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Artículo de método

Imagen intravital de dos fotones de la morfología del axón sensorial táctil en piel de ratón

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DOI:

10.3791/69589

⸱

30 de diciembre de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este estudio presenta un enfoque in vivo de imagen de dos fotones para visualizar las estructuras de terminales axonales de mecanorreceptores de bajo umbral (LTMR) en la piel de la pata delantera de ratones. Utilizando imágenes repetidas y de alta resolución de axones individuales, este método proporciona una nueva plataforma para estudiar la estructura y función del circuito sensorial cutáneo durante el desarrollo y en adultos.

Resumen

Los mecanorreceptores de bajo umbral (LTMR) son neuronas somatosensoriales que detectan estímulos inocuos de luz al tacto como la vibración, la desviación del cabello y la presión. Forman terminales axonales específicos de subtipo en la periferia y proyectan axones centralmente hacia la médula espinal para transmitir información táctil. La comprensión actual del desarrollo y organización de los LTMR proviene de tejidos fijos que no pueden revelar los procesos dinámicos y temporales del cableado y remodelación axonal. Aquí se presenta un método de imagen de dos fotones para visualizar la morfología axonal LTMR en la pata delantera del ratón durante el desarrollo y en adultos. La microscopía de dos fotones puede lograr imágenes de alta resolución dentro de la piel intacta, permitiendo la obtención repetida de imágenes de los mismos terminales axonales en puntos temporales posnatales. La imagen de dos fotones puede combinarse con nuevas herramientas genéticas en ratones para revelar el desarrollo de axones con especificidad por subtipo. La imagen crónica de los LTMR permite estudiar el montaje y reparación de circuitos tras una lesión. Estos enfoques proporcionan un sistema in vivo que proporcionará nuevas perspectivas sobre los mecanismos celulares que regulan el desarrollo y la regeneración de axones somatosensoriales.

Introducción

El tacto es el sentido más antiguo que se desarrolla y desempeña un papel central en cómo los organismos experimentan y responden al mundo físico. El tacto se detecta mediante mecanorreceptores de bajo umbral (LTMR), que son subtipos de neuronas ganglionares de la raíz dorsal (DRG) que detectan estímulos mecánicos inocuos, incluyendo hendidura, vibración y desviación delcabello 1,2. Los LTMR son pseudounipolares y extienden axones periféricos hacia los tejidos periféricos para formar terminales específicos de subtipo. Sus axones centrales transmiten información táctil al sistema nervioso central formando conexiones sinápticas con las neuronas de la médulaespinal 3. Sin embargo, cómo se establecen y mantienen los circuitos táctiles se entiende poco.

Estudios fundamentales anteriores en gatos durante las décadas de 1960 y 1970 identificaron por primera vez estos mecanorreceptores funcionalmente distintos y sus propiedades de respuesta en pielpeluda 4,5. Los subtipos LTMR se clasifican por su morfología única, velocidad de conducción y propiedadesde respuesta 2. Los principales subtipos de LTMR son los LTMR de adaptación rápida (RA) y de adaptación lenta (SA), Aδ-LTMR yC-LTMR 2,6,7. Los RA-LTMR Aβ, Aδ-LTMR y C-LTMR forman complejos lanceolados longitudinales alrededor de los folículospilosos 2. Los Aδ-LTMR forman terminaciones lanceoladas polarizadas alrededor de los folículos pilosos en el lado caudal, una característica esencial para sus respuestas selectivas en dirección a la desviacióndel cabello 7. Las terminaciones axonales en los complejos lanceolatos están estrechamente alineadas con los tallos pilosos y están envueltas por procesos en forma de dedos procedentes de células terminales de Schwann, que proporcionan soporte trófico e influyen en la morfogénesisaxonal 8,9,10. En la piel glabra, los axones Aβ RA-LTMR terminan en los corpúsculos de Meissner, que son estructuras ovoidales situadas dentro de las papilas dérmicas que están sintonizadas para moverse a través de la piel 2,11.

La organización de los terminales axonales LTMR está regulada tanto por programas intrínsecos como por señales dependientes de la piel durante eldesarrollo 12,13. Cuando se daña, la disfunción LTMR se asocia a condiciones patológicas como la alodinia mecánica12,14. Sin embargo, los mecanismos para el desarrollo y mantenimiento de la LTMR en la piel intacta siguen sin estar claros. Gran parte de lo que se sabe sobre su desarrollo proviene de tejidos fijos, que no pueden capturar los procesos dinámicos que pueden tener lugar in vivo 6,15,16,17,18. Por ejemplo, los Aβ RA-LTMR y Aδ-LTMR presentan inervaciones activas alrededor de los folículos pilosos y poda axonal durante el desarrollo postnataltemprano 19. Se desconoce cómo se logra la inervación y el mantenimiento de los folículos pilosos in vivo.

La microscopía de barrido láser de dos fotones, una técnica avanzada de imagen que permite la visualización de estructuras marcadas con fluorescencia dentro de tejidos vivos, ha permitido la obtención de imágenes in vivo de alta resolución de procesos fisiológicosdinámicos 20,21. Durante la imagen de dos fotones, pulsos breves de luz infrarroja cercana excitan fluoróforos solo en el plano focal, confinando así la señal a un volumen pequeño y minimizando la fluorescenciadesenfocada 21,22. Este confinamiento reduce significativamente la fototoxicidad y permite imágenes tridimensionales y espacialmente resueltas deestructuras 20,23,24. Además, las longitudes de onda de excitación más largas utilizadas en la microscopía de dos fotones dispersan menos dentro del tejido, permitiendo una penetración más profunda y menor ruido en entornoscomplejos 20,25,26. Por ejemplo, la imagen de dos fotones reveló plasticidad sináptica estructural y actividades neuronales en neuronas del cuerno dorsal de la médulaespinal 27,28,29. Además, la imagen crónica in vivo de dos fotones de folículos pilosos reveló información sobre su homeostasis en la piel de la orejadel ratón 23. Por ello, la microscopía de dos fotones es muy adecuada para estudiar las estructuras de LTMR en la piel in vivo, especialmente cuando se requiere una imagen repetida y a largo plazo para seguir cambios en el desarrollo y crónicos.

Cuando se combina con líneas de ratón genéticamente modificadas que expresan reporteros fluorescentes, la microscopía de dos fotones puede revelar morfología neuronal en la piel3. En el sistema somatosensorial, la proteína fluorescente amarilla (YFP), expresada bajo el control del promotor thy1 (Thy1-YFP)30, marca selectivamente complejos lanceolatos Aβ-LTMR en piel peluda y corpúsculos de Meissner en piel glabra30,31. En ratones Thy1-YFP, los axones marcados son positivos para proteína básica de mielina y neurofilamento, que son marcadores para los axones Aβmielinizados 30,31. Además, TrkBCreER, en el que la Cre recombinasa inducible por tamoxifeno (CreER) es impulsada por la expresión del gen TrkB (receptor de tropomiosina quinasa B), marca selectivamente los Aδ-LTMR durante el desarrollo7. En la piel, la microscopía de dos fotones es más eficaz para la obtención de imágenes de RMD en ratones anestesiados, ya que el movimiento del ratón afectaría la adquisición de imágenes de alta resolución. Se tarda tiempo en visualizar las proteínas fluorescentes en los terminales axonales tras la expresión inducida por CreER, y es necesario determinar el periodo mínimo de espera para cada línea transgénica. En general, esta metodología puede aplicarse para visualizar los LTMR en ratones de todas las etapas del desarrollo y en adultos.

Este protocolo explica los procedimientos para utilizar la microscopía de dos fotones para investigar la morfología axonal de la LTMR en la piel peluda y glabra de ratones en desarrollo y adultos a alta resolución. El protocolo incluye varios consejos para una imagen óptima de alta resolución y crónica. Este enfoque integrador permite investigar los mecanismos celulares que impulsan el ensamblaje y la plasticidad de axones sensoriales táctiles in vivo.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se realizaron en cumplimiento con las normativas institucionales de cuidado animal y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Vanderbilt. Por la seguridad de los experimentadores, todos los procedimientos se realizaron con batas de laboratorio, guantes estériles y mascarillas. Todas las herramientas se esterilizaron a fondo antes de su uso, y todas las superficies experimentales se limpiaron con etanol al 70% antes y después de cada experimento. Los ratones utilizados en este estudio eran adolescentes y animales adultos de ambos sexos y derivaban de cepas de Thy1-YFP, TrkBCreER y Ai140. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de instrumentos

  1. Enciende el láser. Deja tiempo suficiente para que el láser se caliente. En este trabajo se utilizó el láser Chameleon Discovery NX, que tiene una duración de pulso de 100 femtosegundos (fs) y una tasa de repetición de 80 ± 0,5 megahercios (MHz).
  2. Enciende el microscopio de dos fotones y abre el software de control y adquisición en el ordenador.
  3. Enciende la almohadilla térmica y ponla a 37 °C para evitar hipotermia durante la anestesia.

2. Preparación de la anestesia y la pata delantera para la imagen

  1. Para inducir la anestesia, coloque al ratón en la cámara de inducción y ajuste el sistema al 3,5% de isoflurano hasta que pierda su reflejo de enderezamiento y muestre respiraciones suaves y regulares (siguiendo protocolos aprobados por la institución). El aire ambiente se usa como portador y debe ajustarse a 1,0 litro por minuto (L/min).
  2. Coloca el ratón sobre la almohadilla térmica de la plataforma de imagen y reduce el isoflurano al 1,5% y el oxígeno a 0,5 L/min. El isoflurano debe administrarse a través del cono nasal. Para ratones menores del día posnatal 20, el isoflurano se ajusta al 2-4% para mantener la anestesia. Monitoriza la profundidad anestésica cada 10 minutos evaluando la pérdida de los reflejos pedalebrales y palpebrales, la frecuencia y profundidad respiratoria, y el tono muscular general.
  3. Para minimizar los artefactos de movimiento durante la imagen, incluido el movimiento relacionado con la respiración, el ratón debe colocarse en un escenario separado de la pata. Para este protocolo, el cuerpo del ratón descansa sobre una plataforma directamente adyacente, pero sin tocarla, la plataforma de imagen donde está montada la pata.
  4. Aplica pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad durante la imagen.
  5. Aplica suavemente una crema depilatoria en la pata con un hisopo de algodón para eliminar el pelo. Después de dejarla reposar un minuto sobre la piel, quita la crema y luego limpia la pata del ratón con etanol al 70% y agua.
  6. Estira suavemente la piel para estabilizar la superficie. Usando una aguja estéril de 30 G y tinta negra, perfora suavemente la piel y el tatuaje con dos puntos adyacentes a cada lado de la región de imagen deseada. Asegúrate de que los puntos estén separados por unos 2 milímetros (mm). Una vez terminado el tatuaje, desecha correctamente la aguja en un recipiente para objetos punzantes.
  7. En una lámina de microscopio de vidrio, coloca cuatro puntos de grasa al vacío en las esquinas y coloca un pequeño trozo de arcilla (por ejemplo, arcilla para modelar con endurecimiento al aire DAS) de aproximadamente 1 mm de grosor en el centro de la lámina. Coloca la corredera bajo la lente del objetivo y centra la pata del ratón directamente sobre el trozo de arcilla (Figura 1A,B). Rueda suavemente la pata del ratón sobre la corredera para aplanarla y presionarla contra la arcilla. Coloca cuidadosamente una cubierta de 22 mm x 60 mm sobre la pata para asegurar el deslizador. Ajusta el ángulo de la piel del ratón aplicando una ligera presión en cada una de las esquinas de la capa de cobertura hasta que la superficie y la piel queden paralelas al plano de imagen. Usar una fuerza suave durante la imagen ayuda a prevenir posibles lesiones cutáneas.
  8. Para imaginar la piel glabra, coloca la corredera bajo la lente del objetivo y centra la pata del ratón en la corredera, como se detalla en el paso 2.7. Usa pinzas para girar la pata y que la piel glabra quede hacia arriba. Usa el extremo plano de las pinzas para presionar suavemente la pata contra la arcilla. Una vez que la pata esté plana, coloca la cubierta encima y presiona hacia abajo como se describe en el paso 2.7.

3. Microscopio de dos fotones con imagen de morfología LTMR

NOTA: Los siguientes parámetros pueden ajustarse según el experimento específico. Para este experimento se utilizó un objetivo de inmersión en agua de 20x con apertura numérica de 1 y distancia de trabajo de 2,00 mm. Los pasos 3.1-3.6 describen los parámetros específicos utilizados para la pata delantera derecha del ratón Thy1-YFP , que pueden servir como guía de referencia.

  1. Coloca una gota de agua destilada sobre la cubierta, justo sobre la pata del ratón.
  2. Baja la lente objetivo hasta que se forme una columna de agua.
  3. Una vez que la lente del objetivo esté centrada sobre la pata del ratón, cierra la caja del microscopio y utiliza la pantalla LED para enfocar la muestra mediante los controladores X, Y y Z. La pantalla LED muestra una imagen en vivo iluminada por el LED integrado en el microscopio.
    NOTA: El modo LED se utiliza para confirmar que la lente objetivo está centrada en el campo de interés antes de cambiar al modo de dos fotones. La imagen LED muestra características superficiales como vasos sanguíneos y folículos pilosos, sirviendo como guía visual para la alineación y la localización. Los tatuajes en la pata de ratón aparecen como manchas negras en la pantalla LED. Usando estos puntos de referencia, encuentra y enfoca la zona entre las manchas negras. Esto asegura que la misma zona de la pata del ratón se muestre repetidamente.
  4. Una vez que se encuentre la muestra, apaga la pantalla LED. Para realizar imágenes de dos fotones desde el tejido, cambia el microscopio de la configuración espejo a la dicroica girando una palanca en la parte superior derecha del microscopio.
  5. Cierra las cortinas opacas y enciende el detector para visualizar el YFP.
  6. Usando Prairie View, abre el obturador y cambia el software a modo de imagen. Para obtener imágenes de Thy1-YFP, enciende el láser sintonizable ajustado a 960 nanómetros (nm) con una ganancia de 700-800. Al hacer imágenes de GFP, ajusta el láser sintonizable a 920 nm.
    1. Para ratones del día 10 o más jóvenes en el postparto, se ajusta la potencia inicial del láser a 50, aumentando hasta alcanzar la intensidad deseada de la señal. Esta menor potencia inicial del láser minimiza la penetración de la luz y el riesgo de daño por foto. Después de ajustar la longitud de onda, ganancia y potencia del láser, comienza a escanear.
      NOTA: Para capturar una imagen de campo de visión de alta resolución 1,00x o una imagen de corpúsculos de Meissner con dedos glabros, se recomienda utilizar un tamaño de imagen de 1024 x 1024 con un campo de visión de imagen de 601,9 μm x 601,9 μm y un tamaño de píxel de 0,588 μm x 0,588 μm. Para obtener imágenes de terminaciones lanceoladas alrededor de los folículos pilosos, se recomienda tener un tamaño de imagen de 1024 x 1024 a un zoom de 8,00x, un campo de visión de 75,2 μm x 75,2 μm y un tamaño de píxel de 0,147 μm x 0,147 μm. Es importante señalar que el campo de visión de la imagen y el tamaño del píxel cambian con la configuración de zoom.
  7. Utiliza los controladores X, Y y Z para encontrar el campo de imagen, ajusta el zoom según sea necesario y comienza la adquisición de imagen. Una imagen óptima se obtiene típicamente en una posición inicial a unos 10-20 μm bajo la superficie de la piel.
    NOTA: Una imagen de alta resolución de la piel peluda suele tener un tamaño de paso de 1 μm o 2 μm con aproximadamente 40-120 cortes. Mientras tanto, una imagen de alta resolución de la piel glabra suele tener un tamaño de paso de 2 μm a 4 μm con aproximadamente 80-100 cortes. Esto da lugar a un rango típico de z de 100-250 μm, y la profundidad máxima total de imagen es aproximadamente de 300 μm.
  8. La sesión de imagen estará limitada a 25 minutos para minimizar la duración de la exposición al isoflurano y disminuir el riesgo de efectos adversos relacionados con la anestesia en el animal. El isofurano extra es absorbido por un filtro de carbón vegetal anestésico, que puede desecharse en basura normal.

4. Cuidados postoperatorios

  1. Quita la pata del ratón del lavaderos de cristal y vuelve a colocar el ratón en una jaula de recuperación.
  2. Mantén la jaula del ratón caliente sobre una almohadilla térmica hasta que el ratón se recupere completamente de la anestesia.
  3. Coloca al ratón de nuevo en su jaula de origen, observándolo durante 30 minutos adicionales para asegurarte de que se integra con sus compañeros de jaula.

5. Imagen crónica in vivo de la morfología de la LTMR

  1. Coloca el ratón bajo el microscopio de dos fotones siguiendo los pasos 2.4-3.3.
  2. Usando la pantalla LED, localiza los puntos de tinta de la sesión de imagen anterior. Orienta la pantalla entre los puntos para asegurarte de que la zona deseada queda capturada. Durante el modo de escaneo en el microscopio, comprueba si hay puntos de referencia, como nervios grandes o patrones de folículos pilosos, para asegurarte de localizar la misma zona.
  3. Una vez localizada la zona de imagen, sigue los pasos 3.4-3.6 para continuar con la imagen.
  4. Comprueba la calidad e intensidad de las imágenes, así como la morfología de los axones principales, obtenidas por excitación de dos fotones en la zona cutánea. Asegúrate de que los campos de imagen sean comparables a los tomados en la sesión anterior.

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Resultados

En este trabajo, se utilizó la microscopía de dos fotones para visualizar las estructuras axonales Aβ RA-LTMR y Aδ-LTMR en la piel durante el desarrollo y en adultos. Las terminaciones lanceolatas maduras, que aparecen en ratones alrededor del día 20 o superiores al postnatal, están completamentedesarrolladas 19,32. Se visualizó la organización general de los terminales de axones en la piel peluda de ratones adultos, como se muestra en la proyección de máxima int...

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Discusión

Este estudio demuestra el uso de microscopía de dos fotones para examinar la morfología de la LTMR en la piel intacta de ratones neonatales y adultos. Este enfoque de imagen longitudinal supera las limitaciones de la fijación tisular y permite la observación en tiempo real de las estructuras axonales en tejidos intactos. Las morfologías axonales Aβ RA-LTMR y Aδ-LTMR visualizadas mediante imágenes de dos fotones son consistentes con observaciones de tejidos fijados previamente con

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Divulgaciones

Los autores no informan de ninguna divulgación relevante.

Agradecimientos

Queremos agradecer a la Dra. Hannah Elam, la Dra. Snighda Mukerjee, Rachelle Larivee y la Dra. Tegy J. Vadakkan por todo su apoyo y ayuda a lo largo de esta investigación. Agradecemos a Ryan Michael Nuera por su ayuda en la puesta en marcha del sistema de isoflurano. Este trabajo cuenta con el apoyo de la Beca Hanna Gray del Instituto Médico Howard Hughes (Subvención# GT17518).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Objetivo 20x y guion n; Super NA 1.0Olimpo1-U2B965Montaje del microscopio de dos fotones
Hoja de cubierta 22x60VWR16004-330Montaje del microscopio de dos fotones
Plastilina para modelar con endurecimiento al aireDASMontaje del microscopio de dos fotones
Bomba de Aire para Anestesia (HF), 110VRWD Life Science Inc.R510-30Sistema isoflurano
Máscara concéntrica de anestesiaRWD Life Science Inc.R510-MSistema isoflurano
Cámara de inducción de anestesia y guion; Ratón y RataRWD Life Science Inc.V105Sistema isoflurano
Microscopio de escaneo láser Bruker Ultima Investigator PlusBruker Nano, Inc. Montaje del microscopio de dos fotones
Agujas de mariposaFisher Scientific1484041Montaje del microscopio de dos fotones
Chameleon Discovery NX con TPC: DualCoherente1385777Montaje del microscopio de dos fotones
Mascarilla de cono con tubo para ratones neonatalesRWD Life Science Inc.68680Sistema isoflurano
Filtros de emisión dobles (et525/70m y et595/50m) y t565lpxr  Divisor de haz dicróicoNikonINVP-01Montaje del microscopio de dos fotones
Conjunto de filtros de epifluorescencia ET-GFP ET470/40x y ET252/50m; T495LPXR dicroicos y nbsp;Nikon518065Montaje del microscopio de dos fotones
EtanolDecon Laboratories Inc.Montaje del microscopio de dos fotones
Almohadilla de calentamiento infrarrojo lejano con controlador (alimentación de corriente alterna)Kent ScientificRT-0515Montaje del microscopio de dos fotones
Detectores GaAsp (2) Fotónica Hamamatsu  HED-UP-2 Montaje del microscopio de dos fotones
Contenedores de filtro de gasRWD Life Science Inc.R510-31-6Sistema isoflurano
Grasa de alto vacíoSigma AldrichZ273554Sistema de imagen
Isoflurano, USP (250 mL)Cuidados Críticos Piramal.6679-017-25Sistema isoflurano
Caja de cubierta láser  Tecnología TecoSistema de imagen
Ratones: B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/JJAX27214
Ratones: B6. Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP, CAG-tTA2)Hze/JJAX30220
Ratones: B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/JRío Charles3709
Crema Depilatoria NairAmazon28001Montaje del microscopio de dos fotones
Archivos de datos en brutoZenodo10.5281/zenodo.17370834
Soporte rígido con soporte rectangular grande para insertosThorlabsMP15MMontaje del microscopio de dos fotones
Plataforma de Operaciones de Anestesia para Animales PequeñosRWD Life Science Inc.R510-PGLSistema isoflurano
Ungüento lubricante para los ojos para calmarBausch + LombMontaje del microscopio de dos fotones
Portaobjetos de microscopio Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15Montaje del microscopio de dos fotones

Referencias

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