Artículo de método

Aislamiento de células epiteliales alveolares tipo II de pulmones murenos neonatales, juveniles y adultos adaptables a entornos experimentales infecciosos

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DOI:

10.3791/69581

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19 de diciembre de 2025

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1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta un método basado en citometría de flujo para aislar células epiteliales alveolares tipo II (AECII) viables de pulmones murinos neonatales, juveniles o adultos (infectados o no infectados). Este enfoque permite que estudios moleculares y/o funcionales posteriores de AECII identifiquen sus funciones durante la inflamación e infección pulmonar.

Resumen

Las células epiteliales alveolares tipo II (AECII) contribuyen de manera crítica a la regulación inmunitaria en el pulmón y, por tanto, son elementos clave que orquestan la homeostasis pulmonar. Estas funciones hacen que AECII sea especialmente relevante en el contexto de la infección por virus respiratorios, que atacan el epitelio inferior de las vías respiratorias y alteran la integridad alveolar. Los modelos preclínicos de ratones son herramientas vitales para esclarecer los roles de AECII en el contexto de la inflamación y/o infección pulmonar. Este protocolo presenta una vía detallada y reproducible para aislar AECII viables y altamente purificados de pulmones murinos en las etapas neonatal, juvenil y adulta. La metodología combina disociación mecánica, digestión enzimática y posterior clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para producir poblaciones AECII altamente enriquecidas que han demostrado ser adecuadas para análisis moleculares y funcionales posteriores. Para aplicaciones que involucran virus patógenos, el protocolo incluye un paso opcional de fijación de paraformaldehído (PFA), que permite un manejo seguro bajo condiciones de bioseguridad más bajas sin comprometer la integridad del ARN. Con una recuperación celular optimizada en todas las etapas del desarrollo, que produce hasta 1,0 × 106 células AECII por pulmón adulto, este protocolo apoya estudios preclínicos de, por ejemplo, la patogénesis viral, la función epitelial y la capacidad regenerativa.

Introducción

Debido a sus múltiples funciones en el desarrollo pulmonar, la fisiología, la inmunidad y los procesos de reparación, las células epiteliales alveolares tipo II (AECII) contribuyen vitalmente tanto al mantenimiento como al restablecimiento de la homeostasis tras una lesión pulmonar. Como los AECII son objetivos celulares principales de virus pandémicos como el virus de la gripe A (IAV) o el SARS-CoV-2, su destino y funciones han estado en el centro de atención de la investigación en biología de infecciones. En este contexto, estudios previos informaron que las señales intrínsecas (por ejemplo, estadogenético 1,edad 2,3) así como extrínsecas (por ejemplo, estímulosmicrobianos 4) tienen un impacto importante en los fenotipos AECII y su respuesta a desencadenantes ambientales como patógenos en el aire. Cabe destacar que se ha demostrado que la inflamación pulmonar deja cambios sostenidos en el estado transcriptómico, proteómico y epigenético deAECII 5,6. Las complejas interacciones celulares de AECII dentro del pulmón, así como la contribución de diversos factores bióticos y abióticos a la biología de AECII, ponen de manifiesto la importancia de modelos in vivo adecuados que permitan examinar estas células con mayor detalle.

FACS representa la técnica de referencia actual para el enriquecimiento y purificación de células primarias a partir de tejidos humanos y animales, ya que permite la implementación simultánea de selección (o exclusión) multiparamétrica y representa el único método en el que propiedades intrínsecas a la célula como el tamaño, la granularidad o la autofluorescencia pueden integrarse de forma fiable en el flujo de trabajo de selección/exclusión. Hasta la fecha, algunos protocolos publicados proporcionan metodologías para el aislamiento basado en FACS de AECII murinos primarios. Sinha y Lowell informaron de un método para aislar AECII en ratones adultos que presenta un procesamiento de tejidos y un flujo de trabajo similar en citometría de flujo, e incluía el enriquecimiento de AECII antes de la FACS mediante agotamiento magnético basado en perlas en células no objetivo7. Otro protocolo describe el uso de aislamiento basado en perlas magnéticas de células pulmonares positivas a EpCAM o el uso de ratones transgénicos que permitieron el aislamiento basado en FACS de AECII basado en la identificación de células SPC-positivas (GFP+) mediante un modelo de ratón reporterocondicional 8. Aunque la expresión de SPC identifica de forma fiable AECII en pulmones murinos, esta metodología solo es aplicable en combinación con una cepa reportera dedicada a ratones y, por tanto, impide el aislamiento de AECII de, por ejemplo, ratones de tipo salvaje. Es importante destacar que, aunque se reportaron rendimientos y pureza similares de AECII, ninguno de estos protocolos proporcionó adaptaciones para el aislamiento de AECII de huéspedes neonatales, juveniles o infectados.

Para ello, el presente protocolo incluye un conjunto de flujos de trabajo adaptados para el aislamiento de AECII altamente puros y viables de ratones mediante digestión enzimática en combinación con FACS. Esta metodología de última generación se basa en un protocolo de aislamientoAECII 9 previamente desarrollado en FACS y contiene importantes mejoras que mejoran la pureza de AECII mediante la adición de marcadores adicionales de identificación y exclusión. Es importante destacar que este protocolo actualizado incluye la recuperación de AECII mediante estrategias de ordenación "tocadas" y "sin tocar". Además, dado que el desarrollo pulmonar postnatal se asocia con cambios importantes en la composición celular y la reorganización estructural, este protocolo incluye adaptaciones para optimizar la extracción de AECII en pulmones neonatales, juveniles y adultos. Esto permite examinar la biología de AECII durante la ontogenia, por ejemplo, en el contexto de estudios de maduración pulmonar o biología de infecciones. Este enfoque puede utilizarse para obtener AECII viable para posterior cultivo ex vivo e infección por IAV. Además, este protocolo incluye un procedimiento de fijación utilizando el fijador químico paraformaldehído (PFA). Este paso justifica la inactivación de varios patógenos respiratorios (por ejemplo, SARS-CoV-2, IAV) en suspensiones de células pulmonares, lo que a su vez permite la manipulación posterior de muestras (incluido el aislamiento AECII basado en FACS) en instalaciones con menores precauciones de biocontención. Aunque la fijación basada en PFA impide el posterior cultivo ex vivo de AECII para estudios funcionales, permite la obtención de cantidades significativas de ARN intacto para el perfilado transcriptómico de AECII y así esclarecer sus roles biológicos en el contexto de infecciones respiratorias.

Protocolo

Todos los animales fueron criados y alojados en la instalación animal del Centro Helmholtz para la Investigación de Infecciones bajo condiciones específicas libres de patógenos (FPS) y conforme a las directrices nacionales e institucionales. La eutanasia de ratones ingenuos para posterior aislamiento de AECII se realizó conforme a las directrices nacionales de la Sociedad de Ciencia de Animales de Laboratorio (GV-SOLAS, Gesellschaft für Versuchstierkunde). Se utilizaron ratones machos con antecedentes genéticos C57BL/6 a una edad de 2 días (neonatal), 3 semanas (juvenil) o 8-12 semanas (adulto). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del pulmón de ratón

  1. Sacrificar al ratón (siguiendo protocolos institucionalmente aprobados):
    1. Para ratones adultos y jóvenes : administrar una sobredosis de anestesia (por ejemplo, ketamina/xilazina) mediante inyección intraperitoneal.
    2. Para ratones neonatales : decapitar.
      NOTA: Evitar la luxación cervical en ratones adultos y jóvenes, ya que este procedimiento puede dañar la tráquea.
  2. Esteriliza el pelaje del ratón con etanol al 70% (v/v).
    PRECAUCIÓN: Líquido inflamable. Irritante para los ojos. Mantente alejado del calor. Mantén el recipiente bien cerrado y haz una incisión ventral en la línea media para exponer los órganos internos.
  3. Retira cuidadosamente la piel y el peritoneo.
  4. Exsanguina al ratón cortando ambas venas yugulares y la vena cava, permitiendo que la sangre drene del cuerpo.
  5. Retira cuidadosamente el diafragma para exponer el corazón y los pulmones.
    NOTA: Ten cuidado de no lesionarte los pulmones. La perforación del tejido pulmonar dificultaría significativamente la eficacia de la digestión posterior mediada por enzimas del tejido pulmonar.
  6. Abre la caja torácica con unas tijeras.
  7. Insertar una cánula en el ventrículo derecho del corazón y perfundir con solución fisiológica fría amortiguada con fosfato (PBS) hasta que la sangre residual se elimine del pulmón y el tejido pulmonar se vuelva pálido:
    1. Para ratones adultos : usa una cánula de 26 g y perfunde el pulmón con 10 mL de PBS.
    2. Para ratones neonatales : usa una cánula de 30 g y perfunde el pulmón con 1 mL de PBS.
      NOTA: No perfundir los pulmones de ratones juveniles para evitar la ruptura de la estructura alveolar por presión excesiva en los vasos sanguíneos pulmonares. La perfusión puede ser menos efectiva en pulmones inflamados, y el cambio de color en el tejido pulmonar puede ser menos pronunciado. Si es necesario, se puede realizar un lavado broncoalveolar antes del siguiente paso en ratones adultos y juveniles.

2. Digestión enzimática del tejido pulmonar

  1. Ratones adultos y juveniles:
    1. Expone la tráquea extirpando las glándulas salivales y el músculo circundante.
    2. Inserta una cánula permanente de 22 G en la tráquea, retira la aguja y mueve el catéter de plástico hacia los pulmones.
    3. Ata firmemente un trozo de lana alrededor de la tráquea y el catéter para sujetarlo en su sitio.
    4. Prepara el tejido pulmonar inculcando dispasa.
      PRECAUCIÓN: Puede causar alergias o asma, o dificultades respiratorias si se inhala. Evita respirar polvo. Lleva protección respiratoria. Eliminar el contenido o el contenedor en una planta de eliminación de residuos autorizada.) a través del catéter insertado en la tráquea:
      1. Para ratones adultos : Inserta 2 mL de dispase.
      2. Para ratones juveniles : Inserta 500 μL de dispase.
        NOTA: Utiliza una jeringuilla con conexión lur-slip para facilitar el intercambio de jeringuillas entre los pasos 2.1.4 y 2.1.5. Para garantizar una digestión enzimática eficiente del tejido pulmonar, es vital asegurar el relleno completo de las enzimas en los espacios broncoalveolares.
    5. Intercambia la jeringuilla y repite con agarosa de baja fusión (1% (p/v), 45 °C) para mantener la estructura durante el procesamiento.
      1. Para ratones adultos : Usa 500 μL de agarosa a baja temperatura.
      2. Para ratones juveniles : Utilice 200 μL de agarosa de baja fusión (low melt).
        NOTA: Para evitar el reflujo de los líquidos, deja la jeringuilla unida.
        NOTA: Antes de su uso: disuelva la agarosa a baja temperatura (95 °C), deja que la solución de agarosa se enfríe hasta 45 °C, por ejemplo, en un termobloque.
    6. Cubre el pulmón con papel de seda de laboratorio y añade hielo para que la agarosa se solidifique durante 2 minutos.
    7. Retira hielo, papel de seda, jeringuilla y catéter.
    8. Ata el hilo para cerrar la tráquea y así mantener la enzima en las vías respiratorias inferiores.
    9. Quita el corazón y el timo.
    10. Corta la tráquea por encima del hilo y retira el pulmón intacto del pecho.
    11. Transfiere el pulmón a un tubo de 15 mL que contiene una dispasa precalentada (37 °C) e incubar el tejido pulmonar en dispasa durante 45 minutos a temperatura ambiente (20-25 °C).
      1. Para ratones adultos : incubar el pulmón en una dispasa de 2 mL.
      2. Para ratones juveniles : incubar el pulmón en dispasa de 1,5 mL.
  2. Ratones neonatales
    1. Recoge y pica lóbulos de un solo pulmón con tijeras finas en la tapa de un tubo de 2 mL.
    2. Añade 500 μL de dispasa, cierra la tapa e invierte el tubo para asegurarte de que todo el tejido quede cubierto de dispasa.
    3. Incubar el tejido pulmonar en dispasa a temperatura ambiente durante 45 minutos.

3. Preparación del tejido pulmonar

  1. Para ratones adultos y juveniles:
    1. Retirar el pulmón de la dispasa y diseccionar los lóbulos pulmonares del tallo bronquial.
    2. Colocar los lóbulos pulmonares en una placa de Petri (diámetro: 8,5 cm) que contiene 7 mL de DMEM + HEPES, 1 μg/mL (concentración final) anticuerpo bloqueador anti-CD16/32 y 100 μL de ADNAsa (concentración final ~600 unidades de Kunitz).
      PRECAUCIÓN: Puede causar alergias o asma, o dificultades respiratorias si se inhala. Evita respirar polvo. Lleva protección respiratoria. Desecha el contenido/contenido en una planta de eliminación de residuos autorizada.
    3. Desintegra el tejido pulmonar usando pinzas.
      NOTA: Para garantizar una digestión enzimática eficiente del tejido pulmonar, es vital garantizar una completa desintegración mecánica del tejido.
    4. Incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras meces suavemente a 200 rpm.
      NOTA: La suspensión de las celdas puede almacenarse a 4 °C hasta el siguiente paso, si es necesario.
  2. Para ratones neonatales:
    1. Transfiere la dispasa, incluido el tejido digerido, a una placa de Petri (diámetro: 5,4 cm) que contiene 3 mL de DMEM + HEPES, 1 μg/mL (concentración final) anticuerpo bloqueador anti-CD16/32 y 100 μL de ADNASA (concentración final ~ 600 unidades de Kunitz).
    2. Incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente mientras meces suavemente a 200 rpm.
      NOTA: La suspensión de las celdas puede almacenarse a 4 °C hasta el siguiente paso, si es necesario.
  3. Continúa para todos los grupos de edad:
    1. Filtrar la suspensión de la celda mediante una serie de coladores de celda de nylon con poros de tamaño decreciente (100 μm - 70 μm - 40 μm) para eliminar residuos y agregados grandes.
    2. Enjuaga cuidadosamente los coladores y tubos celulares para minimizar la pérdida de células. En caso de que las muestras se agrupen, las suspensiones celulares de ratones del mismo grupo pueden pasar por los mismos coladores celulares.
      NOTA: En caso de obstrucción, cambia los coladores de celda.
    3. Dependiendo del volumen, transfiere la suspensión de celda filtrada a uno o más tubos de 15 mL y centrifuga la suspensión de celda durante 12 minutos a 140 x g a 4 °C.
    4. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet celular en el tampón de lisis de eritrocitos (tampón ACK).
      1. Para ratones adultos y juveniles : Utiliza 2 mL de tampón de lisis de eritrocitos e incuba durante 2 minutos.
      2. Para ratones neonatales : Utiliza 3 mL de buffer de lisis de eritrocitos e incuba durante 3 minutos.
    5. Detener la lisis de eritrocitos llenando el tubo de 15 mL con DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS y centrifugar de nuevo durante 12 minutos a 140 x g a 4 °C.

4. Tinción por anticuerpos para la clasificación celular activada por fluorescencia

  1. Resuspende las células en una solución de tinción de anticuerpos que contenga anticuerpos acoplados a fluorocromo anti-F4/80, anti-CD93, anti-CD11c, anti-CD19, anti-CD31, anti-CD11b, anti-CD16/32, anti-CD45, anti-CD24 y anti-CD326 preparados en DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
    NOTA: Para obtener resultados óptimos de tinción, utilice solo anticuerpos previamente titulados. Si se requiere que los AECII no se toquen para la clasificación celular, no incluyan anti-CD326 en la solución de tinción de anticuerpos.
    1. Para ratones adultos : Utiliza una solución de anticuerpos de 600 μL por pulmón.
    2. Para ratones jóvenes : Utiliza una solución de anticuerpos de 400 μL por pulmón.
    3. Para ratones neonatales : Utiliza 200 μL de solución de anticuerpos por pulmón.
  2. Incuba la suspensión celular con los anticuerpos durante 10 minutos a 4 °C en la oscuridad.
  3. Tras la incubación, lava las células llenando el tubo con DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
  4. Centrifugar durante 12 minutos a 140 x g a 4 °C.
  5. Resuspender las células DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS:
    1. Para ratones adultos : Suspende 300 μL por pulmón.
    2. Para ratones juveniles : Suspender 200 μL por pulmón.
    3. Para ratones neonatales : Suspende 100 μL por pulmón.

5. Clasificación de AECII

NOTA: Preparación del instrumento: instalar una boquilla de 100 μm para clasificar AECII usando un dispositivo FACS.

  1. Justo antes de la clasificación, filtrar las celdas mediante un colador de 50 μm. Enjuaga el colador celular con DMEM suplementado con HEPES y FBS al 10% (v/v) para evitar una pérdida celular excesiva:
    1. Ratones adultos : Enjuaga el colador celular con 300 μL por pulmón.
    2. Ratones juveniles : Enjuaga el colador celular con 200 μL por pulmón.
    3. Ratones neonatales : Enjuaga el colador celular con 100 μL por pulmón.
  2. Suspende las células mediante un vórtice justo antes de clasificar.
  3. Puerta para AECII identificando eventos que I) tienen dispersión lateral alta (SSC alto), II) son negativos para los fluorocromos de linaje, y III) son positivos para el fluorocromo CD326 acoplado al anticuerpo anti-CD326.
    NOTA: Utiliza fluorocromos con índices de brillo altos a muy altos (como APC, PE y BV785) para facilitar la discriminación entre no AECII y AECII. Para un enfoque de clasificación sin modificar (exclusión de anti-CD326 en la solución de tinción), los AECII se identifican como células negativas para linaje,SSC alto yautofluorescencia positiva/alta células. La autofluorescencia AECII puede identificarse en detectores de luz verde, por ejemplo, detectores FITC o GFP.
  4. Excluye dobletes o agregados usando la altura de dispersión directa vs. área ( FSC-H vs. FSC-A) y la altura de dispersión lateral vs. área ( SSC-H vs. SSC-A).
  5. Recoger las células clasificadas en un tubo que contenga DMEM suplementado con HEPES y FBS al 10% (v/v), y centrifugar para análisis o cultivo adicional.

6. Aislamiento de ARN de AECII fijado por PFA (opcional)

NOTA: En caso de que el AECII se aisle de ratones que hayan sido infectados, por ejemplo, con patógenos virales respiratorios, el aislamiento del AECII debe realizarse bajo condiciones BSL2 o BSL3, dependiendo del patógeno. Si el experimentador no tiene acceso a la clasificación celular bajo las condiciones de seguridad adecuadas, el AECII aislado usando el protocolo descrito anteriormente puede fijarse con PFA tras la tinción por anticuerpos. Este paso inactiva lospatógenos 10,11 y, por tanto, la posterior clasificación citométrica de flujo AECII puede realizarse bajo condiciones BSL1. Aunque las células ya no pueden emplearse para ensayos funcionales debido al proceso de fijación, son adecuadas para análisis moleculares.

  1. Para la inactivación de virus, fijar suspensiones unicelulares marcadas con anticuerpos en 500 μL de PFA al 4% (p/v).
    PRECAUCIÓN: Sólido inflamable. Es perjudicial si se traga o inhala. Causa irritación en la piel y daño ocular grave. Puede causar una reacción alérgica cutánea, irritación respiratoria y cáncer. Se sospecha que causan defectos genéticos. Mantente alejado del calor. SI TE TRAGAS: Llama a un CENTRO DE INTOXICACIÓN o médico si no te encuentras bien. SI SE INHALA: Lleva a la persona al aire fresco y mantenla cómoda para respirar. Llama a un CENTRO DE ENVENENAMIENTO o médico si te encuentras mal. SI ENTRA EN LOS OJOS: Enjuaga con cuidado con agua durante varios minutos. Quita las lentillas, si las tienes, y es fácil de hacer. Sigue enjuagando. SI ESTÁS EXPUESTO O PREOCUPADO: Busca consejo o atención médica.
    NOTA: En cumplimiento de las directrices 3R, en este estudio se utilizaron AECII de ratones no infectados. AECII se fijó durante 10 minutos a temperatura ambiente. La duración de la fijación debe analizarse individualmente para cada patógeno que suponga un riesgo potencial para los humanos y el medio ambiente. La posterior clasificación bajo condiciones S1 requiere una verificación previa en un laboratorio BSL2 o BSL3 de que no hay virus replicable presente tras la fijación de PFA.
  2. Después de la fijación, lava las células con DMEM y centrifuga durante 15 minutos a 140 x g.
  3. Resuspender las células en 300 μL DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS y pasar la suspensión de celdas a través de un colador de 100 μm.
  4. Enjuaga el colador celular con un medio adicional de 300 μL de DMEM + HEPES + 10% (v/v) de FBS para evitar una pérdida excesiva de células.
  5. Ordena las celdas como se describe en el paso 5. "Clasificación de AECII".
    NOTA: Tras la verificación experimental obligatoria de que cualquier virus fue inactivado por tratamiento con PFA al 4% (p/v), el AECII puede clasificarse bajo condiciones BSL1.
  6. Para aislar ARN de células fijadas con PFA, utilice el kit FFPE RNeasy.
    PRECAUCIÓN: Este kit contiene productos químicos peligrosos. Sigue las instrucciones del fabricante. Presta atención a la hoja de datos de seguridad incluida, con los siguientes ajustes:
    1. Después de la clasificación, centrifuga las celdas durante 15 minutos a 140 x g a 4 °C.
    2. Resuspende las celdas en PKD de 150 μL y transfiere a un tubo de 1,5 mL.
    3. Añadir 10 μL de Proteinasa K e incubar a 56 °C durante 15 minutos, seguido de una incubación a 80 °C durante hasta 15 minutos, dependiendo del recuento celular (véase la Tabla 1).
  7. Continúa con el proceso de aislamiento de ARN según el protocolo, incluyendo tratamiento con DNasa, pasos de lavado y elución final en 30 μL de agua libre de RNasa.

Resultados

El protocolo aquí descrito representa un método optimizado y detallado para aislar y analizar AECII de tejido pulmonar de ratón en diversas etapas del desarrollo, que van desde neonatales hasta juveniles y adultos. La metodología implica disociación pulmonar mecánica y enzimática, combinada con un flujo de trabajo optimizado de clasificación celular citométrica de flujo, utilizando protocolos personalizados adecuados para procesar muestras de animales infectados para posterior Clasificación de Flujo bajo condiciones BSL1.

Los datos experimentales revelaron una alta eficacia de este procedimiento de aislamiento (resumido en la Figura 1) en la producción de poblaciones AECII viables y altamente puras (>95%). La clasificación por flujo generó poblaciones puras de AECII, con análisis post-clasificación que validó casi el 100% de especificidad para marcadores celulares establecidos (Figura 2). La cuantificación de muestras celulares post-clasificación indicó altos rendimientos entre 0,15 × 106 AECII viables en pulmones neonatales y 1,0 × 106 células en muestras adultas por preparación pulmonar completa (Figura 3A). Los AECII aislados mantuvieron la morfología típica (Figura 3B) e integridad celular durante todo el proceso de aislamiento (Figura 3C). Además, se confirmó la aplicabilidad del protocolo para estudios funcionales mediante una infección ex vivo exitosa utilizando un IAV adaptado al ratón (H1N1, cepa A/Puerto Rico/8/34) que expresaba la proteína reportera mCherry (IAV-mCherry12), con una demostración de la capacidad de las células para soportar la replicación viral (Figura 4).

Para apoyar flujos de trabajo experimentales que requieren fijación de muestras, el protocolo incluye un enfoque especializado de extracción de ARN mediante fijación de PFA. Un examen exhaustivo de la calidad del ARN de AECII fijado por PFA en diferentes puntos de procesamiento indicó que el ARN de alta calidad susceptible de análisis moleculares posteriores puede extraerse de forma fiable de muestras fijas (Tabla 1). La calidad del ARN extraído mostró una relación directa con la duración del tratamiento térmico a 80 °C durante el procedimiento de extracción, ofreciendo directrices claras de optimización basadas en necesidades experimentales particulares (Tabla 1, Figura 5). La validación mediante análisis cuantitativo por transcripción inversa PCR (qRT-PCR) mostró una amplificación exitosa tanto de genes de mantenimiento (proteína ribosómica S9, Rps9) como de marcadores específicos de AECII (proteína tensioactiva C, Sftpc) con muestras fijadas en PFA y preparaciones control frescas (Figura 6).

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Figura 1: Flujo de trabajo esquemático para el aislamiento de AECII en pulmones neonatales, juveniles y adultos de ratón utilizando digestión enzimática de tejidos y clasificación celular citométrica de flujo. El diagrama ilustra el procesamiento sistemático de los pulmones de ratón de diferentes grupos de edad. La eutanasia de ratones y extracción pulmonar es seguida por una digestión enzimática en varios pasos con dispasa para la desintegración tisular. Tras la interrupción mecánica, las células se purifican mediante una serie de pasos de filtración con poros disminuyendo. Posteriormente, los eritrocitos se lisan. El enriquecimiento específico de AECII se logra mediante selección negativa mediante marcaje de anticuerpos frente a marcadores hematopoyéticos (CD45, CD11b, CD11c, F4/80, CD19, CD16/32), marcador endotelial CD31, marcador plaquetario CD93 y marcador de células epiteliales bronquiales CD24, selección positiva de células epiteliales mediante marcaje de anticuerpos frente a CD326 y posterior clasificación citométrica de flujo basada en elcaracterístico alto SSC Perfil de AECII granular. Este protocolo permite aislar AECII primarios altamente puros (≥ 95%), viables para análisis funcionales y moleculares posteriores. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Estrategia representativa de gating utilizada para el aislamiento de AECII de ratones adultos. (A) Las suspensiones monocelulares pulmonares se teñieron con anticuerpos contra los siguientes antígenos: F4/80, CD93, CD11c (acoplado a APC), y CD19, CD31, CD11b, CD16/32, CD45, CD24 (acoplado a PE) y CD326 (acoplado a BV785). (B) Reanálisis (A) para análisis de pureza. Los AECII clasificados fueron reanalizados para confirmar la pureza del 97,2% de los AECII. (C) Imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de AECII tras la clasificación. Los núcleos se teñieron con DAPI (azul). La tinción intracelular se realizó utilizando un anticuerpo anti-SPC primario (especie: conejo), y la tinción secundaria se realizó usando IgG anti-conejo de cabra acoplado a Alexa 594 (rojo). AECII tintado solo con DAPI y anticuerpos secundarios, y los esplénocitos teñidos con anticuerpos primarios y secundarios sirvieron como controles relevantes, indicando la unión específica de anti-SPC así como de anti-rabbitAlexa 594. Barras de escala: 20 μm. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Rendimiento, morfología y vitalidad de AECII tras la clasificación celular activada por fluorescencia. (A) Número total de AECII viables por pulmón obtenidos de ratones neonatales, juveniles y adultos. (B) Imagen de microscopía óptica del AECII ordenado después de la clasificación. Barra de escala: 75 μm. (C) Viabilidad del AECII observada mediante tinción de azul tripánico tras la clasificación. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Infección ex vivo de AECII clasificado con IAV-mCherry. Las células AECII aisladas de ratones adultos se cultivaron ex vivo en placas de cultivo tisular recubiertas con Matrigel durante la noche para permitir la inserción. Posteriormente, las células se infectaron con IAV-mCherry (multiplicidad de la infección 2) durante 8 horas. Se observó un aumento dependiente del tiempo en la intensidad de la señal de mCherry. Barra de escala: 200 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5: Integridad del ARN del 4% de PFA fijo AECII. Perfiles representativos de ARN de PFA fijados y clasificados en AECII tras el aislamiento de ARN utilizando el kit Qiagen FFPE RNeasy con modificaciones. Los picos específicos para el ARNr 18S y 28S, junto con el número de calidad del ARN (RQN), representan la integridad y calidad del ARN para el ARN aislado intacto de AECII fijado por PFA. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 6: Curvas de amplificación del gen de mantenimiento Rps9 y del gen específico de AECII Sftpc de control (sin tratar) y un 4% de PFA fijado. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

EjemploTiempo de incubación a 80 °C28S/18SRQNConc. de ARN [ng/μ]
Control 0,5x106-2105.8
Control 1x106-1.91012.3
PFA fijo 0,5x106526.45.5
PFA fijo 0,5x106101.98.13.7
PFA fijo 0,5x106151.88.22.76
PFA fijo 1 x106528.26.26
PFA fijo 1 x106101.18.45.12
PFA fijo 1 x106150.98.55

Tabla 1: Calidad del ARN aislado del 4% de AECII fijo por PFA - impacto de diferentes tiempos de fijación. El ARN de AECII se aisló según el protocolo del fabricante (FFPE RNeasy Kit) con modificaciones descritas en el paso 6. Las células fijas se incubaron a 80 °C durante 5 minutos, 10 minutos o 15 minutos para eluir el ARN de la muestra. La integridad del ARN se determinó utilizando el Fragment Analyzer de Agilent

Discusión

El protocolo optimizado aquí descrito proporciona un enfoque fiable y reproducible para el aislamiento y análisis de AECII a partir de tejido pulmonar de ratón en edades neonatales, juveniles y adultas. Además, proporciona un paso opcional de fijación de PFA antes de la clasificación, lo que permite clasificar AECII de ratones bajo condiciones BSL1, incluso si previamente han sido infectados con patógenos respiratorios. Mediante la combinación de exposición pulmonar cuidadosamente realizada y perfusión, seguida de la instillación intratraqueal de enzimas y agarosa de baja fusión en el pulmón, se mantiene la estructura tisular, permitiendo la recuperación de suspensiones unicelulares de alta calidad para análisis posteriores. La adición de la clasificación citométrica de flujo en propiedades de dispersión lateral, gating lineage-negativo y selección positiva para células CD326-positivas dio lugar a poblaciones notablemente puras de AECII. Esta pureza es de particular importancia para garantizar que los ensayos moleculares y funcionales posteriores sean representativos de la biología intrínseca de AECII y no se confundan por tipos celulares contaminantes, mejorando la interpretabilidad de los estudios de expresión génica e interacción virus-huésped.

El protocolo mencionado anteriormente incluye la exclusión de anticuerpos no AECII utilizando una amplia gama de anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos contra antígenos leucocíticos y no leucocíticos, y la posterior selección positiva de AECII mediante propiedades de dispersión lateral y expresión de la molécula específica de células epiteliales CD326. Aunque se demostró que esta metodología resultaba en poblaciones de AECII altamente puras (utilizando SPC, un marcador emblemático de AECII), la pureza de las poblaciones obtenidas solo pudo confirmarse mediante tinción intracelular posterior al ordenamiento, hasta el momento. Este protocolo puede aplicarse para aislar AECII de pulmones infectados por SARS-CoV-2 y el virus de la gripe, en los que los AECII son principalmente el objetivo del virus y muestran adaptaciones celularesdistintas 1. Sin embargo, este método puede no ser adecuado para aislar AECII murinos en el contexto de estudios de biología del cáncer de pulmón, ya que EpCAM (CD326) también se expresa por células del cáncer pulmonar en ratones yhumanos 13. Para estos estudios, el uso de cepas transgénicas de ratón que expresen proteínas fluorescentes bajo el control transcripcional del promotor Spc podría proporcionar un enfoque más adecuado para el aislamiento fiable de AECII primarios.

Un rendimiento de 0,15 × 10 6 AECIIviables por pulmón neonatal y hasta 1,0 × 106 células por pulmón adulto ilustra la eficiencia y escalabilidad del protocolo. Un obstáculo importante para el aislamiento exitoso de grandes cantidades de AECII es la digestión enzimática ineficiente y la desintegración mecánica del tejido pulmonar. Por tanto, es crucial asegurar el llenado completo de los espacios broncoalveolares con la enzima en el paso 2.1.4 y realizar cuidadosamente la desintegración mecánica del tejido en el paso 3.1.3. Una digestión enzimática efectiva produce una suspensión de células turbias con una contribución mínima de agregados visibles que normalmente pueden desintegrarse usando un émbolo en los siguientes pasos del filtro. Los agregados más grandes que no pueden pasarse por el colador celular suelen surgir como consecuencia de una digestión enzimática insuficiente. Ten en cuenta que no se recomienda prolongar los tiempos de digestión enzimática, ya que esto podría afectar negativamente a la inmunotinciónposterior 14 y, por tanto, a la precisión del aislamiento AECII basado en FACS.

Además de la eficiencia de la desintegración enzimática y mecánica del tejido, el fondo genético puede influir en el rendimiento de AECII. Para este protocolo, se utilizaron ratones con fondo C57BL/6. En línea con las diferencias específicas de15 en el desarrollo reportadas,inmunológicas 16 yfisiológicas 17,18,19 específicas de cepas, es concebible que el uso de otras cepas de laboratorio de ratones (por ejemplo, BALB/c, DBA) pueda resultar en diferentes rendimientos de AECII. Además, el rendimiento de AECII por pulmones inflamados (infecciosos o no infecciosos) puede reducirse significativamente. Esto puede ser resultado de la muerte celular indirecta (inflamatoria) o directa (mediada por patógenos) de los AECII, que representan objetivos principales para, por ejemplo, IAV20,21 y SARS-CoV-2 22,23,24.

La preservación de la integridad celular durante la disociación mecánica, la digestión enzimática y la clasificación de flujo es aún más clave para análisis moleculares y/o funcionales posteriores. Por lo tanto, se evaluaron la viabilidad y función celular de AECII tras la selección. AECII fueron capaces de adherirse a Matrigel y mantener una morfología característica rica en cuerpo laminar durante al menos 24 horas, lo que indica competencia funcional tras aislamiento y idoneidad para el cultivo ex vivo (incluidos modelos de infección).

La infección eficiente de AECII clasificado con el virus reportero IAV-mCherry12 y la observación de una fuerte replicación viral validan este sistema como una plataforma robusta para elucidar respuestas antivirales epiteliales intrínsecas. Dado que AECII regula procesos clave implicados en la biosíntesis de tensioactivos, la regeneración alveolar y la inmunidadinnata 25,26, la capacidad para examinar la cinética de replicación del IAV y las respuestas transcripcionales del hospedador en poblaciones purificadas de AECII proporcionará conocimientos no obtenibles en preparaciones de células mixtas.

Una innovación clave de este protocolo es la inclusión de un procedimiento de fijación, que permite el análisis lado a lado de muestras frescas e inactivadas. La fijación de PFA y los procesos adaptados de extracción de ARN de FFPE mantienen la integridad del ARN en un grado compatible con los análisis transcriptómicos posteriores, como lo demuestra la exitosa PCR cuantitativa por transcripción inversa (qPCR).

Los tiempos de fijación de PFA pueden afectar la calidad de la tinción y, por tanto, la recuperación de AECII por FACS. Además, el rendimiento y la calidad del ARN generalmente se ven afectados por los procesos de fijación. Dependiendo del modelo de infección in vivo utilizado, estos aspectos deben considerarse para el diseño experimental. Se recomienda evitar un tiempo de fijación prolongado y, en su lugar, optimizar la duración del tratamiento con PFA para que se utilice el tiempo mínimo necesario, lo que ha demostrado experimentalmente que garantiza la inactivación completa del virus correspondiente.

La evaluación de la abundancia de ARN ribosómico (ARNr) mediante un instrumento de microfluídico sirve como sustituto para estimar la calidad del ARNm en muestras biológicas. El protocolo de fijación/aislamiento de ARN descrito por AECII permite aislar ARN intacto con suficiente calidad para análisis transcriptómicos posteriores, como lo demuestran las relaciones de ARNr 28S/18S >1 y los valores de número de calidad de ARN (RQN) >8. Es importante señalar que el paso de incubación de 80 °C reduce críticamente el rendimiento y la calidad del ARN. La adaptación de los tiempos de tratamiento térmico puede aplicarse opcionalmente para aumentar el rendimiento y la calidad del ARN en aplicaciones posteriores.

En conjunto, estas mejoras metodológicas proporcionan un conjunto extenso de herramientas para el estudio de la biología AECII en el contexto de la salud, las enfermedades infecciosas y el desarrollo (de recién nacido a adulto). El alto rendimiento y pureza de los AECII aislados por este enfoque permiten un perfilado multiómico, que abarca ensayos transcriptómicos, proteómicos y de accesibilidad a la cromatina, así como ensayos funcionales (por ejemplo, infección ex vivo ) para diseccionar aún más los mecanismos relevantes de AECII in vivo.

Divulgaciones

Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer a Tatjana Hirsch y Friederike Kruse por su experta asistencia técnica, a Lisa Hönicke y Justine Smout por sus útiles debates, y a Yoshihiro Kawaoka por proporcionar el virus IAV-mCherry reporter. Este estudio fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana para la Investigación) - TRR 359 - Proyecto número 491676693 (a D.B. y J.H.), la iniciativa COVIPA (KA1-Co-02, Asociación Helmholtz; a D.B.), y una subvención de la Fundación Alemana para la Investigación (BO 7036/1-1; a J.D.B.). Agradecemos el apoyo del Fondo de Publicación de Acceso Abierto de la Facultad de Medicina de la Universidad Otto-von-Guericke de Magdeburgo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Búfer ACK--8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 200 y micro; L de 0. 5 M EDTA, añade 1000 mL de Milli-Q, ajusta el pH a 7,2 a 7,4
CD11b anti-ratóneBiociencia12-0112-83clon M1/70; PE acoplado
anti-ratón CD11cBioleyenda117310clon N418; APC acoplado
antiratón CD16/32BD Biociencias553141clon 93; purificado
antiratón CD16/32BD Biociencias561727clon 2.4G2; PE acoplado
antiratón CD19Bioleyenda115508clon 6D5; PE acoplado
anti-ratón CD24Bioleyenda101808clon M1/69; PE acoplado
anti-ratón CD31Bioleyenda102408clon 390; PE acoplado
anti-ratón CD326Bioleyenda118245clon G8.8; BV785 acoplado
CD45 antiratónBD Biociencias553081clon 30-F11; PE acoplado
anti-ratón CD93eBiociencia17-5892-82clon AA4-1; APC acoplado
F4/80 antiratónBioleyenda123116clon BM8; APC acoplado
anti-ratón SPC ABCAMab211326Especie hospedadora: conejo; Clon: EPR19839; purificado
Aria-FusiónBD BiocienciasClasificador de celdas
Aria-II SORPBD BiocienciasClasificador de celdas
Placa Biozym AgarosaBiozym8401011 % (v/v) en H2O
Colador celular (100 y micro; M, 70 y Micro; M, 40 y micro; m)BD Falcon352360, 352350, 352340
CellTrics (50 & micro; m)Sysmex04-004-2327
Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino, 2000 unidades de Kunitz/vialSigma-AldrichD4263Contenido de disolución fresca de 1 vial en 330 & micro; L DMEM
Dispase, 100 mL (5000 unidades caseinolíticas)Corning354235realizar filtración estéril (tamaño de poro 0,22 & micro; m), preparar 4 mL de alicotas en tubos de 15 mL, almacenarlas a -20 y grado; C
DMEMGibco31885-049Glucosa baja, con piruvanato, añadir HEPES (concentración final de 25 mM)
FACS DivaBD BiocienciasSoftware de clasificación
FlowJoSoftware de evaluación para datos FACS
Anti-Conejo de la CabraAlexa 594 acoplada
Cánula permanente Introcan 22GBraun4252098B
RNeasy FFPE KitQiagen73504
Sinfonía S6 SEBD BiocienciasClasificador de celdas

Referencias

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