual de imágenes, el software ofrece ventajas analíticas significativas: reduce la subjetividad del usuario, elimina los pasos manuales repetitivos, acelera el procesamiento de imágenes, garantiza mediciones reproducibles, permite una extracción consistente por regiones de interés y permite el procesamiento por lotes de múltiples entornos. En general, la aplicación proporciona un flujo de trabajo más rápido, objetivo y robusto para la detección y cuantificación de globulos que el enfoque manual tradicional. La solicitud está disponible a través de los autores a petición razonable.
    2. La imagen aparecerá en la Visualización Original de la Imagen. Navegue a la pestaña de Procesamiento. Aplique HiLo para mejorar los agregados/contraste de fondo (véase la Figura Suplementaria 2). Aplicar un umbral de brillo para filtrar los agregados del fondo (Figura suplementaria 3). Utiliza el filtro de tamaño mínimo para eliminar partículas pequeñas (ruido) (Figura suplementaria 4). Opcionalmente, aplicar el umbral de redondez para excluir formas no agregadas (Figura suplementaria 5).
    3. Para la detección de agregados IHC, ve a la pestaña General y haz clic en Calcular agregados totales y Calcular área de agregados. Todos los agregados detectados se resaltan y se listan en la Tabla de Matrices (ID, área, tamaño medio; Figura suplementaria 6).
  3. Correcciones manuales (opcionales)
    1. Ve a la pestaña de corrección, usa Smart Add para detectar automáticamente agregados en regiones seleccionadas (Figura suplementaria 8). Usa la suma manual para etiquetar los agregados manualmente. Usa Eliminación Inteligente para eliminar etiquetas no deseadas. (Los agregados resaltados se muestran para inspección visual; Figura suplementaria 7).
  4. Resultados de exportación
    1. Haz clic en exportar CSV para exportar los datos actuales de la imagen. Haz clic en Exportar Todo para exportar por lotes datos de varias imágenes analizadas. Analiza siempre imágenes bajo los mismos ajustes de brillo/contraste y otros parámetros (por ejemplo, umbral) entre grupos experimentales en IHCAggreCount.

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Resultados

Este estudio identificó con éxito la expresión de ataxina-2 y DARPP-32 utilizando el protocolo actual. Tras la inyección estereotáxica de vectores lentivirales en el estriado de ratones C57BL/6J, se detectó una expresión robusta tanto de ataxina tipo salvaje como mutante tras 12 semanas. Hemos demostrado previamenteen 12 que estos constructos son específicos de las neuronas, transduciendo efectivamente una media de 20.000 neuronas pormm3. Bajo ...

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Discusión

Este artículo describe la generación de un modelo ratón lentiviral estriatal para una SCA polyQ. También describe la producción de vectores lentivirales de alto título que codifican la forma salvaje y expandida de la proteína causal, y la inyección bilateral de los VE en el estriado del ratón mediante cirugía estereotáxica. Además, describe el procedimiento de recogida cerebral, el procesamiento histológico y la cuantificación basada en imágenes de las características de la enfe...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

El laboratorio de Clévio Nóbrega está financiado por el proyecto Cure CSB, por la Asociación Viljem Julijan para Niños con Enfermedades Raras (Eslovenia) y por el Instituto de Investigación del Centro Biomédico Algarve (ABC-Ri). Algunos de los autores de este artículo cuentan con una beca doctoral financiada por la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), con las siguientes referencias: Tiago Moreira-Gomes (2022.11008.BD), Inês T Afonso (2022.10161.BD) y Rafael G Costa (2022). 11973.BD).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.9% NaClProveedor local—Usado para la preparación de mezclas de anestesia y antagonistas
Platos de cultivo de tejido de 100 mmSPL Life Sciences11090
Kit ABC (Complejo Avidina-Biotina)VECTASTAIN Elite
Atipazole (5.0 mg/mL)Proveedor local—Antagonista de la medetomidina
Centrífuga de sobremesa--
Gabinete de bioseguridad, Clase II (compatible con BSL-2)--
Anticuerpo secundario biotinilado--
Albúmina sérica bovina (BSA)NZYTechMB47002
Secciones cerebrales (por ejemplo, secciones coronales de 30–40 µm) inmunohistoquímicamente teñidas para DARPP-32--
Plugin Contador de células (FIJI)Integrado / ImageJ—Herramienta para el conteo manual de agregados
Incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2, humidificado)--
Estación de trabajo informáticaProveedor local—Usado para el procesamiento de imágenes y la ejecución de software
Tubos de ultracentrifugación cónicosBeckman Coulter358126
Hisopos de algodónProveedor local—Usado para la eliminación del periostio
Criostato con soporte para discos de muestra--
DAB (Diaminobenzidina)--
Lector de coordenadas estereotáxicas digitalStoelting/WPI51725Pantalla digital para la medición de coordenadas
Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, glucosa alta)Gibco/Thermo Fisher11-965-092
Etanol 70, 96 y 100%--
Etanol, 70%Proveedor local—Para la desinfección del cuero cabelludo
Fentanilo (0.05 mg/mL)Proveedor local—Componente anestésico
Suero fetal bovino (FBS), inactivado por calorGibco/Thermo Fisher10500064
FIJI (distribución de ImageJ)NIH / ImageJhttps://fiji.sc/Software de código abierto para la cuantificación manual de agregados
Pinzas finas (para pellizco de dedos)Proveedor local—Para el monitoreo de la profundidad de la anestesia
Flumazenil (0.1 mg/mL)Proveedor local—Antagonista del midazolam
Pinzas y bisturíProveedor local—Para la eliminación del periostio y la exposición del cráneo
Jeringas de microlitro/herméticas Hamilton 700/1700 SeriesHamilton / Fisher Sci.7653-01/10550203Para la carga de solución viral
Agujas desmontables con pequeño mango Hamilton (26G)Hamilton / Fisher Sci.7804-03/ 10698205Para la administración viral
Almohadilla térmica (para roedores)Kent Scientific / SOMNIpor ejemplo 04-777-177Para mantener la temperatura corporal
Células HEK 293T (≤ paso 10, libres de micoplasma)ATCC o equivalenteCRL-3216
Peróxido de hidrógeno--
Software IHCAggreCountSuministrado bajo demandaN/ASoftware propietario interno para la detección y cuantificación semiautomatizada de agregados
Microscopio invertido (para confluencia celular)--
Mezclador de laboratorio--
Vectores lentivirales (WT y mutante)In-house / Core facilityN/ASolución viral para inyección
L-glutamina (200 mM)Gibco/Thermo Fisher25030081
Microscopio óptico con cámara (campo brillante)--
Medetomidina (1.0 mg/mL)Proveedor local—Componente anestésico
Microtaladro (compatible con estereotaxic)Stoelting / Proveedor local—Para craneotomía
Bomba de microinyección (por ejemplo, Stoelting)Stoelting/WPI53210Bomba de infusión automatizada para inyecciones virales
Micropipeta (P1000, P200, P10) y puntas--
Imágenes de microscopía (secciones de IHC)Generadas internamenteN/AImágenes de inmunohistoquímica a analizar
Cuchillas de microtomo (de bajo perfil, desechables)--
Midazolam (5.0 mg/mL)Proveedor local—Componente anestésico
Medio de montaje--
Naloxone (0.4 mg/mL)Proveedor local—Antagonista del fentanilo
Portaagujas y agujas de disección fina--
Suero de cabra normal (NGS)--
Compuesto O.C.T.Tissue-Tek
Ungüento oftálmico (Ungüento de Ojo y Nariz Bepanthen, 5% Dexpanthenol)Bayer11568-0053Previene el secado de la córnea durante la cirugía
Mezclador orbital--
Kit ELISA p24ZeptoMetrix0801111
Parafilm--
Paraformaldehído (PFA)--
PBS--
PBS sin Ca2+/Mg2+, pH 7.0Gibco/Thermo Fisher10-010-031
pCMV-dR8.2AddgenePlasmid #12263
Penicilina-Estreptomicina (100×)Gibco/Thermo Fisher15140122
Pentobarbital--
Fenilhidrazina--
pMD2.GAddgenePlasmid #

Referencias

  1. Afonso-Reis, R., Afonso, I. T., Nóbrega, C. Current Status of Gene Therapy Research in Polyglutamine Spinocerebellar Ataxias. Int J Mol Sci. 22 (8), 4249(2021).
  2. Durr, A. Autosomal dominant cerebellar ataxias: polyglutamine expansions and beyond. Lancet Neurol. 9 (9), 885-894 (2010).
  3. McIntosh, C. S., Li, D., Wilton, S. D., Aung-Htut, M. T. Polyglutamine Ataxias: Our Current Molecular Understanding and What the Future Holds for Antisense Therapies. Biomedicines. 9 (11), 1499(2021).
  4. Henriques, C., et al. Viral-based animal models in polyglutamine disorders. Brain. 147 (4), 1166-1189 (2024).
  5. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The Construction of Transgenic and Gene Knockout/Knockin Mouse Models of Human Disease. Transg Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  6. Tello, J. A., Williams, H. E., Eppler, R. M., Steinhilb, M. L., Khanna, M. Animal Models of Neurodegenerative Disease: Recent Advances in Fly Highlight Innovative Approaches to Drug Discovery. Front Mol Neurosci. 15, 883358(2022).
  7. Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. Development of a gene therapy with lentiviral vectors for spinocerebellar ataxias. Methods Mol Biol. 2974, 215-225 (2026).
  8. Parr-Brownlie, L. C., et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 8, 14(2015).
  9. Zwi-Dantsis, L., Mohamed, S., Massaro, G., Moeendarbary, E. Adeno-Associated Virus Vectors: Principles, Practices, and Prospects in Gene Therapy. Viruses. 17 (2), 239(2025).
  10. Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. From the disruption of RNA metabolism to the targeting of RNA-binding proteins: The case of polyglutamine spinocerebellar ataxias. J Neurochem. 168 (8), 1442-1459 (2024).
  11. Matsuzaki, Y., Oue, M., Hirai, H. Generation of a neurodegenerative disease mouse model using lentiviral vectors carrying an enhanced synapsin I promoter. J Neurosci Meth. 223, 133-143 (2014).
  12. Marcelo, A., et al. Autophagy in Spinocerebellar ataxia type 2, a dysregulated pathway, and a target for therapy. Cell Death Dis. 12 (12), 1117(2021).
  13. Alves, S., et al. Striatal and nigral pathology in a lentiviral rat model of Machado-Joseph disease. Human Mol Genet. 17 (14), 2071-2083 (2008).
  14. Alves, S., et al. Lentiviral vector-mediated overexpression of mutant ataxin-7 recapitulates SCA7 pathology and promotes accumulation of the FUS/TLS and MBNL1 RNA-binding proteins. Mol Neurodegenerat. 11 (1), 58(2016).
  15. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6 (1), 34(2006).
  16. Arrasate, A., et al. Establishment and Characterization of a Stable Producer Cell Line Generation Platform for the Manufacturing of Clinical-Grade Lentiviral Vectors. Biomedicines. 12 (10), 2265(2024).
  17. Nóbrega, C., et al. Overexpression of Mutant Ataxin-3 in Mouse Cerebellum Induces Ataxia and Cerebellar Neuropathology. Cerebellum. 12 (4), 441-455 (2013).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Compact Second Edition, Gulf Professional Publishing. (2004).
  19. Bateup, H. S., et al. Distinct subclasses of medium spiny neurons differentially regulate striatal motor behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14845-14850 (2010).
  20. Nóbrega, C., et al. Molecular hallmarks of neurodegeneration in polyglutamine spinocerebellar ataxias. Cell Death Dis. 16 (1), 826(2025).
  21. Murakami, Y., et al. AAV-based gene therapy ameliorated CNS-specific GPI defect in mouse models. Mol Ther Meth Clin Dev. 32 (1), 101176(2024).
  22. Wada, H., et al. AAV-based gene therapy ameliorates neurological deficits in a mouse model of childhood-onset neurodegeneration with cerebellar atrophy. Mol Ther J Am Soc Gene Ther. 33 (11), 5829-5839 (2025).
  23. Konno, A., Shinohara, Y., Hirai, H. Production of Spinocerebellar Ataxia Type 3 Model Mice by Intravenous Injection of AAV-PHP.B Vectors. Int J Mol Sci. 25 (13), 7205(2024).
  24. Jansen-West, K., et al. Plasma PolyQ-ATXN3 Levels Associate With Cerebellar Degeneration and Behavioral Abnormalities in a New AAV-Based SCA3 Mouse Model. Front Cell Dev Biol. 10, 863089(2022).
  25. Nóbrega, C., Mendonça, L., Matos, C. A. A Handbook of Gene and Cell Therapy. , Springer International Publishing. Cham. (2020).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Ther. 24 (2), 132-142 (2013).
  28. de Almeida, L. P., Ross, C. A., Zala, D., Aebischer, P., Déglon, N. Lentiviral-Mediated Delivery of Mutant Huntingtin in the Striatum of Rats Induces a Selective Neuropathology Modulated by Polyglutamine Repeat Size, Huntingtin Expression Levels, and Protein Length. J Neurosci. 22 (9), 3473-3483 (2002).
  29. Fisher, E. M. C., Bannerman, D. M. Mouse models of neurodegeneration: Know your question, know your mouse. Sci Transl Med. 11 (493), eaaq1818(2019).
  30. Bii, V. M., Collins, C. P., Hocum, J. D., Trobridge, G. D. Replication-incompetent gammaretroviral and lentiviral vector-based insertional mutagenesis screens identify prostate cancer progression genes. Oncotarget. 9 (21), 15451-15463 (2018).
  31. Alves-Cruzeiro, J. M. D. C., Mendonça, L., Pereira de Almeida, L., Nóbrega, C. Motor Dysfunctions and Neuropathology in Mouse Models of Spinocerebellar Ataxia Type 2: A Comprehensive Review. Front Neurosci. 10, 572(2016).

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