Artículo de método

Análisis de trazadores de isótopos estables de vitamina A usando LC-MS/MS

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DOI:

10.3791/69558

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30 de diciembre de 2025

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1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Newcastle University Centre for Cancer, 3Fera Science Ltd

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar simultáneamente tanto retinoides marcados isotópicamente como nativos en plasma humano, utilizando LC-MS/MS, con límites de detección de 6 fmol en columna. El método incorpora un procedimiento sencillo de extracción de muestras y un tiempo analítico corto, lo que permite un alto rendimiento de muestras.

Resumen

El método de dilución de isótopos de retinol (RID) estima las reservas corporales totales (TBS) de vitamina A en humanos mediante dilución estable de isótopos con la reserva de vitamina A del cuerpo. Para ello, es fundamental determinar con precisión y eficiencia la proporción isotópica plasmática entre retinol marcado y no marcado mediante espectrometría de masas. Para evitar procedimientos extensos y lentos de extracción y/o purificación, como HPLC preparativos y derivatización, se emplea LC-MS/MS para realizar análisis rápidos, sensibles y simultáneos de retinoides marcados y no marcados. El método utiliza dos niveles de detección: (i) una separación inicial masa/carga (m/z) de iones padres (precursores), seguida de (ii) detección de iones hijos (producto) fragmentados. Esto resulta en una alta sensibilidad, con límites de detección de retinol tan bajos como 6 fmol en columna. A pesar de las ventajas de la espectrometría de masas tándem, se requiere una separación cromatográfica líquida para separar el retinol de los ésteres retinilo, ya que los grupos funcionales terminales se pierden durante la ionización, lo que resulta en patrones de fragmentación de iones parentales (m/z de 269) y hijos similares. El artículo describe el aislamiento de retinol endógeno y marcado (13C o 2H) del plasma mediante extracción con disolvente, seguido de la cuantificación por LC-MS/MS bajo ionización química a presión atmosférica (APCI) en modo iónico positivo.

Introducción

La vitamina A es un nutriente liposoluble esencial para la saludhumana 1. La deficiencia de vitamina A aumenta la susceptibilidad a morbilidad y mortalidad infecciosa graves y se estima que tiene una prevalencia global del 29%, con niveles más altos en África subsahariana (48%) y Asia del Sur (44%)2. La suplementación con vitamina A es una estrategia eficaz para reducir la mortalidad infantil excesiva, especialmente en zonas de alto riesgo como el Áfricasubsahariana. Sin embargo, la introducción de la suplementación semestral con vitamina A junto con la fortificación a gran escala de vitamina A de alimentos básicos y la distribución de polvo de micronutrientes, que a menudo se gestionan a través de diferentes entidades públicas y privadas, tiene el potencial de exponer a las personas a un consumo excesivo de vitaminaA 4,5,6,7,8,9,10 . Por tanto, los biomarcadores de vitamina A deberían idealmente poder cubrir todo el espectro del estado de vitamina A, desde la deficiencia hasta la toxicidad. El método de dilución de isótopos de retinol (RID) es actualmente el método indirecto más preciso para evaluar las reservas totales de vitamina A en humanos 11,12,13 y ha sido validado frente a concentraciones hepáticas de vitamina A, consideradas el mejor marcador bioquímico del estado de vitamina A 14,15. El método se basa en el principio de que una dosis de trazador oral de vitamina A estable marcada como isótopos se mezcla con la vitamina A no etiquetada (la traza) en reservas corporales intercambiables. La medición de la actividad específica del retinol plasmático (es decir, la proporción entre el trazador de retinol marcado y el retinol total en plasma (trazador/traza en plasma)) en un momento especificado tras la dosificación permite estimar el estado de vitamina A utilizando una ecuación deRID 11,12,13.

Para determinar concentraciones precisas y precisas tanto de trazador como de traza de retinol en plasma, se han aplicado diversos métodos para cuantificar la vitamina A estable marcada con isótopos, incluyendo cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), espectrometría de masas de razón isotópica (IRMS) y espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC-MS/MS)16,17,18,19,20,21,22,23, 24, 25, 26. Es importante destacar que LC-MS/MS combina alta sensibilidad, especificidad y simplicidad operativa con la capacidad de medir directamente tanto retinol nativo como marcado en matrices complejas. Por tanto, para evitar una preparación de muestras que consume mucho tiempo, como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) preparativa para IRMS o la derivatización para GC-MS, el análisis LC-MS/MS es una opción ideal, ya que este método implica un procedimiento de extracción sencillo, límites de detección muy bajos para isótopos estables y tiempos de ejecucióncortos 7,18,19. Aquí presentamos un método LC-MS/MS actualizado con menor duración y flujos de trabajo sencillos combinados con alta sensibilidad y selectividad, como un método altamente adecuado para el análisis de alto rendimiento de muestras de intervención humana a gran escala y estudios observacionales, donde se requiere la determinación de las reservas totales de vitamina A en el cuerpo.

Protocolo

El estudio fue aprobado por la Junta de Ética en la Investigación de la Universidad de Filipinas, Manila (ID IRB: UPMREB 2016-282-01), la Junta de Revisión Institucional de la UC, Davis (ID IRB: 903681-2), y fue registrado en ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). El estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Ética de los Servicios de Salud de Ghana (GHS-ERC 012/07/20), y el ensayo fue registrado en https://clinicaltrials.gov como NCT04632771.

1. Preparación de normas internas

  1. Solución interna estándar de stock: Preparar la solución interna de stock a una concentración de 1 mg/mL de acetato de retinilo en etanol que contenga 0,1% de hidroxitolueno butilado (BHT; w/v). Divide las soluciones originales en alicotas y guárdalas a -80 °C durante hasta 3 meses.
    NOTA: Para el estándar interno, es factible usar acetato de retinilo no marcado o acetato de retinilo etiquetado. Si se utiliza un estándar de acetato de retinilo no marcado, es vital obtener la resolución basal de los picos de acetato de retinilo y retinol (véase la Figura 1).
  2. Solución de trabajo estándar interna: Preparar una solución de trabajo estándar interna diluyendo el estándar estándar (1 mg/mL) a 1 μg/mL. Primero, diluir 60 μL del estándar de stock con 300 μL de etanol, seguido de diluir 60 μL de esta solución en 10.000 μL de etanol. Por cada muestra, se añaden 20 μL de la solución estándar interna de trabajo, que contiene 20 ng de acetato de retinilo.
    NOTA: Las soluciones de trabajo estándar internas pueden almacenarse a -20 °C durante hasta 1 semana.

2. Preparación de estándares de calibración

  1. Estándar de stock de calibración: Preparar las soluciones estándar de stock de calibración a una concentración de 1 mg/mL de retinol en etanol que contenga 0,1% BHT (p/v) tanto para la traza como para el trazador. Aliquot stock solutions y almacenan a -80 °C durante hasta 3 meses. Solo usa cada alicuota una vez para evitar ciclos de congelación y descongelación.
  2. Solución de trabajo estándar de calibración: Extraer 100 μL de la solución estándar de stock de calibración y diluir con 10.000 μL de etanol en un matraz volumétrico. Determina la concentración de la solución de calibración diluida a 325 nm en un espectrofotómetro usando una cubetas de cuarzo (véase la Tabla 1 para más detalles).
  3. Tome una alitería del estándar de calibración diluido y ajuste la concentración a 8 μM para la traza y a 2 μM para el trazador usando 50% etanol y 50% acetonitril/dH 2O (70:30 (v/v).
  4. Prepara estándares de calibración duplicados a siete concentraciones diferentes usando 50% de etanol y 50% acetonitrilo/dH 2O (70:30 (v/v). Si se extraen 200 μL de plasma, los estándares de calibración de trazas deben ir de 6 μM a 0,03 μM, y los estándares de calibración de trazadores deben ir de 0,5 μM a 0,004 μM.
    NOTA: Para una cuantificación precisa, el retinol y ésteres de retinilo marcados isotópicamente en plasma se cuantifica utilizando curvas de calibración duplicadas de 7puntos 27. El punto más alto de la curva de calibración (el doble de la concentración esperada más alta de la traza y el trazador en el plasma) considera el factor de concentración del extracto reconstituido a partir del volumen original del plasma.

3. Extracción de retinoides del plasma

  1. Retira muestras de plasma del congelador a -80 °C y descongela a temperatura ambiente (aproximadamente 30 minutos).
  2. Una vez descongelada, haz un vórtice en cada muestra y haz girar durante unos segundos para asegurarte de que no queda plasma en la tapa. Después, coloca las muestras en hielo.
  3. Enciende una centrífuga refrigerada y déjala enfriar hasta 4 °C. Etiqueta tubos de vidrio de 15 mL con tapones de rosca (ID del sujeto y punto de tiempo) y haz una pipeta de 200 μL de agua desionizada (dH2O) en cada tubo de muestra.
  4. Desde la solución de trabajo estándar interna, se extraen 20 μL de la mezcla estándar interna en el tubo de vidrio.
  5. Utilizando una pipeta, dispensa 200 μL de plasma en el tubo correspondiente que contiene el estándar interno ydH 2O.
  6. Pipete 400 μL de etanol en cada tubo de muestra y haz girar el tubo para mezclar el etanol con el plasma. No hagas vórtices para evitar que los residuos de proteínas se queden pegados a la pared de cristal.
  7. Para la primera extracción de hexano, añade 2 mL de hexano a cada tubo y sujeta firmemente las tapas del tubo.
  8. Coloca los tubos en un agitador orbital y agita a 15.000 rpm durante 30 minutos. Transfiere los tubos a una centrífuga refrigerada y centrifuga a 1.800 x g durante 10 minutos a 4 °C.
  9. Utilizando pipetas Pasteur de vidrio, transfiere el sobrenadante a un juego limpio de tubos de ensayo de vidrio etiquetados. Ten cuidado de no transferir proteínas, precipitados ni agua.
  10. Produce una segunda extracción de hexano añadiendo otros 2 mL de hexano al residuo restante, sujeta firmemente las tapas de los tubos y coloca los tubos en el agitador orbital y agita a 15.000 rpm durante 15 minutos.
  11. Transfiere los tubos a una centrífuga refrigerada y centrifuga a 1.800 x g durante 10 minutos a 4 °C. Utilizando pipetas Pasteur de vidrio, transfiere el sobrenadante al tubo de ensayo de vidrio que contiene el sobrenadante de la primera extracción de hexano (paso 3.9) para cada muestra, respectivamente.
  12. Evapora el disolvente combinado de extracción hexana (primer y segundo sobrenadante de extracción para cada muestra) bajo un suave chorro de N2 en una campana extractora oscurecida durante aproximadamente 30 minutos. Pon el bloque calefactor a 35 °C.
  13. Suspender el residuo seco en 50 μL de etanol, usar un vórtice brevemente y añadir 50 μL de fase móvil (70:30 acetonitrilo/dH 2O (v/v)) y volver a usar vórtice.
    NOTA: La resuspensión del residuo seco debe realizarse utilizando 100 μL de etanol solo si el objetivo es cuantificar ésteres de retinilo.
  14. Transfiere a tubos microcentrífugas etiquetados de 0,5 mL. Centrifuga a 16.900 x g durante 5 minutos.
  15. Transfiere 80 μL del residuo reconstituido a viales de HPLC ámbar con insertos de 300 μL. Tapa inmediatamente el vial para evitar la pérdida de disolvente por evaporación.
  16. Transfiere los viales de vidrio a una criobox, etiquétalos con el nombre del estudio, la fecha de extracción y los identificadores de la muestra, y guárdalos en un congelador a -80 °C hasta el análisis.
    NOTA: El análisis de las muestras almacenadas debe completarse en un plazo de 3 a 5 días. Un volumen plasmático de 200 μL es normalmente suficiente para detectar el trazador de vitamina A marcado hasta 90 días después de la dosis. Sin embargo, el volumen del plasma puede ajustarse a 400 μL si las proporciones de plasma/agua/etanol se mantienen en 1:1:2 en volumen.

4. Preparación de muestras internas de control estándar

  1. Preparar la solución de etanol/fase móvil pipeteando 120 μL de etanol en un tubo de microcentrífuga y añadiendo 200 μL de acetonitrilo/dH2O (v/v) y vórtice.
  2. En tres tubos separados de 0,6 mL, se pipeten 20 μL de la solución de trabajo estándar interna.
  3. Añadir 80 μL de etanol/solución de fase móvil preparada y vórtice. Transfiere las tres muestras de control estándar interno a viales HPLC ámbar con inserciones de 300 μL y tapa inmediatamente los viales para evitar la pérdida de disolventes por evaporación.

5. Estándares de casas de plasma

  1. Para preparar las muestras estándar de la casa, obtener suficiente volumen de plasma para permitir el análisis de un mínimo de tres muestras por ejecución analítica. El volumen total de plasma requerido se determina por el número de muestras que deben ser analizadas.
  2. Las alicuotas almacenan plasma estándar en pequeños crioviales en los volúmenes necesarios para cada ejecución analítica y se almacenan a -80 °C.
    NOTA: Es fundamental que el estándar de la casa contenga el trazador de retinol marcado con isótopos utilizado en las muestras desconocidas. Se puede obtener suficiente material agrupando muestras de voluntarios en una sola alicuota.
  3. Extraer al menos tres muestras estándar de plasma para cada análisis al mismo volumen que muestras de plasma desconocidas, como se hace en el paso 3.
  4. Coloca los estándares de la casa de plasma por todo el estante de muestras con al menos 10 muestras de plasma desconocidas entre ellos. Utiliza estándares de casa de plasma para calcular variaciones intra- e interdías.

6. Muestras estándar externas

  1. Obtén muestras certificadas externas estándar y guárdalas a -80 °C. Un estándar externo certificado ampliamente utilizado es el Material de Referencia Estándar del NIST SRM 968.
  2. Extraer al menos cuatro muestras estándar externas de plasma por análisis al mismo volumen que muestras de plasma desconocido usando el paso 3. Utiliza muestras estándar externas para verificar la precisión de los resultados obtenidos.

7. Optimización manual de compuestos

  1. Asegúrese de que la sonda del nebulizador calentado APCI esté instalada en la carcasa de la fuente MS. Prepara la solución de infusión para cada trazador de isótopos estables a aproximadamente 1 μg/mL.
    NOTA: La solución debe ser similar a la fase móvil y debe contener algo de ácido para la protonación. Un buen disolvente sería acetonitrilo/dH 2O1:1 con 0,1% de ácido fórmico (v/v).
  2. Llena una jeringuilla Luer-lock Hamilton de 1 mL con la solución de infusión, luego conecta la jeringuilla a la fuente con un tubo PEEK mediante la unión de tierra. Ajusta el caudal de infusión a 10 μL/s.
  3. Selecciona Afinación Manual y asegúrate de que el instrumento esté en modo Afinación y Calibración. Inicia la bomba de jeringuilla y selecciona el tipo de escaneo Q1 en modo positivo.
  4. Se fija un rango de masas inferior de 50 Da, y un rango de masa superior aproximadamente 100 Da por encima de la masa molecular del compuesto objetivo.
  5. Ajusta los ciclos a 500, velocidad de escaneo a 200 Da/s. Haz clic en Iniciar y observa la señal en la ventana del espectro de masas.
  6. Espera a que la señal se estabilice y luego comprueba que aparecen los picos esperados de m/z. Consideremos los picos [M+H]+ y [M+2H]2+ ya que el MS está en modo positivo.
  7. La altura máxima objetivo debería estar alrededor de 1e6. La corriente iónica total (TIC) debería ser 1e7-1e9. Sigue infusionando hasta que la señal sea estable, luego haz clic en Detener. Debe haber un pico distintivo con alta intensidad que se forme a partir del compuesto en la solución de infusión. Se muestra la corriente total de iones (TIC), que muestra la señal total de todos los iones combinados.
    NOTA: la masa esperada de 12C Retinol es de 269 Da, por lo que un rango de 50-300 Da es apropiado para mostrar los iones [M+H]+ y [M+2H]2+ .

8. Escaneo de iones producto (MS2) / comprobación de espectros CE

  1. Coloca la masa inicial en una masa menor, por ejemplo, 50 Da, y la masa de oclusión justo por encima de la masa Q1 (por ejemplo, 269,1 para retinol 12C). Configura los ciclos a 5 y cambia la energía de colisión (CE) a 10. Comprueba la masa Q1 como ion precursor. Si no aparecen fragmentos más pequeños, aumenta CE a 20.
  2. A medida que aumenta la CE, se formarán más iones producto. Continúa aumentando la CE hasta que el ion precursor a la derecha del espectro desaparezca por completo. Aumenta aún más la CE para ver posible fragmentación secundaria.

9. Escaneo MRM

  1. En el escaneo MS2, selecciona los tres iones producto más abundantes o más apropiados para llevar y optimizar mejor.
  2. Para cada ion producto, introduzca la masa Q1 (precursor) y las masas Q3 (producto) encontradas. Pon el tiempo de permanencia a 200 ms. Nombra cada fragmento en consecuencia (por ejemplo, 12C_Frag_93).
  3. Selecciona la energía de colisión e identifica el valor óptimo de CE utilizando la característica de rampa. Llena la columna CE con el valor CE optimizado para cada fragmento.
  4. Optimizar el Potencial de Desagrupamiento (DP) optimizado tras optimizar la CE para minimizar las interferencias isobáricas. Optimiza el Potencial de Salida de la Celda de Colisión (CXP) para una transición a la vez.

10. Optimización de fuente/gas

  1. Estos parámetros no pueden optimizarse automáticamente. Si necesitas mejorar la intensidad de la señal, realiza un proceso de optimización manual. Cambia un parámetro a la vez y compara si la señal ha aumentado, se ha mantenido igual o ha disminuido.

11. Condiciones de cromatografía líquida

  1. Para la cromatografía, se utiliza un gradiente de fase binario móvil de 0,1% (v/v) de ácido fórmico endH 2O (A) y 0,1% (v/v) de ácido fórmico en acetonitrilo (B).
  2. Dependiendo del sistema LC aplicado, se utiliza una columna ABZ PLUS de 100 mm x 2,1 mm (3 μm) equipada con un cartucho C18 de 4 mm x 2 mm (para HPLC), o un escudo Premier BEH de 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) equipado con una columna FIT RP18 (para cromatografía de ultraalta presión (UPLC)) para el análisis del retinol. Mantener las columnas a una temperatura de 40 °C o 50 °C, respectivamente.
  3. Inyecta 10 μL del extracto de plasma en la columna. Analitos elutos a un caudal de 0,4 mL/min. Para sistemas HPLC, el gradiente lineal es: 60% B a 95% B en 6,0 min; 100% B de 6,1 min a 13,0 min; 100% B a 60% B de 13,1 a 14,0 min; y 60% B de 14,0 a 17,0 min. Para los sistemas UPLC, el gradiente lineal depende de la pregunta de investigación. Si solo se determina retinol, el gradiente es: 40% B a 60% B en 1,0 min; 60% B a 95% B de 1,0 min a 6,0 min; 100% B de 6,5 minutos a 7,5 minutos; 100% B a 40% B de 7,5 a 7,6 min; y 40% B de 7,6 a 8,5 min. Si el objetivo es también analizar ésteres de retinilo junto con el retinol, el gradiente lineal es: 60% B a 95% B en 3,0 minutos; 100% B de 3,5 a 6,5 min; 100% B a 60% B de 6,5 a 7,0 min; y 60% B de 7,0 a 8,5 min.

12. Condiciones de EM/EM

  1. Realizar análisis MS/MS bajo ionización química (APCI) a presión atmosférica en modo de iones positivos. El APCI se elige frente a la ionización por electropulverización, ya que proporciona una mayor intensidad de señal, un rango lineal más amplio y ofrece un menor ruidode fondo 26.
  2. Para las respectivas transiciones de masa para [12C]retinol, [13C10]retinol y [2H6]retinol y sus respectivos ésteres/acetato con parámetros seleccionados de monitorización de reacciones (SRM) para el API4000 y el espectrómetro de masas QTRAP 5500, consulte la Tabla 2, la Tabla 3 y la Figura 2.
    NOTA: El seguimiento selecto de iones para retinol, ésteres de retinilo y acetato de retinilo fue el mismo fragmento de ion m/z 269 para la cuantificación APCI, ya que este ion corresponde a la pérdida de agua, ácidos grasos o ácido acético de las moléculas protonadas. Dado que el LC-MS/MS puede separar los picos de retinol de sus ésteres, una única inyección permite determinar el enriquecimiento isótópico tanto en las fracciones de retinol como en las fracciones de éster retinilo en una sola muestra.

13. Cuantificación del retinol

  1. Cuantificar las concentraciones de muestras de retinol [12C], [2H6] y [13C10] de retinol según sus respectivos estándares de calibración.
  2. Determinar las pérdidas de extracción utilizando la recuperación de las concentraciones estándar internas de cada muestra frente a las muestras de control estándar internas.
  3. Realizar la confirmación de las concentraciones plasmáticas de retinol utilizando el material de referencia estándar (SRM) 968 del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST).

Resultados

Para ilustrar la eficacia del método analítico para analizar retinol marcado con isótopos estables en diferentes sistemas cromatográficos, presentamos resultados de dos estudios distintos.

Para el uso del API4000 con HPLC inicial, se analizaron muestras de plasma de 111 niños filipinos de entre 12 y 18 meses, que recibieron una dosis oral de 400 μg (1,17μmol) [13 C10] acetato de retinilo en el día 0, seguida de una toma de 6 mL de sangre a los 4 días posteriores a la dosis, 7,28. Las concentraciones medias plasmáticas de retinol total fueron de 1,1 μmol/L, y la media [13C10] de retinol fue de 0,007 μmol/L. Dado que el nivel de ruido de fondo dentro de la transición m/z 279 a 100 tenía una altura media máxima de ~50 cps (Figura 1), el nivel de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) para el retinol [13C10] se establecieron en 150 cps y 500 cps, correspondientes a 6 fmol y 19 fmol en columna, respectivamente. Dado que se obtuvo una buena resolución basal entre el retinol [12C] y el estándar interno aplicado de acetatos de retinilo, no fue necesario utilizar un acetato de retinilo marcado con isótopos estable.

Se puede lograr una separación cromatográfica más rápida usando UPLC en combinación con el QTRAP 5500, con tiempos de funcionamiento inferiores a 10 minutos. Dependiendo de la pregunta de investigación, se pueden aplicar dos métodos de separación diferentes; (i) si el objetivo es determinar retinol marcado por isótopos nativo y isótopo aplicado con un estándar interno no marcado de acetato-retinilo, los tiempos de retención entre retinol (4,37 min) y acetato-retinilo (5,33 min) proporcionan una buena separación de la línea base (Figura 3); (ii) si el objetivo es separar el retinol nativo y marcado con isótopos junto con ésteres de retinilo nativos y marcados, se puede lograr una buena separación en una carrera de 8,5 minutos (Figura 4). Sin embargo, debido a los tiempos de retención reducidos entre el retinol (2,10 min) y el acetato de retinilo (2,43 min), se recomienda utilizar acetato de retinilo marcado isotópicamente ([2H4] acetato de retinilo). En este ejemplo, se analizaron muestras de suero de 80 mujeres ghanesas en edad reproductiva que recibieron una dosis equivalente de retinol de 2 mg de acetato de retinilo [2H6], seguida de una toma de sangre a los 21 días posteriores a la dosis. Las concentraciones medias de retinol total sérico fueron de 1,89 μmol/L, con retinol media [2H6] de 0,027 μmol/L y retinol media [13C10] de 0,025 μmol/L.

El método presentado logró un bajo nivel de detección (LOD = 6 fmol; LOQ = 19 fmol en columna), demostrando alta sensibilidad y especificidad para detectar retinol estable marcado con isótopos y clara separación basal entre retinol nativo y estándares internos. Además, el método funcionó eficazmente tanto con sistemas HPLC como UPLC, a pesar de las diferencias en los tiempos de retención. El uso de estándares internos marcados isotópicamente ([2H4] acetato de retinilo) aseguró una cuantificación precisa bajo condiciones de UPLC más rápidas, si era necesario determinar ésteres de retinilo. La validación frente a los estándares de referencia certificados por el NIST confirmó la exactitud, mientras que los coeficientes de variación intradía e interdía (2,3% y 4,4%, respectivamente) demostraron una excelente precisión y reproducibilidad. El análisis exitoso de muestras de plasma/suero de dos poblaciones distintas (niños filipinos y mujeres ghanesas) con protocolos de dosificación diferentes muestra robustez y utilidad práctica en diversos estudios nutricionales.

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Figura 1: Cromatógrama LC-MS/MS usando el espectrómetro de masas API4000. El cromatograma de retinol sérico se obtuvo 4 días después de la ingestión oral de 0,4 mg de acetato de retinilo [13C10]. El monitoreo de reacción seleccionada (SRM) de m/z 269 a 93 muestra la separación de retinol [12C] (RT = 5,06 min) y acetato de retinilo [12C] (RT = 5,83 min) como estándar interno (IS). La señal de retinol [13C10] en m/z 279 a 100 supera suficientemente tanto el límite de detección (LOD) como el límite de cuantificación (LOQ). Condiciones cromatográficas: (A) gradiente de fase binario de la célula móvil de 0,1% (v/v) de ácido fórmico en dH2O y (B) 0,1% (v/v) de ácido fórmico en acetonitrilo; caudal de 0,4 mL/min con un gradiente lineal de: 60% B a 95% B en 6,0 min; 100% B de 6,1 min a 13,0 min; 100% B a 60% B de 13,1 a 14,0 min; y 60% B de 14,0 a 17,0 min; Columna ABZ PLUS de 100 mm x 2,1 mm (3 μm), equipada con un cartucho C18 de 4 mm x 2 mm mantenido a 40 °C. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Espectros de masa de iones producto APCI-MS/MS. Espectros de masa de los productos APCI-MS/MS por inyección de flujo de (A) m/z 269 [12C] retinol, (B) m/z 273 [2H4] retinol, (C) m/z 275 [2H6] retinol, y (D) m/z 279 [13C10] retinol en modo iónico positivo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Cromatógrama LC-MS/MS usando el espectrómetro de masas QTRAP 5500. Cromatógrama LC-MS/MS de un extracto típico de un plasma de casa estándar muestreado 21 días después de la ingestión oral de 1,0 mg de acetato de retinilo [2H6] y 90 días tras la ingestión oral de 1,0 mg de acetato de retinilo [13C10]. El monitoreo de reacción seleccionada (SRM) de m/z 269→93 muestra el pico de retinol [12C] (RT = 4,37 min) y acetato de retinilo (RT = 5,33 min) como estándar interno (IS); el retinol [2H6] (RT = 4,36 min) a m/z 275→96; y el pico de retinol [13C10] (RT = 4,38) en m/z 279→100. Condiciones cromatográficas: (A) gradiente de fase binario de la célula móvil del 0,1% (v/v) de ácido fórmico endH 2O y (B) 0,1% (v/v) de ácido fórmico en acetonitrilo; caudal de 0,4 ml/min con un gradiente lineal de: 40% B a 60% B en 1,0 min; 60% B a 95% B de 1,0 min a 6,0 min; 100% B de 6,5 minutos a 7,5 minutos; 100% B a 40% B de 7,5 a 7,6 min; y 40% B de 7,6 a 8,5 min; Columna FIT AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT de 100 mm x 2,1 mm x 2,1 mm, mantenida a 50°C. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Cromatógrama LC-MS/MS de retinol y ésteres de retinilo usando el espectrómetro de masas QTRAP 5500. Cromatógrama LC-MS/MS de un extracto típico de plasma se muestreó de forma estándar 6 h después de la ingestión oral de 1,0 mg de acetato de retinilo [2H6] y 90 días después de la ingestión oral de 1,0 mg de acetato de retinilo. La monitorización de reacción seleccionada (SRM) de m/z 269→93 muestra el pico de [12C]retinol (RT = 2,10 min); el [2H4]acetato de retinilo a m/z 273→94 (RT = 2,43 min) como estándar interno (IS); la separación del retinol [2H6]retinol (RT = 2,09 min) y [2H6]palmitato de retinilo (RT = 5,11 min) alcanza su máximo en m/z 275→96; y el pico de retinol [13C10] (RT = 2,10) en m/z 279→100. Condiciones cromatográficas: (A) gradiente de fase binario de la célula móvil del 0,1% (v/v) de ácido fórmico endH 2O y (B) 0,1% (v/v) de ácido fórmico en acetonitrilo; caudal de 0,4 ml/min con un gradiente lineal de: 60% B a 95% B en 3,0 min; 100% B de 3,5 a 6,5 min; 100% B a 60% B de 6,5 a 7,0 min; y 60% B de 7,0 a 8,5 min; Columna FIT AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT de 100 mm x 2,1 mm (1,1 mm) y mantenida a 50 °C. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Parámetros
Absorción molar (ɛ) del retinol en etanol:52.770 M-1 cm-1
Factor de dilución:100 (100 μL de estándar de calibración de serie en 10 mL de etanol)
Absorbancia media medida:0.575
Cálculo
Concentración (mol) de [12] C]retinol en etanol:Concentración (mol) = Absorción / ɛ x Longitud de la cubeta.
= 0,575 / 52770 M-1 cm-1 x 1 cm = 1,09 x 10-5 M
Corregir por dilución:1,09 x 10-5 M x 100 = 1,09 x 10-3 M o 1,09 mM

Tabla 1: Determinación de la concentración estándar de calibración del stock de retinol.

AnalitoTransiciones MRM (m/z)Potencial de desagrupamiento (V)Potencial de entrada (V)Energía de colisión (eV)Potencial de salida de colisión (V)
[12C]-retinol/ésteres269→935110276
[2H4] acetato de retinilo273→945110276
[2H6] retinol/ésteres275→965110276
[13C10]-retinol/ésteres279→1004110276

Tabla 2: Parámetros seleccionados de monitorización de la reacción (SRM). Parámetros para [12C] retinol, [13C10] retinol y [2H6] retinol y sus respectivos ésteres usando el API4000

AnalitoTransiciones MRM (m/z)Potencial de desagrupamiento (V)Potencial de entrada (V)Energía de colisión (eV)Potencial de salida de colisión (V)
[12C]-retinol/ésteres269→939410338
[2H4] acetato de retinilo273→9454102011
[2H6] retinol/ésteres275→966910253
[13C10]-retinol/ésteres279→10010210359

Tabla 3: Parámetros seleccionados de monitorización de la reacción (SRM). Parámetros para [12C] retinol, [13C10] retinol y [2H6] retinol y sus respectivos ésteres usando el QTRAP 5500

Discusión

El método LC-MS/MS presentado ofrece una sensibilidad extremadamente alta, con límites de detección tan bajos como 6 fmol/L, lo que permite a los investigadores utilizar tan solo 100 - 200 μL de plasma19. Este método de esclerosis múltiple en tándem dirigido es especialmente eficaz para confirmar la identidad de isotopólogos de retinoides cuando se utilizan iones tanto cuantificadores como de productocalificador 18. Sin embargo, dado que los retinoides marcados con isótopos están presentes en concentraciones sustancialmente más bajas que los retinoides fisiológicos no marcados, las muestras de plasma que contienen retinol y ésteres de retinil marcados pueden requerir un paso adicional de concentración. Esta necesidad depende de factores como el momento en que se realiza la muestra de sangre tras la aplicación, la concentración de trazador oral y la sensibilidad del sistema LC-MS/MS. Históricamente, se usaban dosis más altas de aplicaciones para superar la menor sensibilidad de los espectrómetros de masas anteriores, pero los avances recientes han facilitado el uso de dosis másbajas 13. En los ejemplos presentados, una dosis oral más alta aumenta el nivel de retinol estable marcado con isótopos incluso en momentos posteriores, es decir, a los 21 días frente a los 4 días.

Dado que los grupos funcionales terminales de ésteres retinilo se pierden durante la ionización, se observan los mismos patrones parentales m/z de 269 y patrones de fragmentación de iones hijos similares tanto para el retinol como para los ésteres retinilo. Por lo tanto, la separación cromatográfica es crucial para determinar sus concentracionesseparadas 18. Además, debido a la alta abundancia natural de isótopos estables de 13C en isotópólogos endógenos de retinol, se recomienda incorporar más de tres átomos de 13C en el trazador de retinol para evitar la necesidad de corregir el enriquecimiento natural basal de retinol con 13C en plasmahumano 29.

Las muestras de plasma requieren un procesamiento previo al análisis isotópico en dos pasos. Primero, las muestras de plasma deben desproteinizarse, seguidas de la extracción de retinol y ésteres de retinilo utilizando un disolvente no polar, que crea un sistema bifásico 18,19,20. Aunque se obtiene una separación clara de fases usando el protocolo anterior, es fundamental que la interfase en el sistema bifásico no se altere ni se recolecte, ya que esto aumentará el tiempo de secado y reducirá la precisión del análisis. Alternativamente, nuestro grupo también ha explorado la aplicación de un procedimiento de extracción monofásica para losretinoides 20. Para ello, se pipetean muestras de plasma de 200 μL en un tubo microcentrífuga de plástico de 2 mL, y se extraen retinoides utilizando una combinación de etanol y acetato de etilo. La aplicación de este protocolo de extracción permite el análisis del retinol y de retinoides más polares, como los isómeros del ácido retinoico, con una recuperación equivalente a la extracción bifásica, y también es comparable al método de extracción de acetonitrilo en un solo paso de Kane y Napoli30.

Dado que los retinoides son susceptibles a la oxidación e isomerización cuando se exponen a la luz ultravioleta y al calor, es crucial realizar el análisis lo antes posible, y deben tomarse precauciones generales durante la recogida, manipulación y almacenamiento del plasma30. Los métodos tradicionales para analizar retinoides marcados con isótopos estables emplean aislamiento y/o derivatizaciones que consumen mucho tiempo. El análisis GC-MS requiere aislar la fracción de retinol del suero humano mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), seguida de la derivatización delretinol 22. Aunque no es necesaria la derivatización para GC-C-IRMS, se recomienda la separación previa del retinol mediante dos pasos separados de purificaciónHPLC 17,25,31, y también se requiere la determinación del enriquecimiento natural basal de retinol con 13C en plasma humano en la poblaciónmuestral 17,32. En cambio, el método LC-MS/MS presentado tiene varias ventajas. Evita procedimientos extensos y largos de extracción y/o purificación, permitiendo un análisis rápido, sensible y simultáneo de ésteres de retinilo y retinollibre 16,18,26,32. Además, el método es eficaz porque proporciona alta precisión con baja variabilidad y es adaptable a diferentes sistemas LC-MS/MS.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que declarar.

Agradecimientos

El apoyo a este trabajo fue proporcionado por la Fundación Bill & Melinda Gates (Número de Proyecto: OPP1115464) y el Organismo Internacional de Energía Atómica (OIEA) en Viena (Número de Proyecto E4.30.30).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Disolventes
Grado absoluto de etanol HPLCFisher10428671
Grado HPLC de acetonitriloFisher10660131
Hexano 95% N-Hexano para HPLC Certificado HPLCFisherH/0406/17
Grado HPLC de isopropanolVWR20880.32
Grado HPLC de isopropanolVWR20880.32
Metanol 99% 2,5 LTermo Científica11367996
Estándares/isótopos
todo trans-retinolBioXtra95144
Acetato de retiniloSigmaPHR1236
Retinol marcado con isótopos estables:ReseaChem/Buchem BV
Acetato de retinilo marcado por isótopos estables:ReseaChem/Buchem BVN/ASe puede utilizar una variedad de isótopos estables para el método de la RIM. Una lista de diferentes isótopos disponibles comercialmente se presenta en la Tabla 1. 
Vitamina A y nbsp; (19,19,19,20,20,20-D6)
Vitamina A y nbsp; (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Acetato de vitamina A (10,19,19,19-D4)
Acetato de vitamina A (19,19,20,20,20-D6)
Acetato de vitamina A (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Equipo
Dispensador de disolventes ajustable de 5 mlSigma-AldrichZ627607-1EA
ABI 4000 LC-MS/MS.AB Sciex
Balanzas analíticas  Fisher13592970
Pistones capilares (puntas de pipeta) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Pistones capilares CP250ST 6x96GilsonF148714
Armario de humos
Microman E M100E Pipeta (desplazamiento positivo)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipeta (desplazamiento positivo)GilsonFD10005
Pipetman P100, 10-100ul, eyector metálicoGilsonF114057M
Pipetman P1000, 100-1000ul, eyector metálicoGilsonF114059M
Pipetman P20, 2-20ul, eyector metálicoGilsonF144056M
QTRAP 5500 LC-MS/MSAB Sciex
Centrífuga refrigerada 5810 REppendorf
Baños de agua sónicosVWRUSC100T
EspectrofotómetroThermo Fisher ScientificA51119600C
Concentrador de muestras Techne y bloque térmico.VWR
Vibrax VXR Shaker BásicoIKA0002819002
Mezclador de vórtice; IKA básico MS3FisherMPR-555-050L
Accesorio de tubo de ensayo VX2 - werke type VX2IKA0000568900
Consumibles
Tubos microcentrífugas de 1,5 mlFisherFB74323
100 mm x 2,1 mm (1,7 y mu; m) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 Columna VanGuard FITAguas186009498
100 mm x 2,1 mm (3 & micro; m) Columna Supelcosil ABZ PLUSSupelco57917
Puntas de pipeta de 1000ulStarlabS1122-1830
Matrazas volumétricas de 100 mlFisher11323644Matraz volumétrico certificado Pyrex Borosilicato Clase A
Puntas de pipeta 200ulStarlabS1120-8810
Cartucho SecurityGuard C18 de 4 mm x 2 mmFenomenoAJ0-4286
Frascos volumétricos de 50 mlFisher11313644Matraz volumétrico certificado Pyrex Borosilicato Clase A
Frascos de vidrio ámbar de 9 mm con insercionesFisher11583680
Tapones roscados de rosca de vial de 9 mmFisher13206419
Criocaja de cartónStarlabA9623-8181
Cuvette Hellma cuvette cuarzo UVSLSCEL1600
Gas nitrógeno (de máxima pureza y libre de oxígeno)BOC
Pipeta PasteurFisher11546963
Tubos de cultivo Pyrex 100x16mmCorningCLS9944916
Tapones de rosca y revestimiento de PTFE 16mmCorningCLS999815
Tapas de PTFE de vidrio ámbar de 2ml en vialFisher11573542
Tapón de rosca de vial de 9mm silicona blanca/PTFE rojoThermo 13206419

Referencias

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