Method Article

Aislamiento y cuantificación de ARNm axonales mediante inserciones porosas de membrana y RTddPCR

DOI:

10.3791/69601

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February 6th, 2026

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1Department of Biological Sciences, Rutgers University- Newark, 2College of Arts & Sciences, Boston University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio presenta un método robusto para aislar ARNm axonales utilizando inserciones de membrana porosas, permitiendo la separación total de neuronas frente a neuritas y la purificación de ARN. Combinado con RTddPCR, el enfoque permite la cuantificación absoluta de transcritos de baja copia, facilitando estudios sobre el transporte de ARNm y la traducción local con alta sensibilidad, reproducibilidad y amplia aplicabilidad experimental.

Abstract

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La dinámica espacial de la localización y traducción del ARNm dentro de las neuronas es esencial para diversos mecanismos de función neuronal, incluyendo la conectividad neuronal, la plasticidad sináptica y la respuesta a la lesión. Debido a la extrema polaridad de las neuronas, muchas de estas funciones dependen de la capacidad de los axones para traducir localmente transcritos específicos. Sin embargo, cuantificar estas poblaciones subcelulares de ARN sigue siendo técnicamente complicado. Aquí describimos un enfoque reproducible para obtener compartimentos somáticos y enriquecidos axónicamente separados a partir de neuronas de roedores cultivadas y para cuantificar la expresión de ARNm específico de compartimento. Las neuronas embrionarias o adultas primarias de roedores se cultivaron en insertos con una membrana porosa de tamaño 1-3 μm. Estas membranas solo permiten a los axones, permitiendo la separación física de los compartimentos somático y axonale. Posteriormente, se aisló ARN de las fracciones enriquecidas con ajones de toda la neurona y de los axones, que se utilizaron posteriormente para la PCR digital de gotas de transcriptasa inversa (RTddPCR) con cebadores específicos de cada gen. Este sistema ofrece una comparación cuantitativa absoluta entre compartimentos subcelulares, permitiendo la detección de alta sensibilidad de transcritos localizados. Este enfoque mide la abundancia de ARN en estado estacionario y facilita el examen de los cambios del ARN axonal a lo largo del tiempo en respuesta a factores neurotróficos, modelos de estrés o lesiones. La combinación de compartimentación física y análisis RTddPCR reduce la contaminación cruzada y proporciona números exactos de copias de transcritos raros, ofreciendo alta sensibilidad, reproducibilidad y detección de ARNm de bajo número de copias que controlan el crecimiento y la regeneración de axones. Este método también funciona con pruebas posteriores, como medir la síntesis de proteínas, estudiar la estabilidad del ARN y realizar experimentos de perturbación utilizando siRNA o fármacos que bloquean ciertas proteínas. Es importante destacar que esta técnica puede adaptarse a diferentes subtipos neuronales, etapas de desarrollo o modelos de lesiones. En general, este enfoque es una forma flexible, sensible y reproducible de estudiar la base molecular de la localización del ARNm axonal y cómo afecta a la función neuronal y a los mecanismos de la enfermedad.

Introduction

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Las neuronas son una de las células más estructuralmente complejas y polarizadas de la biología. Tienen procesos largos que a veces pueden alcanzar distancias superiores a un metro. Esta polaridad complica la comunicación celular y la homeostasis de las proteínas de maneras distintas. Un enfoque refinado para abordar estos requisitos es transportar ARNm a compartimentos remotos como axones y denritas, facilitando su traducción de manera regulada en respuesta a señales localizadas 1,2,3. La traducción local permite que los axones sintetizen proteínas de manera espaciotemporal. Este proceso es crucial para el desarrollo axonal, la plasticidad sináptica, la regeneración tras una lesión y las respuestas a estímulos del desarrollo y extracelulares 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

La capacidad de analizar las funciones de los ARNm localizados en axones es crucial para comprender sus funciones tanto en la función neuronal normal como en el contexto de la fisiopatología. La desregulación de la traducción del ARNm axonal se ha relacionado con diversas enfermedadesneurodegenerativas16, como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)17,18,19, la atrofia muscular espinal (SMA)20,21 y la enfermedad de Alzheimer (EA)22. La regeneración axonal tras el daño depende en gran medida de la rápida y precisa traducción de proteínas citoesqueléticas, moléculas de señalización y receptores 3,23,24,25,26,27,28. A pesar de estos conceptos novedosos, la disciplina sigue enfrentando desafíos para cuantificar y capturar eficazmente poblaciones de ARNm específicas de axones.

Uno de los retos de la transcriptómica axonal es conseguir que el soma y los axones se separen limpiamente. Como la mayoría de los ARNm están enriquecidos en el soma, incluso pequeñas cantidades de contaminación por parte del cuerpo celular pueden afectar los resultados al evaluar el contenido axonal de un ARNm concreto. Las técnicas convencionales, incluyendo las cámaras microfluídicas 29,30,31,32 o las cámaras Campenot 33, proporcionan crecimiento axonal direccional y separación clara entre ambos compartimentos, pero el rendimiento axonal puede ser demasiado bajo para estudios bioquímicos como la secuenciación masiva de ARN (RNA-seq), la co-inmunoprecipitación de ARN seguida de secuenciación de ARN o la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (qPCR). El ARN-seq a granel y la qPCR, aunque beneficiosos, carecen frecuentemente de la sensibilidad necesaria para identificar con precisión transcritos de baja copia en axones, lo que resulta en una estimación incorrecta de especies fisiológicamente significativas.

Para abordar estos desafíos, nosotros y otros hemos utilizado insertos de membrana permeables para la separación física de axones y somata 34,35,36,37,38,39,40,41. Estos insertos permiten que las neuronas se desarrollen sobre una superficie microporosa, y los axones pueden extenderse hacia el compartimento inferior a través de ellos, pero no el soma. Esta arquitectura básica pero eficaz permite cultivar un enorme número de neuronas con una clara separación física de soma y axones. El método basado en membranas es importante porque evita los problemas técnicos que conllevan los dispositivos microfluídicos y proporciona grandes cantidades de material axonal que puede utilizarse para estudios moleculares y bioquímicos. El sistema de inserción también es fácil de usar para cosas como lesiones mecánicas, lo que lo hace útil en muchos entornos experimentales relacionados con la reparación neuronal. El método descrito aquí optimiza aún más el rendimiento y la pureza neuronal refinando las condiciones de cultivo, ajustando las características de los poros de membrana e incorporando la validación basada en PCR digital de gotas de transcriptasa inversa (RTddPCR) para muestras de ARN axonal de bajo rendimiento.

También es importante asegurarse de que las fracciones axonales sean puras. Solo extraemos axones de la cámara inferior tras eliminar cuidadosamente cualquier material somático sobrante de la superficie superior. La validación del cebador muestra un fuerte enriquecimiento de marcadores axonales y ningún o insignificante marcador somático. La confirmación molecular refuerza esta distinción: las fracciones axonales están enriquecidas con ARNm axonales reconocidos como Gap43, y una menor expresión de Actγ42. Esto muestra que el sistema de inserción produce muestras axonales con contenidos insignificantes de soma, que son buenas para un examen más profundo.

Tras aislar fracciones axonales enriquecidas, el siguiente obstáculo es medir ARNm que existen en números de copias extremadamente bajos. El escaso material inicial procedente de las fracciones axonales y la presencia de mRNAs de bajo número de copias en los axones empujan los límites de sensibilidad de la PCR cuantitativa convencional de transcriptasa inversa (RT-qPCR), que utiliza curvas estándar para la cuantificación. Además, RT-qPCR tampoco proporciona los números absolutos de copia de un transcripto específico. RTddPCR, por otro lado, separa las muestras de ADNc en miles de gotas, lo que ayuda a obtener un recuento exacto de transcritos usando estadísticas de Poisson. Esto permite encontrar transcritos de forma fiable, incluso si solo unas pocas copias de los transcritos pueden estar presentes en un solo nanogramo de ARNtotal 5,6,7,43.

En este manuscrito, ofrecemos un enfoque simplificado, que incluye métodos para cultivar diferentes neuronas adultas o embrionarias de roedores en insertos, aislamiento de ARN de compartimentos enriquecidos con neuronas completas frente a ajones, comprobación de la pureza axonal y cuantificación absoluta basada en RTddPCR de copias de ARNm. Estos métodos pueden utilizarse para determinar los niveles de ARNm específicos, que se localizan en axones bajo condiciones basales, y cómo cambian tras la axotomía o en respuesta a la estimulación del factor de crecimiento o señales neurotóxicas. Combinando este método con co-inmunoprecipitaciones proteicas, también se puede evaluar la dinámica de los complejos ribonucleares de proteínas (RNP) en axones. Por ejemplo, hemos utilizado extensamente este método para estudiar los ARNm presentes en los gránulos axonales de la proteína activadora de proteínas Ras GTPasa 1 (G3BP1). G3BP1 es un componente central de los gránulosde estrés 44, y nuestros estudios previos han demostrado que inhibe la síntesis de proteínas axonales y, a su vez, bloquea tanto la regeneración axónica del SNP como la delSNC 5. Además, este método puede utilizarse para investigar el papel de la desregulación de la traslación axonal en diversas condiciones fisiopatológicas, incluyendo ELA, AME y EA.

El objetivo de este estudio es crear y probar un método sensible, reproducible y escalable para medir ARNm axonales. Al combinar cultivos compartimentados basados en inserciones con cuantificación basada en RTddPCR, proporcionamos al campo una solución a los problemas persistentes de la transcriptómica axonal. Esta metodología no solo permitirá descubrimientos esenciales sobre la traducción local, sino que también establecerá una base para investigaciones traslacionales centradas en intervenciones terapéuticas en reparación neuronal y neurodegeneración.

Protocol

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1. Preparar los insertos para la siembra de celdas

  1. Coloca los insertos con el tamaño de poro adecuado en una placa de 6 pozos.
    NOTA: Utilice un tamaño de poro de 1 μm para separar axones del soma y un tamaño de poro de 3 μm para separar todas las neuritas (axones y dendritas) del soma.
  2. Añade 100 μg/mL de poli-L-lisina (PLL) a la placa de 6 pozos de forma que toque la parte inferior de los insertos y la parte superior de los insertos (2 mL/pozo y 1 mL/inserto).
  3. Incubar durante la noche a 37 °C.
  4. Lava los pozos (la parte inferior de los insertos) y la parte superior de los insertos con agua ultrapura estéril - 4 lavados × 5 minutos.
  5. Solo para neuronas ganglionares de la raíz dorsal (DRG), añade 5 μg/mL de laminina (2 mL/pozo y 1 mL/inserto) e incuba durante al menos 1 hora a 37 °C. Asegúrate de que tanto la parte superior como la inferior del inserto estén recubiertas de forma uniforme.
  6. Lavar con solución fisiológica estéril tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4) que contenga 100 U/mL de penicilina/estreptomicina - 2 lavados × 5 minutos.
  7. Proceder con la disección y semilla alrededor de 1 × 106 células/insert para las neuronas colinérgicas cortical5 del hipocampo y 31,32 del cerebro anterior basal. Para DRGs de rata adulta, placa 6-8 DRGs/inserto 5,7 (Figura 1).

2. Colección de fracciones subcelulares neuronales de insertos de 6 pozos

  1. 250 μL de trizol cada uno en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL por inserto y un pozo/inserto de una placa de 6 pozos. Déjalo a un lado.
  2. En otra placa de 6 pozos, añade 2 mL/pozo de PBS estéril. El número de pozos/placas debe ser proporcional al número de insertos.
  3. Aspira el medio de cultivo de la parte superior e inferior del inserto y transfiere el inserto a una placa de 6 pozos que contiene PBS.
  4. Usando pinzas, coloca suavemente el inserto y añade 2 mL de PBS encima del inserto. Aspira medios de la parte superior e inferior del inserto y repite. En total, lava dos veces con PBS y déjalo en PBS fresco (1 mL y 2 mL en la parte superior e inferior del inserto, respectivamente).
  5. Aislamiento de toda la fracción neuronal
    1. Usando un raspador de células estériles, raspa toda la fracción neuronal (parte superior del inserto). Aplica la presión justa para que las células empiecen a soltarse, pero la membrana no se rompa (Figura 1).
    2. Recoge toda la neurona del inserto y transfierela a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
    3. Centrifuga el tubo a 10.000-15.000 g durante 2 minutos.
    4. Descarte el sobrenadante y vuelva a suspender el lisato en 250 μL de TRIzol.
    5. Etiqueta este tubo como la fracción neuronal completa.
    6. Continúa con la recogida de fracciones de neurita.
  6. Aislamiento de la fracción de neurita
    1. Toma un hisopo de algodón estéril y, usando un extremo, muévete en un patrón en zigzag de arriba a abajo muy despacio por todo el lado de la neurona. Gira el inserto 90 grados y repite el proceso con el otro extremo del hisopo (si usas un hisopo de doble cara, o usa un hisopo nuevo para uno de un solo lado). Desecha este hisopo (Figura 1).
    2. Usa un hisopo nuevo y avanza en círculos concéntricos, empezando por el centro del inserto y hacia fuera. Asegúrate también de limpiar las paredes (circunferencia).
    3. Invierte el inserto de membrana (con el lado de la neurita hacia arriba) y corta la membrana usando una hoja estéril nueva mientras la sujetas con pinzas. Asegúrate de dejar ~2-3 mm en la periferia.
    4. Coloca la membrana cortada en la placa de 6 pozos que contiene TRIzol con el lado del neurite hacia abajo. Asegúrate de que esté sumergido.
    5. Recoge el TRIzol que contiene el lisato de neurita de la placa de 6 pozos y transfiere a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
  7. Para lisados de neuronas enteras y neuritas, procede con aislamiento de ARN o guarda los lisados a -80 °C para procesarlos más adelante.

3. Aislamiento y cuantificación de ARN

  1. Aislamiento de ARN
    NOTA: Para esta parte, trabaja siempre en un entorno libre de RNasa con plásticos y guantes dedicados y estériles.
    1. Añade 0,2 mL de cloroformo por cada 1 mL de TRIzol, agita vigorosamente durante 15 s y incuba durante 2-3 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C para separar en capas: orgánica, interfase y acuosa (que contienen ARN).
    2. Transfiere la fase acuosa superior a un nuevo tubo, evitando la interfase. Para precipitar el ARN, añade 1 volumen de isopropanol y mezcla suavemente. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente (o más tiempo a -20 °C para mayor rendimiento) para precipitar ARN. Centrifugar a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C para aplicar ARN en bolítulos.
    3. Descarta el sobrenadante y lava el pellet con 1 mL de etanol al 75%. Brevemente vórtice y centrifugación a 7.500 × g durante 5 minutos a 4 °C.
    4. Disolución de ARN: Retira cuidadosamente el lavado con etanol y seca el pellet al aire durante 5-10 minutos, evitando que se resequa por completo. Suspende el pellet en un pequeño volumen de agua libre de RNasa o en 1x tampón Tris-EDTA (TE), incubando a 55-60 °C para una disolución completa. Almacena ARN purificado a -80 °C.
  2. Cuantificación de ARN usando el ensayo RiboGreen
    NOTA: El ensayo RiboGreen (más abajo) utiliza un colorante fluorescente específico para ácidos nucleicos, ofreciendo mayor sensibilidad, especificidad y capacidad para detectar ARN intacto que los métodos de absorción UV. Considera el tratamiento con DNasa si la contaminación por ADN es un problema.
    1. Prepara 1 tampón de TE, diluye el tampón de 20 veces TE proporcionado 20 veces con agua libre de RNasa. Prepara soluciones de trabajo RiboGreen y protege el tinte fotosensible con papel de aluminio. Diluir el tinte concentrado 1:200 en 1x TE para el ensayo de rango alto (10 ng/mL-1 μg/mL), o 1:2000 en 1x TE para el ensayo de bajo rango (2,5 ng/mL-50 ng/mL). Preparar los estándares de ARN mediante dilución serial del estándar de ARN del kit en 1x TE para cubrir el rango de muestra esperado. Ejecuta estándares en triplicado.
    2. Prepara las muestras diluyendo muestras de ARN en 1x TE para ajustarlas al rango dinámico del ensayo. Analiza muestras en triplicado.
    3. Añadir volúmenes iguales de solución de trabajo RiboGreen y estándar o muestra de ARN (por ejemplo, 100 μL cada uno). Incuba durante 2-5 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Mide la fluorescencia usando los ajustes apropiados (excitación ~500 nm, emisión ~525 nm). Mide y resta una lectura en blanco de reactivo (1x TE + tinte RiboGreen).
    4. Analizar y cuantificar: Graficar una curva estándar usando los valores de fluorescencia de los estándares frente a sus concentraciones. Utilice esta curva para determinar la concentración de ARN en las muestras (Figura 2).

4. Síntesis de ADNc

  1. Descongela todos los componentes sobre hielo. Mezcla suavemente cada tubo haciendo un chasquido y gira hacia abajo brevemente antes de usarlo. En un tubo de PCR sobre hielo, combina los siguientes componentes para cada reacción:
    Mezcla master RT (5x): 4 μL
    Muestra de ARN: variable (hasta 1 μg de ARN total)
    Agua libre de nucleasa: hasta 20 μL de volumen total
    NOTA: Para un control sin plantilla (NTC), sustituye la muestra de ARN por agua libre de nucleasa.
  2. Mezcla y centrifuga suavemente los tubos para recoger el contenido en la parte inferior y ejecuta el programa del termociclador.
    Recocido de imprimación: 25 °C durante 2 minutos
    Síntesis de ADNc: 55 °C durante 10 minutos
    Inactivación térmica: 95 °C durante 1 min

5. Diseño y validación de imprimaciones

NOTA: El diseño de cebadores RTddPCR generalmente sigue los mismos principios que la qPCR cuantitativa, pero requiere atención adicional para asegurar una separación clara de las gotas positivas y negativas. Utiliza herramientas de diseño de imprimaciones de NEB, IDT o ThermoFisher para facilitar este proceso. Un ensayo RTddPCR exitoso se define por una alta especificidad y amplificación robusta, lo que genera una separación clara entre gotas amplificadas (positivas) y no amplificadas (negativas). Se utilizaron los siguientes IDs de acceso NCBI RefSeq para diseñar cebadores de PCR:

Actg: NM_001127449.1
Delantero 1: CAGTCTAACAGGGGGGGGGAAAG
Reverso 1: CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC
Duración del amplicon: 98
Delantero 2: GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT
Reverso 2: GACTTTCCCCCCCTGTTAGAC
Duración del amplicon: 118

Gap 43: NM_017195,3
Delantero 1: GGAAATTCTTGCACTGTACCC
Reverso 1: GACTCCTCAGAACGGAACAT
Duración del amplicon: 122
Delantero 2: CAGTCATCTTGGGAAATTCTTGC
Reverso 2: CATTGCACACACACACTTGG
Duración del amplicón: 116

  1. Diseña una imprimación con la longitud recomendada de 18-30 pares de bases y un contenido de GC del 40-60%. Asegúrate de que la temperatura de fusión (Tm) esté entre 55-65 °C, y que los cebadores hacia adelante y hacia atrás estén entre 2 y 5 °C entre sí. Incorpora una pinza GC, una o dos bases G o C dentro de las últimas cinco bases en el extremo de 3′, para mejorar la especificidad de la fijación, pero evita tiradas largas de G o C.
  2. Valida la especificidad de los cebadores utilizando herramientas de alineación como la Herramienta Básica de Búsqueda Local de Alineación (BLAST) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) para asegurar que los cebadores solo se unan a la secuencia objetivo prevista. El diseño amplicona entre 50 y 200 pares de bases, siendo óptimos ~100 pares de bases, ya que los productos más cortos se amplifican de forma más eficiente y siguen siendo distinguibles de los cebadores-dímeros.
    NOTA: En este estudio, los productos de PCR corta suelen amplificarse con mayor eficiencia que los más largos en RT-ddPCR.
  3. Minimizar los dímeros de cebador diseñando cebadores con un contenido de GC del 50-60%, evitando estructuras secundarias y complementariedad de 3'. Durante la validación del cebador, utiliza electroforesis en gel de agarosa y siempre un control sin plantilla para evaluar los dímeros del cebador.
  4. Evita diseñar cebadores en regiones de la plantilla con alta probabilidad de formar estructuras secundarias, ya que esto puede interferir con la eficiencia de la amplificación.

6. RTddPCR

NOTA: Utilice el sistema QX200 ddPCR (Bio-Rad) para realizar la RTddPCR según las instrucciones del fabricante y como se describió anteriormente por Das et al. (2022)43, con algunos ajustes menores para mejorar la reproducibilidad del ensayo.

  1. Prepara las reacciones RTddPCR con mezcla universal lista para usar y cebadores específicos para el objetivo usando ADNc adecuado.
  2. Genera las gotas usando el generador de gotas.
  3. Lee la fluorescencia del punto final con el lector de gotas y analiza los datos con el software integrado.
  4. Emplear las siguientes medidas de control de calidad para asegurar una cuantificación precisa y la formación de gotas reproducibles:
    1. Ejecuta conjuntos de cebadores de forma consistente en la misma fila o columna para minimizar los efectos de la placa.
    2. Prepara mezclas maestras para reducir el pipeteo en pequeños volúmenes.
    3. Pipete a bajo caudal para evitar burbujas y emplea micropipetas multicanal para una dispensación uniforme de muestras.
    4. Manipula las placas con cuidado tras la generación de gotas y sella inmediatamente para evitar la evaporación.
    5. Prepara todas las reacciones sobre hielo y evita ciclos repetidos de congelación y deshielo para los reactivos.
    6. Incluye controles sin plantilla para cada conjunto de cebadores para monitorizar la contaminación.
    7. Excluir pozos que contengan menos de 10.000 gotas aceptadas del análisis.
    8. Realiza réplicas técnicas para todas las muestras para asegurar su reproducibilidad.
  5. Inspecciona manualmente los gráficos de amplitud de fluorescencia de gotas para verificar la precisión del umbral automático.

Results

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Las neuronas corticales del roedor embrionario primario, las neuronas del hipocampo y las BFCNs placadas en insertos de 1 μm recubiertos con PLL se adhieren robustamente y extienden las neuritas a través de la membrana durante 5-7 días in vitro (DIV). Para el año 11 DIV, las culturas muestran redes densas. Para los DRG de rata adulta, añadir una capa de laminina a insertos de 3 μm recubiertos con PLL ayuda a lograr una extensión axonal comparable de 5 DIV. Estas observaciones confirman la capacidad de los insertos para apoyar el crecimiento neuronal a largo plazo y proporcionar suficiente material axonal para la extracción posterior de ARN. En caso de necesidad de escalar, combinamos varios insertos para obtener suficiente material.

La extracción de TRIzol a partir de insertos individuales proporciona suficiente ARN para la transcripción inversa y la posterior ddPCR. La cuantificación de RiboGreen confirma rendimientos consistentes de ARN a partir de fracciones neuronales completas (212,85 ng/inserto) y rendimientos menores a partir de fracciones de neurita (42,75 ng/inserto) (Figura 2). Generalmente obtenemos ARN ~5-7 veces de toda la fracción neuronal frente a la fracción enriquecida con neuritas.

Todos los cebadores se validan antes de los experimentos RTddPCR. Para cada transcrito objetivo, se ordenan y analizan al menos dos conjuntos de cebadores mediante PCR convencional sobre ADNc generados a partir de las mismas muestras neuronales. El par de cebadores que produce la banda más fuerte y específica se selecciona para RTddPCR (Figura 3A). Por ejemplo, elegimos el conjunto de cebadores 1 para Gap43. En casos de resultados ambiguos, como los obtenidos para Actγ, realizamos una PCR de gradiente para optimizar las temperaturas de recocido (Figura 3B). Esto garantiza que solo se utilicen cebadores bien validados para la cuantificación absoluta, reduciendo la probabilidad de artefactos en la separación de gotas.

El procedimiento de raspado y muestra separa de forma fiable los compartimentos somático y neurítico. El ARN aislado de fracciones neuronales completas muestra enriquecimiento de transcritos, como Actγ 46,47,48,49 (Figura 4). En cambio, las fracciones de axones/neurita producen un ARN total notablemente menor, consistente con su volumen restringido, pero muestran enriquecimiento de transcritos conocidos por localizarse en procesos distales, como Gap43 (Figura 4). La detección cruzada mínima de transcritos restringidos por soma indica una alta pureza compartimental cuando los insertos se manipulan cuidadosamente y se placan a densidad óptima.

Los resultados positivos se caracterizan por: (1) morfología neuronal intacta con clara extensión axonal, (2) separación limpia de compartimentos sin rotura de la membrana, (3) cebadores validados que producen una separación clara entre gotas positivas y negativas, y (4) señales RTddPCR fuertes para transcritos axonales. Los experimentos subóptimos resultan en un bajo rendimiento de ARN, contaminación cruzada evidenciada por marcadores somáticos en fracciones de neuritas o artefactos RTddPCR como el aumento de la "lluvia" de gotas debido a la dimerización del cebador. Estos problemas suelen estar relacionados con daños en la membrana del inserto, presión excesiva de raspado o una optimización inadecuada de la temperatura de recocido del cebador.

Figura 1
Figura 1: Visión general del aislamiento de ARN específico por compartimento utilizando insertos de membrana. Las neuronas de roedores se cultivaron en insertos semipermeables con un tamaño de poro de 1-3 μm, lo que permite la extensión de neuritas mientras restringe el soma. Para la preparación de neuronas completas, las células del compartimento superior se rasparon usando un raspador celular estéril, se echaron en pellets y luego se lisaron en TRIzol para aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y RTddPCR. Los restos celulares residuales se eliminaron de la membrana insertada con un hisopo de algodón estéril. Para la preparación de neuritas, la membrana insertada que ahora solo contenía neuritas fue invertida y cortada con una hoja de bisturí, y sumergida directamente en TRIzol, seguida de aislamiento de ARN, síntesis de ADNc y RTddPCR. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Curva estándar de concentración de ARN usando el ensayo RiboGreen. (A) La intensidad de fluorescencia se midió usando el ensayo de cuantificación de ARN RiboGreen a través de una serie de dilución de estándares de ARN. Un análisis de regresión lineal reveló una fuerte correlación entre la concentración de ARN y la señal de fluorescencia (R² = 0,9956). El valor R² cercano a uno demuestra una excelente linealidad y fiabilidad del ensayo RiboGreen para una cuantificación precisa del ARN. (B) Utilizando la ecuación (y=19,738x + 14,905) para la pendiente obtenida en A, se calculó el ARN total para cada fracción. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3
Figura 3: Validación de cebador por PCR y electroforesis en gel de agarosa. (A) Los productos de amplificación por PCR usando cDNA para Actγ y Gap43 se resolvieron en un gel de agarosa al 2% para evaluar la especificidad del cebador. Para cada gen se probaron dos conjuntos de cebadores independientes (conjunto 1 y conjunto 2). Los marcadores de tamaño del ADN (escaleras) se muestran en los carriles adyacentes con pesos moleculares indicados (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Bandas simples distintas del tamaño esperado confirman la amplificación y especificidad exitosas de los conjuntos de cebadores seleccionados. (B) La amplificación por PCR se realizó utilizando el cebador Actγ conjunto 2 a lo largo de un gradiente de temperatura (55-65 °C) para determinar la temperatura óptima de recocido. Los productos amplificados se resolvieron en un gel de agarosa al 2% junto a una escalera de ADN (carril 2, tamaños indicados). Se observaron bandas individuales consistentes del tamaño esperado en todo el rango probado, con la amplificación más fuerte detectada a 55 °C, lo que sugiere que es la temperatura óptima para este conjunto de cebadores. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Análisis RTddPCR de transcritos seleccionados y cuantificación de copias de ARNm. (A,B) Gráficos de amplitud unidimensionales representativos que muestran la separación de gotas para (A) Actγ y (B) Gap43. Cada punto representa una sola gota, con gotas azules indicando amplificación positiva y gotas grises indicando amplificación negativa. El eje Y representa la amplitud, y el eje X indica la posición del pozo en la placa ddPCR. La clara separación entre gotas positivas (azules) y negativas (grises) confirma una detección robusta de los transcritos objetivo con los conjuntos de cebadores indicados. (C) Tabla que resume el número de copias/μL y copias por ng de ARN total para los transcritos Actγ y Gap43 en fracciones de neuronas y neuritas completas. Las estimaciones del número de copias se obtuvieron a partir de cuantificación absoluta utilizando conteos de gotas ddPCR (mostrados en los paneles A, B). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discussion

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Varios pasos son cruciales para la reproducibilidad. El recubrimiento del inserto debe ser uniforme para promover la adhesión neuronal; El recubrimiento incompleto provoca un crecimiento pobre de neuritos/axones. La densidad de placas celulares es igualmente importante, ya que una densidad excesiva aumenta el cruce dendrítico, mientras que el chapado escaso produce un ARN axonal insuficiente. La secuencia de raspado y hisopado debe realizarse con precisión: una presión muy baja provoca contaminación somática, mientras que demasiada presión corre el riesgo de dañar el inserto.

La validación del cebador representa otro paso crítico. Ejecutar dos conjuntos de cebadores independientes para cada transcrito permite seleccionar el par más fiable, mientras que la PCR por gradiente puede refinar aún más las temperaturas de recocido. Esta práctica reduce la formación de cebador-dímero, aumenta la claridad de las gotas y asegura la cuantificación reproducible entre réplicas biológicas. Aunque este enfoque logra una alta pureza compartimental, la contaminación traza por material somático no puede excluirse completamente. Los rendimientos de ARN axonal son inherentemente bajos, lo que limita el alcance de los análisis que requieren una alta entrada, como la secuenciación completa del transcriptoma. Una limitación crítica de este método es su incapacidad para abordar la localización de transcritos dentro de axones distales frente a proximales. Aunque se han reportado extensiones gliales o endoteliales a través de poros de membrana bajo ciertas condiciones, nuestro sistema de cultivo minimiza esta posibilidad. En cultivos adultos de DRG, la adición de citosina β-D-arabinofuranosido (Ara-C)5,7 y el uso de medios libres de suero para otros cultivos neuronales (cortical, hipocampo y BFCNs)5,45 restringen eficazmente la proliferación glial y endotelial. Además, las membranas rígidas de policarbonato o tereftalato de polietileno (PC/PET) utilizadas aquí son no elásticas y no permiten la migración activa de células. Además, utilizamos insertos de tamaño de poro de 3 μm para cultivos DRG que permiten el paso de axones de gran diámetro. En cambio, para cultivos corticales o BFCN, usamos insertos de poro de 1 μm, lo que restringe aún más la migración de glia. Estas propiedades distinguen nuestro sistema de los microdispositivos basados en PDMS que soportan la migración endotelial a través de poros flexibles. En consonancia con informesprevios 34,35,36,40, la validación molecular en este estudio confirma un fuerte enriquecimiento de transcritos axonales (por ejemplo, Gap43) y una detección despreciable de marcadores somáticos (por ejemplo, Actγ), que apoyan la especificidad neuronal del material que atraviesa la membrana. Como la restricción física no elimina completamente la migración glial, los investigadores también deberían usar Gfap como marcador negativo.

En comparación con los dispositivos microfluídicos, el sistema de inserción es más sencillo, escalable y compatible con los flujos de trabajo de cultivo rutinarios. Evita equipos especializados y permite la separación reproducible axón-soma. Al acoplar insertos con RTddPCR, este método proporciona tanto accesibilidad como alta sensibilidad, permitiendo la cuantificación absoluta de transcritos que a menudo están por debajo de los umbrales de detección de qPCR. Este protocolo es muy adecuado para sondar cambios en la localización de transcritos axonales, evaluar la traducción local en respuesta a estímulos del desarrollo, neurotóxicos o de lesiones, y también para estudiar defectos de transporte de ARN implicados en enfermedades neurodegenerativas o trastornos del neurodesarrollo. Futuros refinamientos pueden incluir RTddPCR multiplexado para cuantificación simultánea de múltiples ARNm, o integración con enfoques de secuenciación de ARN de baja entrada para ampliar la cobertura transcriptomática. Además, adaptar este sistema para neuronas derivadas de iPSC en humanos podría ampliar sus aplicaciones a la modelización de enfermedades y a estudios regenerativos.

Disclosures

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PKS posee patentes estadounidenses sobre el uso del péptido permeable a células G3BP1 para la regeneración de axones y neurodegeneración. Los demás autores declaran no haber conflictos de interés.

Acknowledgements

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Merkin Peripheral Neuropathy and Nerve Regeneration Center (a P.K.S.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Inserciones de cultivo celular para placa de 6 pozos, 1.0  μ m Tamaño de los poros, estérilCorning353102Consumibles
Inserciones de cultivo celular para placa de 6 pozos, 3.0  μ m Tamaño de los poros, estérilCELLTREAT230603Consumibles
Elevador de celdas con hoja estrechaVWR76036-006Consumibles
Placas de cultivo de tejidos de 6 pozos CELLSTARVWR82050-842Consumibles
ddPCR 96-Pozos Placas  Bio-rad12001925Consumibles
ddPCR Aceite para lector de gotas  Bio-rad1863004Reactivos
Cartuchos DG8 para generador de gotas QX200/QX100Bio-rad1864008Consumibles
LamininaGibco/Fisher Scientific23017-015Reactivos
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010LReactivos
Microplacas para negro de 96 pozos basados en fluorescenciaThermo FisherM33089Consumibles
Sellado térmico de placa PCR, papel de aluminio, perforableBio-rad1814040Consumibles
PolilisinaSigmaP1274Reactivos
PTC Tempo 96 Thermal CyclerBio-rad12015382Equipamiento
Software QuantaSoftBio-RadSoftware de análisis de datos PCR
Kit de reactivo Quant-it RiboGreen y Análisis de ARNThermo FisherR11490Reactivos
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-rad1864034Reactivos
Aceite de generación de gotas QX200 para EvaGreenBio-rad1864005Reactivos
Generador de gotas QX200Bio-rad17005227Equipamiento
Lector de gotas QX200Bio-rad17005228Equipamiento
Reactivo de TrizolInvitrogen15-596-026Reactivos

References

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