Estandarización del modelo MCAO intraluminal de Rat: un protocolo detallado con medidas de control de calidad

Resumen

Este protocolo demuestra una técnica optimizada de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) de 60 minutos en ratas. El protocolo se valida utilizando enfoques multimodales, logrando una tasa de éxito del 87,5% con mortalidad mínima y resultados reproducibles de infartos y comportamientos para la investigación sobre ictus.

Resumen

El modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) de rata sigue siendo el estándar de referencia para elucidar la fisiopatología del ictus isquémico y validar terapias neuroprotectoras. Sin embargo, desviaciones quirúrgicas sutiles pueden alterar profundamente el volumen del infarto y los resultados conductuales. Utilizando un marco de "visualizar y luego sistematizar", reexaminamos cada paso del establecimiento y validación del modelo. Se realizó una documentación fotográfica detallada de los principales puntos quirúrgicos y pasos críticos para estandarizar la orientación anatómica y la colocación de filamentos. Se utilizó la tinción con cloruro de 2,3,5-Trifeniltetrazolio (TTC) para mapear con precisión el volumen y la topología de los infartos a las 24 y 72 horas después de la reperfusión. Los déficits neurológicos se clasificaron con las escalas Zea-Longa, Bederson y Garcia modificada. Veinticuatro ratas Sprague-Dawley machos pasaron por un MCAO transitorio de 60 minutos; Se evaluaron el volumen del infarto y las puntuaciones neurológicas a las 24 horas y 72 horas. Aproximadamente el 87,50% de los animales lograron un bloqueo exitoso del flujo sanguíneo cerebral (Zea-Longa ≥ 1 y infart definido por TTC inequívocamente), con una mortalidad global del 12,50%, lo que atestigua la alta fidelidad del modelo. Este protocolo estandarizado proporciona una base técnicamente refinada y reproducible para la investigación preclínica sobre el ictus, facilitando la coherencia interlaboratorio en estudios que investigan la fisiopatología del ictus y las intervenciones terapéuticas.

Introducción

El ictus es la segunda causa principal de muerte y la tercera causa de discapacidad a nivel^{mundial 1,2}. El ictus afecta de forma desproporcionada a los países de ingresos bajos y medios, donde ocurre, de media, 15 años antes que en los países de ingresos^{altos 1}. Los dos tipos principales son el ictus isquémico (85%) y la hemorragia intracerebral (15%⁾³. El ictus isquémico, que representa la gran mayoría de los ictus, resulta de una obstrucción del flujo sanguíneo cerebral, que conduce a muerte celular e infarto cerebral⁴. La cascada isquémica implica múltiples eventos bioquímicos, incluyendo procesos prooxidativos^{significativos 5,6}.

A pesar de los extensos esfuerzos preclínicos y clínicos, solo un puñado de terapias—especialmente la trombólisis intravenosa con activador de plasminógeno tisular y trombectomía mecánica—han demostrado ser efectivas, y estos tratamientos están limitados por ventanas terapéuticas estrechas y estrictos criterios de selección de pacientes. Por ello, es urgente esclarecer los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la lesión isquémica, la reparación neurovascular y la recuperación tras un ictus. Un modelo animal reproducible y clínicamente relevante es indispensable para lograr este objetivo.

El modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) se utiliza ampliamente para explorar el ictus isquémico en^{roedores 7,8}. El método de oclusión de filamentos intraluminales es una de las técnicas MCAO más clásicas y ampliamente^utilizadas. Esta técnica puede modelar oclusiones permanentes y transitorias sin necesidad de craneectomía. Una técnica transfemoral más reciente que utiliza hilos endovasculares ha mostrado potencial para inducir MCAO transitorio en ratas, ofreciendo resultados más^{consistentes 10}. Este modelo consiste en ocluir la arteria cerebral media, normalmente utilizando una técnica de filamento^{intraluminal 11}. La MCAO provoca hipoperfusión cerebral focal, lo que conduce a isquemia y lesión por^{reperfusión.}

Aunque el MCAO es valioso para investigar la fisiopatología del ictus y posibles tratamientos, puede producir volúmenes de lesiones^{variables 7}. Por lo tanto, mejoras en el modelo MCAO —como el refinamiento de técnicas de reperfusión, el establecimiento de protocolos operativos estandarizados y el desarrollo de criterios de evaluación unificados— pueden reducir la variabilidad en la ubicación y volumen del infarto, aumentando así su utilidad en la investigación del ictus isquémico.

Este protocolo requiere una curva de aprendizaje de aproximadamente 10–15 cirugías para lograr resultados^{consistentes 13}. Las tasas de éxito pueden variar según la experiencia del operador y la cepa^{de rata 14}. El modelo es adecuado para estudiar el ictus isquémico agudo, pero puede no replicar completamente comorbilidades humanas como hipertensión o^{diabetes 15}. Por ello, buscamos diseñar y validar rigurosamente un protocolo MCAO optimizado que busque reducir la variabilidad experimental mediante procedimientos estandarizados y rigurosas medidas de control de calidad. Se integraron cuatro innovaciones complementarias para lograr ganancias duales en estandarización y fiabilidad de los datos: (1) Evaluación longitudinal en puntos de tiempo dual—se obtuvieron puntuaciones neurológicas de las escalas Zea-Longa, Bederson y Garcia modificada en paralelo con volúmenes de infarto derivados del cloruro de 2,3,5-Trifeniltetrazolio (TTC) a las 24 horas y 72 horas tras la reperfusión, delimitando la relación temporal entre la resolución del edema y la recuperación funcional; (2) Validación cruzada a triple escala—la puntuación ciega, con doble investigador y calibración integrada de tres escalas, aumentó significativamente la sensibilidad y precisión de la evaluación conductual; (3) Se estableció la sección rápida de hipotermia de curso completo—se estableció un procedimiento operativo estándar (SOP) de "extracción en baño de hielo de 90 s seguida de corte coronal de 2 mm en un solo paso en moldes prerefrigerados" para minimizar la autólisis y el error humano, asegurando mediciones volumétricas de alta fidelidad; (4) Se construyó un marco integrado de control de calidad—se construyó una PAP integral que abarca ayuno preoperatorio, control de profundidad de anestesia, termorregulación preoperatoria y prevención de contaminación cruzada para ofrecer un procedimiento operativo estándar MCAO reproducible y fácilmente transferible, sentando una base sólida para la consistencia interlaboratorial y la comparabilidad en estudios cruzados.

Protocolo

El experimento fue aprobado y supervisado por el Comité de Experimentos Institucionales con Animales y Bienestar Experimental de la Universidad Médica de la Capital Medical University. Todos los protocolos cumplen con la Guía NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Publ. 80-23, revisión de 1996), y se requieren equipos estériles y técnicas asépticas.

1. Selección de animales

1. Utiliza ratas macho Sprague-Dawley (de 6 a 8 semanas, con un peso de 240 a 270 g) obtenidas de un proveedor certificado de animales de laboratorio (Licencia nº SCXK (Pekín) 2021-0011) para establecer un modelo de MCAO.
2. Alojar a los animales convencionalmente con comida y agua ad libitum; todos los procedimientos seguían el Código Internacional de Ética.
3. Utiliza los siguientes criterios basados en el peso corporal animal para la selección del tamaño del filamento y así asegurar una oclusión constante:
   - 220–250 g: 0,33–0,35 mm de diámetro
   - 250–280 g: 0,35–0,38 mm de diámetro
   - 280–310 g: 0,38–0,40 mm de diámetro
   NOTA: Estas especificaciones tienen en cuenta los aumentos relacionados con la edad en el diámetro del vaso y reducen la incidencia de SAH o oclusión^{incompleta 13}.

2. Tamaño de la muestra

1. Calcula el tamaño de la muestra usando un software de cálculo de tamaño. Basándose en datos preliminares que muestran un volumen esperado de infartos del 35% ± 10% (media ± DS) en el grupo MCAO frente al 0% ± 2% en el grupo SHAM, se estima un tamaño de efecto (d de Cohen). Para una prueba Mann-Whitney U de dos colas (alternativa no paramétrica a la prueba t), con α = 0,05 y potencia (1-β) = 0,80, calcular un tamaño mínimo de muestra.
   NOTA: El tamaño del efecto se estimó en 3,5 y el tamaño mínimo de la muestra fue de 6 animales por grupo.
2. Para tener en cuenta la mortalidad anticipada (12,5%) y la tasa de exclusión (5–10%), incluye 24 ratas en el grupo MCAO y 6 ratas en el grupo SHAM, proporcionando potencia adecuada (>0,90) para el punto final principal (volumen del infarto a las 24 horas).

3. Criterios de inclusión y exclusión

1. Incluir a los animales si cumplían los siguientes criterios: (1) ratas machos de Sprague-Dawley, 240–270 g, de 6–8 semanas de edad; (2) ausencia de déficits neurológicos preexistentes (puntuación neurológica preoperatoria = 0); (3) inducción exitosa de anestesia sin complicaciones.
2. Excluir a los animales del análisis si presentaron: (1) hemorragia subaracnoidea (HSA) evidente en la necropsia; (2) muerte prematura (<24 h post-reperfusión) no relacionada con la intervención experimental; (3) oclusión fallida (puntuación neurológica = 0 y ausencia de infarcto definido por la TTC); (4) fallo técnico quirúrgico (por ejemplo, rotura de CCA).
   NOTA: Estos criterios se especificaron previamente antes del inicio del estudio para minimizar el sesgo de selección.
3. Política de reemplazo animal: Sustituir solo a los animales excluidos por fallo técnico quirúrgico o muerte intraoperatoria para mantener el poder estadístico. No sustituyas a los animales con modelados fallidos (oclusión fallida), pero infórmalos como parte del cálculo de la tasa de éxito para evitar reducir artificialmente la variabilidad.

4. Preparaciones prequirúrgicas

1. Prepara herramientas autoclave, filamento estéril y un campo cubierto.
2. No se requiere ayuno rutinario; Cuando sea necesario, limita la duración del ayuno a 2–4 horas. Inducir anestesia con isoflurano (3–4%) y mantenerla en un 1,5–2% en un 30–40% de O₂ durante el procedimiento. Confirma la profundidad de la anestesia perdiendo el reflejo de enderezamiento y el pellizco del dedo del pie.
3. Mantén la temperatura corporal en 37 ± 0,5 °C usando una almohadilla térmica controlada por retroalimentación con monitorización de temperatura rectal.
4. Afeita el cuello y el cuero cabelludo, luego limpia la zona con povidona-yodo, seguido de un 70% de etanol.
5. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg, subcutánea) 30 minutos antes de la cirugía y cada 12 horas postoperatorias durante 48 horas, o meloxicam (1 mg/kg, subcutánea) una vez al día durante 3^{días 16}. Evaluar el dolor monitorizando el comportamiento de acicalación, la postura y la actividad espontánea; Proporciona más analgesia si persisten los signos de molestias.

5. Oclusión del MCA

1. Coloca a la rata en reclinancia dorsal con la cabeza suavemente extendida para exponer el cuello ventral.
2. Haz una incisión cervical en la línea media (1,5–2,0 cm) con tijeras para iris.
3. Separa de forma directa los músculos esternomastoideo y omohioideo usando pinzas curvas para exponer la bifurcación de la arteria carótida común izquierda (CCA).
4. Liga la arteria carótida externa (ECA) distalmente con una sutura permanente de seda 4-0 y proximalmente con una ligadura temporal. Haz una pequeña incisión entre las dos ligaduras ECA usando microtijeras.
5. Ocluir temporalmente la ACC y la arteria carótida interna (ICA) usando pinzas microvasculares (presión de 60 g).
6. Inserta un monofilamento recubierto de silicona 4-0 (0,35–0,40 mm de diámetro) a través de la incisión ECA. Avanza retrogradamente hacia el CCA y luego rediríxelo hacia el ICA más allá de la bifurcación del CCA.
   NOTA: Asegúrese de que el filamento entre en la ACI hacia la base craneal, no hacia la arteria pterigopalatina (PPA) que se ramifica lateralmente. Si se encuentra resistencia a <10 mm, retrae el filamento, gira la cabeza del animal 30° hacia el lado contralateral y vuelve a avanzar para redirigirte más allá del origen PPA.
7. Avanzar el filamento 18–20 mm desde la bifurcación CCA hasta que una ligera resistencia indique oclusión del origen MCA. Verifica la profundidad usando la línea de referencia premarcada en el filamento (posicionada 2 mm proximal al tapón de silicona), medida con un calibrador desde el punto de inserción del muñón ECA. Suelta la abrazadera CCA una vez que el filamento esté en su posición.

6. Reperfusión

1. Tras 60 minutos de oclusión, reabre la incisión y afloja la ligadura temporal de ECA.
2. Retira suavemente el filamento hasta que la punta pase del muñón de la ECA, restaurando así el flujo sanguíneo. Coloca rápidamente una ligadura permanente proximal al muñón para evitar hemorragias en la espalda. Cierra la herida en capas.
3. Transfiere a la rata a una jaula de recuperación calentada para un seguimiento continuo.

7. Cirugía simulada

1. Prepara al animal siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente para MCAO (ayuno, anestesia, control de temperatura, drapeado estéril).
2. Realizar incisión cervical y exposición a bifurcación CCA como se indicó anteriormente.
3. Disecciona y expone la nave. No insertes el filamento.
4. Que las arterias permanezcan patentes; No inducir isquemia cerebral.
5. Cierra la incisión en capas tras 10 minutos de exposición. Transfiere al animal a una jaula de recuperación calentada para su vigilancia.

8. Puntuaciones neurológicas postoperatorias

1. Evalúa a las 24 y 72 horas después de la reperfusión, justo antes de sacrificar para la medición del volumen del infarto.
2. Habitua al animal en una habitación tranquila, a 25 °C durante 30 minutos.
3. Tener dos investigadores independientes cegados a la asignación de grupos. Que cada investigador registre las puntuaciones en hojas separadas sin consulta; Cualquier diferencia entre evaluadores ≥1 punto provoca una reevaluación.
4. Escalas (en orden de administración): Realizar la puntuación^{Zea-Longa 17} (Tabla 1), Bederson¹⁸ (Tabla 2) y Garcia¹⁹ Modificada (Tabla 3), siguiendo los protocolos publicados más recientes para criterios consistentes.
5. Utiliza la media de los dos observadores para el análisis estadístico. Excluye los datos de cualquier animal si las puntuaciones medias difieren en un >10% y sustituye por un sujeto nuevo.

9. Medición del volumen de infarto cerebral

1. A las 24 y 72 horas después de la reperfusión, anestesiar profundamente a las ratas con un 5% de isoflurano. Confirma la anestesia profunda perdiendo el reflejo de enderezamiento y la respuesta de pellizco en el dedo del pie, junto con una respiración estable, antes de continuar.
2. Extrae rápidamente el cerebro en un plazo de 90 segundos desde la confirmación de anestesia profunda, enjuaga con PBS bien frío y córtate en rodajas coronales de 2 mm usando una matriz cerebral de rata refrigerada. Durante el corte, sigue las siguientes precauciones
   1. Mantenga todo el procedimiento en hielo a 0–4 °C; Extrae el cerebro en un plazo de 90 segundos y colócalo plano en una matriz prefría.
   2. Utiliza una hoja afilada para hacer cortes simples y limpios para secciones coronales precisas de 2 mm, recogiendo cada corte en orden rostro-caudal en PBS bien frío.
   3. Limpia inmediatamente la matriz y la hoja con etanol al 75% entre animales para evitar contaminación cruzada.
3. Después de precalentar al 2% a 37 °C, sumerge completamente las rodajas y incuba en la oscuridad durante 20 minutos, girando suavemente cada 5 minutos a los 20 minutos.
4. Detén la reacción enjuagando tres veces con PBS a 4 °C. Luego añade paraformaldehído al 4% a 4 °C durante la noche.
5. A 300 dpi, fotografía ambos lados de cada corte una vez.
   1. Utiliza iluminación fija sobre un fondo blanco para eliminar sombras y reflejos.
   2. Coloca las cortes planas sin solapamiento, e incluye una barra de escala y una etiqueta de identificación en cada fotograma. Sujeta la cámara perpendicular a las secciones y mantén la distancia focal y el balance de blancos constantes en todo momento.
6. Cuantifica el volumen del infarto usando ImageJ.
   1. Importa la imagen de 300 dpi (formato RGB) y conviértela a escala de grises de 8 bits (Tipo > imagen > 8 bits).
   2. Aplica el autoumbral de Otsu (Imagen > Ajustar > Umbral Automático > seleccionar Otsu) para separar el infarto (blanco) del tejido viable (rojo).
   3. Utiliza la herramienta de selecciones a mano alzada para delinear el límite del hemisferio ipsilateral.
   4. Mide el área (Analizar > Mide) y registra el recuento de píxeles.
   5. Calcular el volumen del infarto: Σ (área del infarto × grosor de corte [2 mm]) × (volumen del hemisferio contralateral/volumen del hemisferio ipsilateral), expresado como porcentaje del hemisferio contralateral.

10. Análisis estadístico

1. Presenta los datos como media ± desviación estándar (DE) o mediana [rango intercuartíl] según corresponda.
2. Realizar comparaciones entre grupos utilizando la prueba t de Student no emparejada o la prueba Mann-Whitney U para datos no distribuidos normalmente.
3. Fija la significación estadística en P < 0,05. Realiza todos los análisis utilizando un software de análisis estadístico adecuado.

Resultados

Los animales fueron asignados aleatoriamente a grupos de supervivencia post-reperfusión de 24 horas (n = 10) o 72 horas (n = 10) para la tinción terminal de la TTC. Otras 4 ratas se sometieron a MCAO pero murieron antes del punto final previsto (tasa de mortalidad del 12,5%). El grupo SHAM comprendía n = 6. Así, el número total de animales utilizados fue de 30 (24 MCAO + 6 SHAM).

Las ratas se sometieron a una MCAO de 60 minutos para inducir isquemia cerebral (Figura 1). La reperfusión se inició retirando el filamento intraluminal y liberando la ligadura proximal en la ECA. Entre las 24 ratas MCAO, 3 murieron en menos de 72 horas; uno mostró un infarto extenso tras la tinción post-mortem de la encapsulación en menos de 24 horas, mientras que el otro falleció por causas indeterminadas en menos de 72 horas. Se excluyeron dos ratas adicionales debido a un modelado infructuoso (las puntuaciones neurológicas no cumplían los criterios y la tinción de la TTC no reveló infartos). Así, la tasa de mortalidad a 72 horas fue del 12,50%. Definimos el establecimiento exitoso del modelo como supervivencia durante 24 horas más una puntuación de Longa de 1–3 y la tasa de modelización exitosa alcanzó el 87,50%.

La función neurológica se evaluó a las 24 y 72 horas después del inicio del ictus (antes de la medición del volumen del infarto). Se emplearon las tres escalas más comúnmente utilizadas en la literatura — Zea-Longa, Bederson y Garcia modificada — para proporcionar una evaluación completa (Figura 2). A las 24 horas, las ratas (n = 20) obtuvieron una puntuación de 2,02 ± 0,41 en la escala Zea-Longa, 2,80 ± 0,41 en la escala de Bederson, y 8,15 ± 1,18 en la escala Garcia modificada; estos déficits se mantuvieron pronunciados en 72 h (Zea-Longa: 1,65 ± 0,59; Bederson: 1,93 ± 0,38; Garcia modificado: 11.00 ± 1.34). El volumen del infarto, expresado como porcentaje del hemisferio contralateral, fue de 37,61 ± 2,81 % a las 24 horas después del MCAO y disminuyó a 28,32 ± 4,18 % a las 72 horas.

Figura 1: Diagrama esquemático de la fisiología arterial cervico-cerebral izquierda y embolia de la arteria cerebral media en la rata. Diagrama esquemático de (A) anatomía arterial cervico-cerebral, (B) pre-inserción, (C) post-inserción y (D) malposición del filamento en la arteria pterigopala. CCA: arteria carótida común; ICA: arteria carótida interna; ECA: arteria carótida externa; PPA: arteria pterigopalatina; MCA: arteria cerebral media. "Triángulo negro": el sitio de la incisión; Línea azul: El filamento. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Medición del volumen del infarto y evaluación neurológica del comportamiento tras oclusión de la arteria cerebral en ratas. (A) Tinción de secciones cerebrales para intentar tener en mente. (B) El volumen del infarto a las 72 h es menor que el de las 24 h. (C,D) Las puntuaciones Zea-Longa y las puntuaciones de Bederson a las 72 h son menores que las de las 24 h. (E) Las puntuaciones modificadas de Garcia a las 72 h son más altas que las de las 24 h. ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Manifestación	Marcador / puntos
Sin déficit neurológico	0
Extremidad anterior contralateral flexionada y aducida durante la suspensión de la cola (déficit neurológico leve)	1
Círculos espontáneos hacia el lado contralateral mientras gateo (déficit neurológico moderado)	2
Caer hacia el lado contralateral al estar de pie o caminar	3
(déficit neurológico severo)
Ningún movimiento espontáneo acompañado de una conciencia deteriorada	4

Tabla 1: Puntuación Zea-Longa^.

Manifestación	Marcación/puntos
Agarra la cola del animal y levántala de modo que el cuerpo quede suspendido a 10 cm por encima del banco. En ratas normales, ambas extremidades anteriores permanecen extendidas hacia el suelo. Las ratas con déficits neurológicos pueden mostrar los siguientes comportamientos:
Sin déficit neurológico	0
La extremidad anterior parética se flexiona y se mantiene cerca del abdomen, mientras que la extremidad no afectada se extiende hacia el banco	1
Además del comportamiento descrito en el 1, la resistencia al empuje lateral hacia el lado parético se reduce notablemente cuando el animal se coloca boca abajo sobre el banco	2
Además de los comportamientos descritos en el 1 y el 2, el animal gira hacia el lado parético mientras camina	3

Tabla 2: Puntuación de ^Bederson.

Punto	Manifestación	Marcación/puntos
a) Movimiento espontáneo	Actividad normal	3
(Observa la actividad de la rata en su jaula durante 5 minutos)	Ligeramente afectado	2
	Moderadamente afectado	1
	Sin movimiento espontáneo	0
b) Movimiento simétrico de las extremidades	Postura simétrica	3
	Postura asimétrica	2
	Hemiplejia	1
c) Extensión de la extremidad anterior	Simétrico	3
(Agarra la cola y lleva las extremidades delanteras hacia el borde de la mesa; observa la extensión de la pata delantera)	Ligeramente asimétrica	2
	Marcadamente asimétrica	1
	Hemiplejia	0
d) Agarre y capacidad de escalada	Escala con fuerza y agarre firme	3
	Déficit unilateral observado	2
	Incapaz de escalar o dar vueltas	1
e) Reflejo táctil bilateral en el cuerpo	Simétrico en ambos lados	3
	Respuesta lenta por un lado	2
	Sin respuesta por un lado	1
f) Respuesta táctil bilateral de vibrisas	Simétrico	3
	Asimétrico	2
	Sin respuesta	1

Tabla 3: Puntuación modificada de Garcia. Puntuación total: 0–18 puntos; puntuaciones más altas indican mejor función neurológica.

Discusión

Es importante aclarar que el objetivo principal de este estudio fue la estandarización metodológica más que el descubrimiento biológico. Desarrollar un protocolo MCAO estandarizado es vital para reducir la variabilidad interlaboratorio y mejorar la reproducibilidad en la investigación del ictus isquémico. Este protocolo mejora la transparencia procedimental mediante rigurosas medidas de control de calidad y aborda deficiencias técnicas comunes en el modelado MCAO, incluyendo la inserción estandarizada de filamentos, la regulación de temperatura y el procesamiento histológico.

Aunque la reducción observada del volumen del infarto de 24 h a 72 h y la recuperación neurológica parcial representan fenómenos fisiopatológicos esperados en MCAO transitorio, la contribución de este estudio radica en establecer la fiabilidad temporal de estos puntos finales mediante un procedimiento rigurosamente estandarizado. Al proporcionar un marco técnico detallado y escalonado, este protocolo garantiza que futuros estudios mecanicistas —ya sea investigando cascadas neuroinflamatorias, vías apoptóticas o intervenciones terapéuticas— se basen en datos básicos reproducibles y comparables. Posicionamos explícitamente este trabajo como un recurso técnico coherente con el alcance de JoVE, proporcionando una base para la investigación preclínica estandarizada sobre el ictus en lugar de avanzar en conocimientos mecanicistas.

Varios pasos de este protocolo son especialmente cruciales para asegurar una isquemia y reperfusión constantes. En primer lugar, avanzar con precisión la línea de oclusión hasta que se sienta una ligera resistencia es esencial para lograr MCAO reproducible, ya que una pequeña desviación en la profundidad de inserción puede conducir a una oclusión incompleta o a una hemorragia subaracnoidea^20,21. En segundo lugar, mantener una temperatura corporal normal intraoperatoria estricta (37 ± 0,5 °C) y un control de la temperatura postoperatorio es crucial, ya que una temperatura corporal demasiado baja o demasiado alta puede alterar significativamente la zona del infarto y el resultado^{neurológico 12,22}. En tercer lugar, extraer rápidamente el cerebro en un plazo de 90 segundos y realizar refrigeración por baño de hielo puede minimizar la autólisis y mantener la integridad del tejido, asegurando así la precisión de la tinción y análisis volumétrico de la^{TTC 23}. Si estos pasos pueden implementarse de forma consistente, mejorarán significativamente la fidelidad y comparabilidad del modelo entre estudios.

Hemos mejorado el método tradicional MCAO para mejorar su reproducibilidad y facilidad de uso. El uso de moldes de corte cerebral preenfriados y protocolos estandarizados de corte ha reducido errores humanos y artefactos de corte. Además, la adopción de una evaluación de función neurológica a tres escalas (Zea-Longa, Bederson y Garcia modificado) por dos investigadores ciegos ha incrementado la robustez y sensibilidad de la evaluación^funcional 17,18,19. A través de procedimientos operativos estándar detallados que cubren cada etapa del programa, ayuda a identificar problemas comunes como la mala disposición del filamento, la reperfusión prematura o la hipotermia postoperatoria. Las recomendaciones para solucionar problemas para complicaciones comunes incluyen: (1) línea de oclusión mal colocada (entrada PPA), reconocida por la ausencia de resistencia a 10–12 mm y mejora neurológica inmediata—si se encuentra, retraer inmediatamente el filamento, girar la cabeza del animal 30° hacia el lado contralateral y volver a avanzar con ligera angulación medial hacia la base craneal; (2) Reperfusión prematura, indicada por una mejora neurológica repentina durante la oclusión: asegurarse de que el tapón de silicona esté bien fijado en el muñón de la ECA, verificar que el diámetro del filamento coincida con el tamaño de la arteria (0,35–0,40 mm para ratas de 240–270 g), y considerar usar un filamento más largo (aumentar el recubrimiento de silicona en 0,5 mm) si persiste el desplazamiento; y (3) Hipotermia postoperatoria (temperatura rectal <36ºC): aumentar la temperatura de la almohadilla térmica a 38 °C, colocar una lámpara de calor 30 cm sobre el animal y administrar solución salina estéril tibia (0,5 mL, intraperitoneal, 37ºC).

A pesar de estos avances, este protocolo presenta varias limitaciones. En primer lugar, la técnica requiere una curva de aprendizaje considerable (10–15 cirugías) para lograr tasas de éxito consistentes, y las variaciones individuales en la anatomía vascular de la rata pueden afectar la colocación de los^{filamentos 21,24}. En segundo lugar, el protocolo actual se basa en la verificación post hoc (puntuación neurológica y tinción TTC) en lugar de la monitorización intraoperatoria del flujo sanguíneo cerebral (LDF o LSCI), que limita el control de calidad durante la cirugía y evita la exclusión temprana de animales con oclusión^{incompleta 25}. En tercer lugar, la validación se limitó a ratas Sprague-Dawley machos jóvenes, restringiendo la generalizabilidad a hembras, animales de edad y modelos^{comórbidos 26,27}. Los estudios futuros deberían incorporar: (1) ambos sexos para abordar el sexo como una variable biológica; (2) ratas envejecidas (12–18 meses) con comorbilidades vasculares; y (3) monitorización en tiempo real de la CBF para mejorar la reproducibilidad en estudios de intervención con fármacos.

Este método es especialmente valioso en el cribado preclínico de fármacos, ya que la consistencia y la relevancia traslacional de sus resultados son de suma importancia. El protocolo estandarizado descrito en este artículo tiene un gran potencial para mejorar el rigor y la reproducibilidad de la investigación sobre el ictus isquémico. Las aplicaciones futuras de este protocolo incluyen: (1) cribado preclínico de agentes neuroprotectores administrados durante la ventana de reperfusión; (2) estudios mecanicistas de lesiones isquemia-reperfusión utilizando los puntos de tiempo de 24 horas y 72 horas; (3) investigación de la neuroplasticidad post-ictus y la recuperación funcional; y (4) validación de objetivos terapéuticos en combinación con intervenciones genéticas o farmacológicas. Al proporcionar procedimientos operativos estándar detallados y respaldados por vídeo, nuestro objetivo es facilitar la adopción generalizada de este método en laboratorios de diversos niveles profesionales, contribuyendo en última instancia a una investigación preclínica sobre el ictus más fiable y clínicamente relevante.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2% TTC staining solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8170	25 g/bottle, ≥98 % purity
4% PFA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1110	500 mL ready-to-use
Absorbable suture	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	VCP345H	5-0 Vicryl
Adson forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11010	1×2 teeth, 12 cm
Dumont curved forceps	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11052	11 cm length, 0.05 mm fine tip
Feedback heating pad	Shenzhen Reward Life Science & Technology Co., Ltd.	69001	37 ± 0.3 °C closed loop
ImageJ	National Institutes of Health	version 1.53k
Iris scissors	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14060	Curved tip, 10 cm
Micro-vascular clips	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	JD-16010	1.5 cm curved clip
Non-absorbable silk	Shanghai Pudong Jin-Huan Medical Products Co., Ltd.	S-2304	6-0 Black silk thread
PASS software	NCSS, LLC, Kaysville, UT, USA	version 15.0	Sample size calculation software
Rat brain matrix	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	68610	2 mm coronal slots
Silicone-coated nylon filament	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	60-1250	0.35 mm OD, 30 mm silicone tip, EO-sterile
Small-animal anesthesia machine	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	R500IE	Isoflurane vaporizer, induction chamber & mask included
SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	version 26.0	Statistical analysis software
Vannas micro-scissors	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14058	Curved tip, 8 cm