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Establecimiento de una trombosis sagital superior modificada inducida por cloruro férrico

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DOI:

10.3791/69563

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30 de diciembre de 2025

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1Department of Neurology, Xuanwu Hospital Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Xuanwu Hospital Capital Medical University

En este artículo

Resumen

Este estudio presenta un protocolo para establecer un modelo de rata reproducible y mínimamente invasivo de trombosis del seno sagital superior inducida por cloruro férrico, utilizando un método de sutura de seda en combinación con imágenes láser de contraste moteado y ultrasonidos de alta resolución para su evaluación.

Resumen

La trombosis venosa cerebral (CVT) es un trastorno neurológico raro pero potencialmente mortal. Los modelos animales ofrecen plataformas clave para investigar su fisiopatología y evaluar posibles terapias. En este estudio, presentamos un modelo modificado en rata de trombosis del seno sagital superior (SSS) utilizando una técnica de sutura empapada en FeCl₃. Los machos de ratas Sprague-Dawley (220-250 g) fueron sometidas a una incisión paramediana en el cuero cabelludo y a la creación de una ventana ósea craneal de 1 cm sobre el SSS. En comparación con la incisión tradicional de la línea media, este enfoque previene la adherencia entre la piel incisa, la ventana ósea y la duramadre subyacente. Además, evita la interferencia causada por nudos de sutura situados sobre el SSS, mejorando así la calidad de la imagen por ultrasonidos. Se aplicó una sutura de seda 2-0 empapada en 40% deFeCl 3 directamente sobre el seno expuesto durante dos intervalos consecutivos de 5 minutos. En comparación con el método tradicional depapel filtro FeCl 3, esta técnica minimiza el daño químico directo a la corteza parasagital. Se empleó la imagen láser con contraste de motas para evaluar la perfusión venosa cerebral antes y después de la aplicación de FeCl3 . Una reducción significativa del flujo sanguíneo confirmó una trombosis exitosa. Siete días después de la cirugía, la formación del trombo y los cambios hemodinámicos fueron evaluados mediante ultrasonidos de alta resolución y analizados utilizando el software Vevo LAB, que proporcionó datos volumétricos y hemodinámicos del trombo. Este modelo modificado ofrece un enfoque reproducible, mínimamente invasivo y compatible con imágenes para la investigación preclínica de la CVT.

Introducción

La trombosis venosa cerebral (CVT) es un tipo especial de enfermedad cerebrovascular, que representa entre el 0,5 y el 3% de todos los ictus y es una causa importante de ictus en adultosjóvenes. El cambio patológico central de esta enfermedad es la trombosis en los senos venosos durales y/o venas cerebrales, que conduce a un drenaje venoso cerebral deteriorado, provocando posteriormente aumento de la presión intracraneal, edema cerebral, infarto venoso ohemorragia 2. Para dilucidar mejor sus mecanismos subyacentes y evaluar intervenciones terapéuticas novedosas, modelos animales fiables y reproducibles son indispensables. Dado que el seno sagital superior (SSS) es el lugar más frecuentemente afectado y su ubicación superficial facilita procedimientosoperativos 2,3, los experimentos actuales en animales utilizan principalmente el modelo de trombosis sagital superior (SSST).

Entre los diversos métodos de modelado, el método de inducción con cloruro férrico (FeCl3) se ha convertido en una de las técnicas más utilizadas debido a su simplicidad operativa y rentabilidad4. En este modelo, la aplicación tópica de una solución deFeCl 3 daña directamente el endotelio del seno venoso, exponiendo la matriz subendotelial gracias a sus fuertes propiedades oxidativas. Esta exposición activa la agregación plaquetaria y la cascada de coagulación, induciendo finalmente trombosis del senovenoso 5. Sin embargo, en comparación con otros métodos, el modelo tradicional depapel de filtro FeCl de 3 factores también presenta varios inconvenientes. El problema más crítico es que las propiedades paramagnéticas y la alta susceptibilidad magnética de FeCl3 generan artefactos sustanciales durante la resonancia magnética, comprometiendo gravemente la precisión de la evaluación del trombo y la observación de la recanalización del senovenoso 6. Además, la forma del papel de filtro no encaja bien con el SSS, lo que lo hace propenso a lesionar el parénquima cerebral que rodea el seno paranasal. Por lo tanto, es difícil determinar si el daño parénquimata alrededor del SSS se debe a la propia trombosis o a una lesión química directa causada por FeCl3.

El objetivo general del presente trabajo es establecer un modelo modificado de ratas SSST inducido porFeCl 3 que reduzca la lesión cortical directa causada porFeCl 3 y permita la evaluación del flujo sanguíneo y el tamaño del trombo dentro del SSS. Este estudio introduce un enfoque paramedial combinado con una técnica de sutura empapada enFeCl 3, que minimiza la lesión química cortical directa causada porFeCl 3 y permite un monitoreo en tiempo real, no invasivo y cuantitativo del flujo sanguíneo y la formación de trombos del seno venoso mediante ultrasonidos de alta resolución.

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Protocolo

Este protocolo ha sido aprobado por el Comité de Experimentos Animales y Bienestar Experimental de la Capital Medical University con la Aprobación Nº AEEI-2025-138. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Establecimiento de un modelo modificado de SSST de ratas inducido porFeCl 3

  1. Utiliza ratas macho Sprague-Dawley (SD) de entre 6 y 7 semanas, que pesan entre 220 y 250 g para el experimento. Antes de la cirugía, aclimata a las ratas durante una semana y retiene la comida durante 12 horas.
  2. Prepara los siguientes reactivos, instrumentos y equipos: solución pentobarbital al 2%, solución de FeCl3 al 40%, povidona-yodo al 5%, solución fisiológica normal, pomada oftálmica, cuchillas de afeitar desechables, bisturíes, tijeras quirúrgicas, pinzas, suturas de seda 2-0 y 4-0, agujas de corte inverso, portaagujas, jeringuillas de 1 mL y 5 mL, cintas médicas, una plataforma de operación para roedores, una almohadilla térmica con sonda de temperatura rectal y un taladro craneal microportátil.
  3. Tras pesarse, anestesiar a la rata mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital al 2% (50 mg/kg) (siguiendo los protocolos institucionalmente aprobados). Luego, pellizca la piel de la extremidad trasera con pinzas para confirmar la ausencia de abstinencia y respuestas al dolor.
  4. Aplica ungüento oftálmico y afeita el pelo del cuero cabelludo de la rata con una cuchilla de afeitar desechable.
  5. Asegura a la rata en posición prona sobre una plataforma de operación de roedores con cintas médicas, mantén la temperatura corporal en 37 ± 0,2 °C con una almohadilla térmica y monitoriza continuamente la temperatura central con una sonda rectal.
  6. Desinfecta el cuero cabelludo con povidona-yodo al 5%.
  7. Haz una incisión paramediana de 15 mm en el cuero cabelludo y luego diseca de forma directa la fascia y el periostio subyacentes para exponer completamente el cráneo.
  8. Afinar el cráneo con un taladro craneal hasta que el SSS quede claramente expuesto, comenzando por el lambda y extendiéndose 10 mm hacia adelante a lo largo de la sutura sagital. Emplea una técnica de perforación intermitente para evitar dañar la duramadre subyacente y el SSS, e irriga repetidamente la broca con solución fisiológica normal para evitar daños térmicos en la corteza.
  9. Aplica un segmento de 10 mm de sutura de seda 2-0 empapada con solución 40% deFeCl 3 sobre la superficie expuesta del SSS durante 5 minutos, luego sustituye la sutura por un segmento recién empapado para otra aplicación de 5 minutos.
  10. Enjuaga el campo quirúrgico con 0,5 mL de solución fisiológica normal tres veces para eliminar el FeCl3 residual.
  11. Cierra la piel con suturas interrumpidas usando sutura de seda 4-0, seguida de desinfección con povidona-yodo.
  12. Observa a la rata hasta que esté completamente despierta y luego devuélvela a la jaula.

2. Evaluación del establecimiento exitoso del modelo

NOTA: Durante el procedimiento quirúrgico, se utilizó LSCI para medir el flujo sanguíneo venoso en el SSS tras crear la ventana craneal y antes de la aplicación deFeCl 3 , y de nuevo tras la aplicación y enjuague deFeCl 3 del campo quirúrgico, pero antes del cierre de la piel. El modelo se considera establecido con éxito cuando el flujo sanguíneo venoso en la SSS muestra una disminución significativa.

  1. Enciende el LSCI y el software correspondiente (RFLSI v5.0), y luego pulsa el botón de modo online .
  2. Ajusta la altura y posición del instrumento hasta que el láser indicador esté centrado en el campo de visión.
  3. Coloca la rata sobre una plataforma de espuma y ajusta la posición hasta que el SSS se alinee con el láser indicador.
  4. Ajusta la ampliación y el enfoque hasta que la imagen se muestre claramente. Establece los límites inferior y superior del umbral de pseudocolor en 10 y 200 para optimizar la apariencia visual de la imagen del pseudocolor.
  5. Pulsa el botón Establecer ROI , selecciona la herramienta circular y delimita la región SSS.
  6. Pulsa el botón Grabar para obtener el flujo sanguíneo venoso y capturar tanto imágenes originales como pseudocolor.

3. Evaluación del área/volumen del trombo y cambios hemodinámicos

NOTA: Varios días a varias semanas después del procedimiento, utilice una ecografía de alta resolución para evaluar los cambios en el trombo y la recanalización vascular.

  1. Prepara los siguientes medicamentos, instrumentos y equipos: isoflurano, gel de ultrasonidos, cuchillas desechables, cintas médicas, una máquina de anestesia para pequeños animales, un sistema de ultrasonido y imagen fotoacústica de alta resolución para pequeños animales, un transductor de matriz lineal UHF57x de ultra alta frecuencia a 70 MHz y un motor de adquisición 3D.
  2. Instala el motor de adquisición 3D y el transductor UHF57x. Luego, inicializa el motor.
  3. Anestesiar a la rata en una cámara de inducción con isoflurano al 3% mezclado con 1 L/min de oxígeno.
  4. Colocar a la rata en posición prona sobre la placa termostática de imagen de 37 °C, con la cabeza y las extremidades suxeitadas suavemente con cintas médicas, y mantener la anestesia con isoflurano al 1,5%-2% a través de un cono nasal.
  5. Afeita el vello del cuero cabelludo con una cuchilla desechable para exponer la zona de detección y luego aplica gel de ultrasonidos.
  6. Ajusta la posición y orientación de la rata respecto al transductor hasta que el SSS y el trombo intraluminal estén claramente visualizados.
  7. Adquirir imágenes tomográficas secuenciales del SSS tanto en planos sagital como coronal utilizando imágenes 3D en modo B con un tamaño de paso de 0,04 mm.
  8. Utiliza el modo Doppler en color para observar el flujo sanguíneo en el SSS, y luego aplica el modo Doppler de Onda Pulsada (PW) para medir la velocidad del flujo sanguíneo.
  9. Suspende la anestesia y devuelva a la rata a la jaula una vez que esté completamente despierta.
  10. Exporta las imágenes y analízalas usando el software Vevo LAB. Registrar las áreas transversales sagital y coronal, y el volumen del trombo en el SSS, junto con la velocidad máxima del flujo sanguíneo del seno nasal.

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Resultados

El diagrama esquemático del modelo modificado de SSST inducido por FeCl3 se muestra en la Figura 1. Los resultados experimentales demostraron que, tras la aplicación de la sutura de seda saturada conFeCl 3 al SSS, el LSCI detectó una reducción significativa en el flujo sanguíneo local, lo que indicó una oclusión exitosa del seno venoso y confirmó la sensibilidad del LSCI para detectar cambios dinámicos en la perfusión (

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Discusión

La CVT es un tipo específico poco común pero potencialmente mortal de enfermedadcerebrovascular 1. Para investigar más a fondo sus mecanismos patológicos y desarrollar estrategias de intervención efectivas, los investigadores han establecido varios modelos animales de SSST, incluyendo principalmente la ligadura o oclusión deSSS 7,8,9, la inyección ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82401527).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 mL de jeringuillaShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.21-3020
Suturas de seda 2-0Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdA224
Motor de adquisición 3DFujifilm VisualSonicshttps://www.visualsonics.com/gallery/extended-3d-motor
Suturas de seda 4-0Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdA222
5% povidona-yodoShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.https://www.lircon.cn/products_details/100.html
Jeringuilla de 5 mLShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.21-3023
Cuchilla de afeitar desechableDongyang Jinmin Trading Co., Ltd.ST300
FeCl3MacklinI811935
Almohadilla térmicaShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.36-0001
IsofluranoCiencias de la Vida RWDR510-22-10
Sistema de imagen por moteado láserCiencias de la Vida RWDRFLSI III
Transductor de matriz linealFujifilm VisualSonicsUHF57x
Cinta médicaSuzhou Konlida Medical Supplies Co., Ltd.B02
Microtaladro craneal portátilCiencias de la Vida RWD78001
PortaagujasCiencias de la Vida RWDF31025-13
Solución salina normalShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.ST341-500ml
Pomada oftálmicaShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.19-7223
Agujas de corte inversoShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LtdTJ-3-514
Plataforma de operación para roedoresShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.30150
Hoja de bisturíCiencias de la Vida RWDS31015-01
Mango de bisturíCiencias de la Vida RWDS32003-12
Máquina de anestesia para animales pequeñosCiencias de la Vida RWDR500
Sistema de ecografía y imagen fotoacústica para animales pequeñosFujifilm VisualSonicsVevo F2
Pinzas suavesCiencias de la Vida RWDF12013-10
Pentobarbital sódicoSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.P3761
Tijeras quirúrgicasCiencias de la Vida RWDS14014-10
Pinzas dentadasCiencias de la Vida RWDF12011-13
Gel de ultrasonidosShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.https://www.lircon.cn/products_details/230.html

Referencias

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