Una plataforma de punto de atención para la detección simultánea de PCR tríplex de infecciones por chikungunya, dengue y virus del Zika

Resumen

Este artículo recomienda un sistema integrado totalmente automatizado que emplee tecnología triple de PCR para diagnosticar simultáneamente las coinfecciones de Chikungunya, Dengue y virus Zika utilizando una sola muestra, optimizando así la eficiencia de las pruebas en laboratorios clínicos y de atención primaria.

Resumen

La fiebre Chikungunya (CHIKF), una enfermedad viral aguda transmitida por mosquitos y descubierta por primera vez en Tanzania en 1952, ha mostrado una propagación intermitente en China, con un aumento de los brotes locales. En julio de 2025, la provincia de Guangdong, actualmente el centro del brote, había reportado 4.824 casos locales, incluyendo casi 3.000 nuevas infecciones en solo una semana. Este rápido aumento genera una necesidad urgente de tecnologías diagnósticas avanzadas. Estas herramientas son fundamentales para apoyar los esfuerzos de contención en primera línea. Proponemos una solución para la detección rápida y simultánea de infecciones por dengue (DENV), chikungunya (CHIKV) y virus Zika (ZIKV) para mejorar las capacidades tempranas de prevención y control epidémico. Este enfoque implica desarrollar protocolos de pruebas personalizados para los puntos de control fronterizos y las instalaciones de atención primaria.

Los métodos diagnósticos tradicionales para CHIKV y DENV a menudo carecen de sensibilidad o especificidad en casos de coinfección. Dado que CHIKV, DENV y ZIKV comparten patrones y síntomas de transmisión similares, la monitorización simultánea es crucial. Este protocolo presenta un método de qPCR triplex usando sondas TaqMan para detectar estos arbovirus en un solo tubo en un plazo de 90 minutos. En comparación con el cultivo viral y las pruebas serológicas, este método mejora la eficiencia al identificar infecciones activas y coinfecciones con alta especificidad, a la vez que simplifica el flujo de trabajo y elimina requisitos especializados de equipo.

La validación con muestras clínicas y de Evaluación de Calidad Externa (EQA) confirmó una concordancia del 100% con ensayos singleplex de referencia de oro. Este método sirve como una herramienta eficaz para monitorizar enfermedades febriles en regiones endémicas, especialmente en entornos con recursos limitados donde la contención rápida de brotes es crítica.

Introducción

La fiebre chikungunya (CHIKF) es una enfermedad arboviral cada vez más prevalente, transmitida principalmente por los mosquitos vectores Aedes aegypti y Aedes albopictus. Caracterizada por brotes recurrentes en regiones tropicales, esta enfermedad se manifiesta clínicamente como una enfermedad febril aguda, a menudo acompañada de dolor articular severo y artritis^{persistente 1}. A fecha de 26 de julio, el total acumulado de casos confirmados en laboratorio de chikungunya en la ciudad de Foshan había alcanzado los 4.824, con un notable 87,2% de estos casos ocurriendo en el distrito de Shunde. Esta pronunciada concentración geográfica impone una carga considerable a la infraestructura regional de salud pública y resulta en costes sanitarios significativos, junto con desafíos macroeconómicos más^{amplios 2}.

En el contexto de la circulación cada vez más superpuesta de los virus CHIKV, DENV y ZIKV, las metodologías diagnósticas actuales se encuentran con tres limitaciones principales. En primer lugar, los ensayos serológicos no pueden distinguir infecciones agudas debido a la prolongada persistencia de los anticuerpos tras la eliminación^{viral 1}. En segundo lugar, las técnicas de cultivo viral presentan tasas de sensibilidad bajas y requieren varios días, lo que dificulta la toma de decisiones clínicas a tiempo. Tercero, aunque los ensayos cuantitativos de PCR demuestran una alta especificidad (superior al 95%), no pueden detectar coinfecciones dentro de una sola reacción, lo cual es un inconveniente significativo dado el 12,8% reportado de tasa de coinfección CHIKV-DENV en^{India 3}. El seguimiento filogenético indica un cambio de paradigma. La línea ECSA, que fue dominante durante la epidemia de 2019-2022 en India, ha adquirido mutaciones convergentes en sus proteínas envolventes: E1-A226V (que mejora la infectividad de mosquitos) y E2-K252Q (asociada a evasión inmune). Estas mutaciones han dado lugar a un genotipo con virulencia documentada más alta, según se informó en estudios recientes de vigilancia de Kerala y^{Maharashtra 3}. Paralelamente, China enfrenta desafíos derivados de la importación del genotipo ECSA, documentado en el brote de Yunnan, y otros genotipos, con transmisión autóctona reportada en varias provincias, incluida^{Yunnan 4}.

Estas realidades generan necesidades urgentes y con recursos limitados para (i) diagnóstico diferencial a pesar de las manifestaciones clínicas^{superpuestas 5}, (ii) ensayos diagnósticos que eliminan la complejidad de instrumentación típicamente requerida por la PCR cuantitativa convencional en tiempo real (qPCR^)6, y (iii) validación integral de nuevas tecnologías en el punto de atención, incluyendo métodos basados en RT-LAMP y^{CRISPR 5}. Para abordar estos desafíos diagnósticos, proponemos un ensayo rápido triple de PCR que utiliza un sistema integrado totalmente automatizado, permitiendo la detección simultánea de CHIKV, DEV y ZIKV en una sola reacción. Validamos el rendimiento de nuestro ensayo qPCR tríplex mediante comparación directa con los ensayos^{singleplex establecidos 5}, que sirvieron como estándar de referencia. Las siguientes secciones detallan los procedimientos tanto para el ensayo triplex como para el ensayo singleplex de referencia. El análisis comparativo de los resultados de ambos métodos se presenta en la sección de Resultados Representativos.

Protocolo

Este estudio cumple con las directrices éticas establecidas por el Comité de Ética del Hospital Popular Provincial de Guangdong, Universidad Médica del Sur, Guangzhou, China (número de aprobación: KY2025-510-01). La información detallada sobre los materiales utilizados en esta investigación (reactivos, productos químicos, equipos y software) puede encontrarse en la Tabla de Materiales.

1. Selección de participantes

1. Elige participantes en el rango de edad que va de 18 a 60 años.
2. Elige participantes que presenten enfermedad febril aguda (testosterona axilar ≥ 38 °C) dentro de los 12 días posteriores al inicio de los síntomas, además de erupción cutánea, artralgia o linfadenopatía cervical, y viajes recientes a zonas endémicas de chikungunya; o personas asintomáticas con el mismo historial de viajes.
3. Exclusión: uso de antimicrobianos/antivirales en un plazo de 7 días o enfermedad febril atribuible a VIH confirmado o malignidad.

2. Recogida y procesamiento de muestras

1. Comprueba que el embalaje exterior de la caja de muestra no esté dañado ni haya caducado, y luego retira los materiales internos.
2. Coloca al sujeto con el brazo extendido. Identifica la vena cubital media, aplica un torniquete y desinfecta el lugar de la venpuntura con un hisopo de alcohol al 70%.
3. Recoger 1~3 mL de sangre de la vena antecubital del sujeto utilizando un tubo de extracción de sangre sin anticoagulantes.
4. Invierte suavemente el tubo 5-8 veces y déjalo coagular a temperatura ambiente durante 30 minutos.
5. Centrifuga la muestra de sangre a 4 °C, 1000 x g en una centrifugadora, durante 10 minutos. La muestra de suero obtenida tras la centrifugación puede analizarse inmediatamente.
6. Coloca cuidadosamente el suero sobrenadante en tubos estériles de microcentrífuga. Utiliza el suero inmediatamente para la prueba o guarda las alicuotas a -80 °C hasta un análisis adicional de los ácidos nucleicos patógenos mediante qPCR.

3. Detección automatizada de qPCR en triplex de CHIKV, DEV y ZIKV

1. Preparación de reactivos y tubos
   1. Recupera todos los reactivos necesarios del almacén y déjalos a temperatura ambiente.
   2. Inspecciona visualmente cada tubo de detección de tanquetas sellado para detectar daños o fallos en el sello. Desecha cualquier tubo comprometido.
   3. Haz un vórtice breve en el buffer de extracción de ácido nucleico de TD durante 5 s para asegurar la homogeneidad.
   4. Dispensar asépticamente 500 μL del tampón homogeneizado en un tubo de reactivo de extracción TD (que contiene perlas magnéticas liofilizadas moradas).
   5. Agita la mezcla vigorosamente durante 30 segundos hasta que todos los componentes estén completamente disueltos y las esferas vuelvan a suspender por completo.
   6. Transfiere toda la solución reconstituida a un tubo de detección TD preetiquetado.
2. Carga de muestras
   1. Pipete 200 μL de suero claro, no hemolizado y no lipémico en el tubo de detección de TD preparado.
   2. Sella bien el tubo y invirtelo diez veces para mezclarlo de forma homogénea.
      NOTA: Durante la inversión, permite que la capa de parafina flote brevemente dentro del tubo. Esto es una parte normal del proceso.
3. Operación de instrumentos y adquisición de datos
   1. Inserta los tubos de detección sellados en las ranuras designadas del analizador.
   2. En la interfaz táctil, introduce la información de identificación de la muestra.
   3. PulsaS Detección de tartas para iniciar el flujo de trabajo totalmente automatizado y de tubo cerrado.
      NOTA: El sistema realizará automáticamente escaneo de códigos de barras, extracción de ácidos nucleicos mediante captura de perlas magnéticas y amplificación por PCR por fluorescencia sin intervención adicional del usuario. El programa estándar incluye un paso de desnaturalización a 95 °C durante 3 minutos, seguido de 40 ciclos de amplificación.
4. Interpretación del resultado
   1. Al finalizar la ejecución, observa los resultados de amplificación de los tres objetivos (CHIKV, DENV, ZIKV) y el control interno en la misma pantalla.
   2. Registra la lectura generada automáticamente, "Positivo", "Negativo" o "Inválido", para cada patógeno objetivo en su respectivo canal de fluorescencia.
      NOTA: El software interno del sistema utiliza un umbral de ciclo (Ct) de 37,0 para la interpretación automática. No se requiere análisis manual de datos.

4. Referencia a los ensayos qPCR Singleplex para la comparación de métodos

1. Preparación de reactivos de extracción de ácidos nucleicos
   1. Saca la placa preempaquetada de 96 pozos del kit. Golpea suavemente la placa de 96 pozos para que los reactivos y las perlas magnéticas se concentren en el fondo de la placa de 96 pozos. Arranca cuidadosamente la película de sellado con papel de aluminio, evitando la vibración de la placa de 96 pocillos para evitar que salpique líquido.
   2. En las columnas 1 y 7 de una placa de 96 pozos, primero se añaden 20 μL de proteinasa K, seguidos de 200~300 μL de la muestra a extraer.
   3. Extracción automatizada de ácidos nucleicos (método basado en perlas magnéticas)
      1. Las placas preempaquetadas de 96 pozos (con muestras) se colocan en las ranuras correspondientes del sistema automatizado de extracción de ácidos nucleicos.
      2. El proceso de extracción de ácidos nucleicos es el siguiente: Adsorbe las perlas magnéticas unidas a los ácidos nucleicos usando una varilla magnética dentro de la cámara de laboratorio. Transfiere el complejo de perlas al siguiente orificio designado para el reactivo. Activa el dispositivo de agitación para mezclar el líquido a fondo con las perlas magnéticas mediante una agitación rápida y repetida. Permite que el extractor automático de ácidos nucleicos realice automáticamente los siguientes pasos: i) Lisis celular: 10 min a 25 °C. ii) Adsorción de ácidos nucleicos: 15 min a 70 °C, con adsorción magnética realizada 3 veces. iii) Lavado: Mezclar durante 2 minutos (repetido 3 veces), seguido de adsorción magnética dos veces (15 s cada una). iv) Elución: Realizar dos veces (5 minutos cada una), realizando adsorción magnética 3 veces. Finalmente, obtienen ácidos nucleicos de alta pureza.
   4. Para una detección inmediata, aspirar directamente el eluado que contiene ácido nucleico de las columnas 6 y 12. Para almacenamiento a largo plazo, transfiere las muestras restantes de ácido nucleico a -20°C.
2. Preparación de reactivos de amplificación
   NOTA: Para una reacción de PCR Singleplex, prepare tres tubos de PCR separados utilizando tres enzimas diferentes y tres mezclas de reacción correspondientes. Completa la preparación del reactivo en tres pasos separados. Dado que los pasos de preparación son similares, solo demostraremos los pasos de preparación para el reactivo de detección CHIKV a continuación.
   1. Retira la solución de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos y la solución de reacción CHIKV (cebadores/sondas específicas para CHIKV) del kit. Después de descongelar, colócalos en un ambiente a 22~25 °C, mezcla bien agitándolo vigorosamente y luego realiza una breve centrifugación (1000 x g, 15 s, 22~25 °C).
   2. Calcular el número total de reacciones como N + 2 (donde N = número de muestras de prueba, +2 = una negativa y una positiva control de calidad). Prepara la mezcla maestra en un tubo microcentrífuga de tamaño adecuado combinando lo siguiente para cada reacción: solución de reacción de amplificación de ácidos nucleicos de 17 μL (que contiene tampón, dNTPs, ADN polimerasa, enzima UDG), solución de reacción CHIKV de 3 μL (que contiene cebadores, sondas para genes objetivo del CHIKV e IC). Haz un vórtice del Master Mix a fondo para asegurar una mezcla completa. Centrifugar brevemente el tubo a 10.000 x g durante 15 s a temperatura ambiente (22~25 °C) para recoger la solución en el fondo. Dispensa 20 μL de la mezcla maestra en cada tubo de reacción PCR.
   3. Añadir muestras de ácido nucleico y control de calidad: En los tubos de reacción PCR preparados anteriormente (20 μL), añadir respectivamente 5 μL de ácido nucleico de muestras analizadas, control positivo y control negativo, logrando un volumen final de 25 μL por tubo; Tapa firmemente los tubos y realiza centrifugación instantánea (1000 x g, 15 s, 22 ~25 °C) y luego coloca los tubos en el instrumento de PCR.
3. Amplificación por PCR
   1. Establece el programa de ciclismo de la siguiente manera: Pre-desnaturalización: 50 °C durante 15 minutos, luego a 95 °C durante 15 minutos (ambos pasos juntos constituyen 1 ciclo); los siguientes 2 pasos durante 40 ciclos: desnaturalización a 94 °C durante 15 s y recocido a 55 °C durante 45 s.
   2. Establecer los parámetros de detección de señales de fluorescencia de la siguiente manera: marcaje fluorescente FAM de genes CHIKV; Marcado fluorescente VIC del gen IC utilizado como control interno del kit. Recoge datos a 55 °C. Al finalizar la reacción, asegúrese de que los datos se guarden para su análisis futuro.
   3. Analizar datos utilizando software específico para qPCR
      1. Información de la muestra: En el diagrama de disposición de las placas del pozo del software, etiquete los tipos de muestra (por ejemplo, control positivo, control negativo, muestra desconocida, gen de referencia interno, etc.) correspondientes a las posiciones de carga de la muestra.
      2. Colocación de los tubos de reacción: Abre la tapa del módulo de calentamiento del instrumento, coloca la placa/tubos de PCR sellados firmemente en su interior, asegúrate de que encajan perfectamente con el módulo de calefacción y cierra la tapa del módulo herméticamente (para evitar irregularidades de temperatura)
      3. Iniciar la reacción: Tras confirmar que la configuración del programa en el software es correcta, haz clic en Iniciar Ejecutar y registra el ID del experimento para referencia futura.
      4. Detener la operación y retirar los tubos: Una vez completado el programa, espera hasta que la temperatura del módulo de calefacción baje de 50 °C. Luego, abre la tapa y retira cuidadosamente la placa o tubos de PCR. Proceder con el análisis aguas abajo o el almacenamiento de muestras según sea necesario.
      5. Análisis de datos Antes de proceder con el análisis, confirme que: i) Las curvas de amplificación para todas las muestras y el control interno son características en forma de S; ii) El umbral de fluorescencia se establece dentro de la fase exponencial, dando valores de Ct ≤ 38 ciclos (CV < 5%); iii) Los resultados de control son válidos, indicando que no hay contaminación. Si alguna condición no se cumple o si una muestra muestra una amplificación anormal (por ejemplo, una curva atípica o una CT de rango crítico), revisa de nuevo todo el lote o la muestra específica en consecuencia.
      6. Procesar los datos en bruto con el software para determinar los valores de Ct usando el umbral seleccionado automáticamente; una muestra se considera positiva si Ct < 38 y su curva de amplificación presenta una forma sigmoidal.

5. Bioseguridad y eliminación de residuos

1. Transfiere todos los materiales a un recipiente designado, resistente a la punción, y descontaminar mediante autoclav antes de su disposición final a través del sistema institucional de residuos médicos. Transfiere inmediatamente estos materiales a un contenedor biohazard a prueba de fugas y resistente a perforaciones, etiquetado como residuos de alto riesgo. Siguiendo las directrices institucionales, descontaminar todos los residuos que contengan productos amplificados mediante autoclav (por ejemplo, 121 °C durante 30 minutos) para inactivar patógenos y degradar ácidos nucleicos. Por último, deshacerse de los residuos esterilizados mediante el sistema designado de gestión de residuos médicos.
   NOTA: Realizar todos los pasos conforme a las prácticas de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2), utilizando el equipo de protección individual adecuado para minimizar los riesgos de exposición.

Resultados

Para validar la estabilidad y precisión del sistema de detección triple de PCR, seleccionamos cinco muestras clínicamente representativas de nuestro laboratorio interno y diez muestras externas ciegas de EQA para su verificación. Estas cinco muestras clínicas representativas incluyen tanto casos negativos como positivos (S1-S5), incluyendo muestras positivas para CHIKV y DENV, seleccionadas para demostrar la aplicabilidad clínica del ensayo y apoyar la validación interna del rendimiento de las pruebas (Tabla 1

Discusión

CHIKV es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo, clasificado dentro del género alfavirus de la familia^{Togaviridae 7}. El calentamiento global acelerado, la intensificación del comercio internacional y la expansión de las redes turísticas han incrementado colectivamente el riesgo de exposición humana a amenazas^arbovirales. En la última década, la rápida evolución del diagnóstico molecular ha transformado fundamentalmente el panoram...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Extractor automatizado de ácidos nucleicos	DAAN	Smart 32	Para la extracción de ADN
BECKMAN X-12	BECKMAN	ALA04H01	For  centrifugación en suero y nbsp;
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Armario de bioseguridad
Centrífuga Electrónica	WEALTEC		Centrifuga el líquido residual fuera de la pared del tubo
Analizador médico PCR totalmente automático	Bioustar‌	UP0102	Amplificación cuantitativa por PCR fluorescente
Kit de detección de ácidos nucleicos para el virus chikungunya (método de sonda fluorescente por PCR)	DAAN	20250804	Detección de  Genes del virus chikungunya
Kit de detección de ácidos nucleicos para el virus del dengue (método de sonda fluorescente PCR)	DAAN	202504003	Detección de  Genes del virus del dengue
Kit de detección de ácidos nucleicos para el virus del dengue, virus del Zika y virus chikungunya (método de sonda fluorescente por PCR)	Bioustar‌	20250724	Detección de  Genes del virus del dengue, virus del Zika y virus chikungunya
Kit de detección de ácidos nucleicos para el virus del Zika (método de sonda fluorescente PCR)	DAAN	202508041	Detección del virus Zika   Genes
Kit de extracción de ácidos nucleicos	DAAN		Extraer ácido nucleico
SLAN Sistema de análisis médico PCR totalmente automático	HONGSHI		Análisis de datos
Máquina de PCR en tiempo real SLAN-96S	HONGSHI	SLAN-96S	Amplificación cuantitativa por PCR fluorescente
Congeladores de ultra baja temperatura (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 y grados; C para almacenar reactivos
Vórtice-5	Kylin-bell		Para reactivos de mezcla