Artículo de método

Sangre de garrapata alimentándose a través de una membrana artificial en una cámara impresa en 3D en investigación de garrapatas Ixodid

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DOI:

10.3791/69606

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20 de marzo de 2026

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1Department of Entomology, University of Arizona, 2Department of Entomology, Kansas State University

En este artículo

Resumen

Este método describe el desarrollo de un sistema de alimentación sanguínea in vitro para garrapatas que incorpora una cámara impresa en 3D y una membrana de silicona fabricada en laboratorio. El sistema permite la alimentación artificial de garrapatas, facilitando el muestreo en diversas fases de alimentación y utilizando bajos volúmenes de sangre, proporcionando una herramienta invaluable para estudiar garrapatas ixódidas.

Resumen

Este trabajo presenta un protocolo detallado para un sistema de alimentación de garrapatas a través de una membrana artificial de silicona que utiliza una cámara impresa en 3D creada a partir de resina fotopolimérica de alta resolución. El método incluye el diseño de la cámara de alimentación, la preparación de la membrana de silicona, el montaje del sistema y condiciones optimizadas para la alimentación de las garrapatas. Las garrapatas son uno de los principales vectores de enfermedades en Estados Unidos y en todo el mundo. La investigación sobre garrapatas es esencial para desarrollar estrategias eficaces que prevengan y reduzcan la incidencia de enfermedades transmitidas por ellas. Como ectoparásitos hematófagos obligados, las garrapatas deben alimentarse de sangre para sobrevivir y, por tanto, transmitir enfermedades, lo que convierte la alimentación sanguínea en un proceso fundamental al investigar las interacciones vector-huésped, la transmisión de patógenos y la biología, fisiología y morfología anatómica de las garrapatas. Los sistemas de alimentación de garrapatas con membrana de silicona se han utilizado y perfeccionado ampliamente en las últimas décadas. Sin embargo, muchos sistemas existentes están adaptados a una sola especie de garrapata, etapa vital o conjunto específico de condiciones. El sistema de alimentación de garrapatas descrito en este protocolo se ha utilizado con éxito para obtener ejemplares tanto parcialmente alimentados como totalmente inchados de varias de las especies vectores de garrapatas más importantes de Estados Unidos, incluyendo Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis y adultos de Rhipicephalus sanguineus . El sistema ha demostrado éxito en iniciar la alimentación de adultos de Dermacentor variabilis y ninfas A. americanum, con las tasas de alimentación más altas (>85%) observadas en adultos de A. americanum. En consecuencia, la cámara de alimentación desarrollada en este estudio es adaptable para su uso con un bajo volumen de sangre diferente, hasta 100 μL, lo cual es crucial en la transmisión de patógenos y en estudios toxicológicos. La tapa transparente con una altura mínima de la cámara facilitaba la observación de garrapatas durante la duración de la alimentación de las garrapatas.

Introducción

Las garrapatas son ectoparásitos hemo-alimentados obligatoriamente que pueden transportar y transmitir una amplia variedad de patógenos, incluyendo bacterias, virus y parásitos que causan enfermedades a animales y humanosen todo el mundo 1,2,3,4. Como vector de enfermedad número uno en Estados Unidos, solo superado por los mosquitos enel resto del mundo 2,3,5, varias especies de garrapatas pueden transmitir enfermedades asociadas a patógenos, mientras que otras especies también son conocidas por inducir enfermedades no transmisibles como el síndrome alfa-gal (AGS, también conocido como alergia a la carne roja), que ha sido cada vez más reportado en todo el mundo en los últimos años6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. La investigación orientada a comprender la biología, fisiología, genética y competencia vectorial de las garrapatas es esencial para desarrollar estrategias que reduzcan la carga económica y de salud pública tanto de enfermedades transmisibles como no transmisibles transmitidas por garrapatas. Estudiar las interacciones entre garrapatas y huésped suele requerir garrapatas parcialmente alimentadas o completamente ingestionadas para abordar preguntas de investigación específicas. Esto puede lograrse mediante la alimentación de animales vivos, permitiendo que las garrapatas completen su ciclo vitalcompleto 17. Aunque el uso de animales vivos para la alimentación de garrapatas es muy eficaz para desarrollar y mantener colonias degarrapatas 18,19, puede ser difícil de implementar y puede no aplicarse a todas las hipótesis de investigación debido a limitaciones de disponibilidad de hospedadores y regulaciones de las instalaciones. Lo más importante es que la exitosa implementación de sistemas de alimentación in vitro para garrapatas ayuda a reducir el uso de animales vivos, lo cual es un objetivo importante en la investigación bajo el marco "Alternativa al Uso Animal (3Rs)" (reemplazar, reducir, refinar)20.

Existen numerosas ventajas al utilizar sistemas de alimentación de garrapatas de membrana artificial en la investigación, lo que ofrece amplias oportunidades para abordar una amplia gama de cuestiones científicas. Estos pueden resumirse en tres grupos; (1) evaluación del efecto sobre la variación sanguínea del huésped y las interacciones vector-huésped, utilizando diferentes fuentes de sangre, como la producción de alfa-gal de garrapatas durantela alimentación 21, (2) evaluación de la toxicidad por acaricida mediante la administración de compuestos con la sangre22 y la recuperación de compuestos secretados por garrapatas durante la alimentaciónsanguínea 23, (3) evaluación de la competencia vectorial, mediante la entrega de patógenos por adquisición natural durante la alimentaciónsanguínea 24, 25, 26, 27, entre otros. Además, la naturaleza del sistema de alimentación por membrana artificial permite realizar pruebas a gran escala de diversos tratamientos y concentraciones sin introducir variaciones relacionadas con el huésped, a pequeña escala y volumen, reduciendo la necesidad de animales vivos.

Los sistemas de alimentación de garrapatas mediante membranas artificiales se han utilizado ampliamente en investigación y para apoyar la crianza de coloniasde garrapatas 19,28,29, permitiendo en algunos casos completar el largo ciclo de vida de la garrapata 30,31. Se han reportado muchos protocolos sobre la optimización de los sistemas de alimentación de garrapatas y sus materiales para diferentes especiesde garrapatas 32,33,34. No obstante, es bien sabido que la alimentación in vitro de garrapatas puede variar mucho dependiendo de las condiciones del sistema, los materiales utilizados y, lo más importante, la especie y las etapas34 de la garrapata. Además, muchos sistemas dependen de grandes volúmenes de sangre, como los sistemas de flujocontinuo 27, que son muy eficaces pero pueden resultar costosos debido a los volúmenes sanguíneos significativos que requieren. Este protocolo detalla un sistema de alimentación de garrapatas de membrana artificial que ha demostrado ser eficaz en las etapas adultas de cinco especies diferentes de vectores de la enfermedad de las garrapatas en Estados Unidos. Esto incluye Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis, Rhipicephalus sanguineus y Dermacentor variabilis.

Protocolo

Se realizaron experimentos de alimentación con garrapatas utilizando sangre bovina defibrinada disponible comercialmente (Hemostat Laboratories, CA, EE. UU.) y sangre humana defibrinada (Bioivt, CA, EE. UU.), que recoge y procesa sangre conforme a los protocolos y directrices aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) y la Junta de Revisión Institucional (IRB). No se utilizó ningún animal vertebrado vivo para la alimentación de garrapatas en este estudio. Todas las garrapatas utilizadas en este protocolo se compraron en la instalación de cría de garrapatas de la Universidad Estatal de Oklahoma. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cámaras de alimentación de garrapatas

  1. Diseña las cámaras usando un software de diseño 3D gratuito para encajarlo en una placa de Petri de 35 mm x 10 mm. Los tamaños de las piezas impresas (Figura 1A) son los siguientes: cuerpo de la cámara (parte i) 25 mm (diámetro interior) x 20 mm (alto), con 3 mm de grosor en la base y 6 mm en el anillo superior de la tapa ( parte ii), 30 mm (diámetro interior) x 5 mm (alto) y 3,5 mm de grosor de pared (parte iii) 31 mm (diámetro interior) x 5 mm (alto) y 3 mm de grosor de pared.
    NOTA: El anillo de tapa incluye cuatro aberturas circulares de 3 mm (diámetro) x 2 mm (alto) en la parte superior para colocar imanes. La parte superior de la cámara también tiene aberturas del mismo tamaño para fijar los imanes (Figura 1B). El diseño del modelo 3D debe guardarse como un archivo .stl , el formato de archivo de impresión 3D más común. Se proporcionarán archivos que contengan el diseño 3D utilizado en este protocolo a petición.
  2. Cámaras de impresión usando una impresora 3D LCD de 10" 14K con resinas fotopoliméricas grises o blancas (Figura 1A) u otra impresora 3D de alta resolución que imprime modelos 3D a partir de un archivo .stl.
    NOTA: Este protocolo utilizaba los servicios de impresión y resinas de la Universidad de Arizona. El uso de resinas de alta resolución garantiza la creación de cámaras detalladas y duraderas.
  3. Con guantes, asegúrate de que no haya residuos de resina en las piezas antes del montaje lavándolo y, si es necesario, lijando suavemente con papel de lija fino (grano 180 a 200). Asegúrate de que la parte inferior plana de la parte i (Figura 1A) esté lisa. Esto garantiza una correcta adhesión de la membrana de silicona, reduciendo el riesgo de fugas.
  4. Expone todas las piezas secas a luz ultravioleta durante 10 minutos para asegurar una polimerización completa de resina.
    NOTA: La mayoría de los servicios de impresión 3D que utilizan resinas tóxicas emplean luz ultravioleta para curar la resina (endureciendo los modelos y eliminando la toxicidad de la resina); sin embargo, ocasionalmente permanece "no completamente curado". Un modelo no completamente curado permanecerá ligeramente pegajoso al tacto y puede llevar resina no polarizada, que puede ser tóxica o causar irritación al manipularla. Una exposición extra a la luz UV asegurará un endurecimiento completo de la resina.
  5. Pega los imanes redondos de 3 mm x 2 mm a las ranuras de la parte superior de las cámaras y a los anillos de tapa usando cola epoxi transparente. Déjalo secar toda la noche a temperatura ambiente (20–25 °C/mínimo de 16 h). Asegúrate de que los polos de los imanes estén orientados hacia una dirección para coincidir con la atracción de los polos de los imanes en la parte superior del anillo de la tapa (Figura 1A, parte ii).
  6. Montar todas las piezas del modelo para asegurar el ajuste correcto de todos los componentes, como se muestra en la Figura 1A–C.

2. Preparación de membranas

  1. Coloca un papel de film transparente de 30 cm x 30 cm sobre una superficie limpia y asegúrate de que no se arrugue estirándolo sobre una superficie plana y asegurando los bordes con cinta adhesiva (Figura 2Ai).
  2. Coloca 4–5 hojas individuales de papel de limpieza de lentes sobre un trozo extendido de plástico/film transparente separados por 5 cm (Figura 2Aii).
  3. Prepara la membrana de silicona utilizando los componentes y cantidades proporcionados a continuación.
    NOTA: Las cantidades son suficientes para preparar 4–5 membranas (7 cm × 12 cm), cada una con capacidad para hasta 5–6 cámaras de alimentación, para un total de 20–30 cámaras.
  4. Prepara la mezcla de silicona combinando 15 g de masilla transparente de silicona (dureza Shore A de 20–25) y añadiendo 4,5 g de aceite de silicona (el 30% del total de silicona) y 2,9 g de hexano (el 19,3% del total de silicona). Coloca los ingredientes en un pesador de plástico y mezcla suavemente con una espátula (Figura 2Aiii).
    NOTA: Asegúrate de que se formen burbujas al mínimo mezclando los ingredientes suavemente.
  5. Coloca 2–3 g de mezcla de silicona a lo largo del borde más pequeño del papel para lentes para fijarla al film transparente. Deja que la silicona se filtre entre 5 y 10 s a través del papel de lente (Figura 2Aiv).
  6. Extiende uniformemente la mezcla de silicona a lo largo de la lámina de papel de la lente usando un instrumento de filo recto, como una tapa, regla o espátula. Asegúrate de que el objeto utilizado cubra toda la superficie del papel de la lente (Figura 2Av). Esto garantiza la cobertura de silicona en un solo golpe, evitando que la membrana se agite y se ondule en el borde del objeto.
  7. Asegúrate de que toda la mezcla de silicona se utilice en la membrana, devolviendo la herramienta de dispersión a la posición inicial para la expansión. Como parte de la mezcla de silicona se retendrá en la herramienta de esparcir, devolver la herramienta para recogerla asegurará que se utilice toda la silicona para evitar huecos (Figura 2Avi).
    NOTA: La membrana debe parecer uniformemente translúcida sin ondas (Figura 2B).
  8. Prepara membranas de diferentes grosores inicialmente añadiendo más o menos mezcla de silicona, ya que el grosor no puede medirse hasta que las membranas estén secas.
  9. Deja que las membranas se sequen al aire durante la noche a temperatura ambiente (20–25 °C/mínimo de 16 h).
  10. Mide el grosor de la membrana usando una herramienta digital de medición del micrómetro exterior. Se utilizan diferentes espesores de membrana para distintas especies adultas de garrapatas, que van desde partes bucales cortas (70 μm de grosor de membrana) hasta piezas bucales más largas (200 μm de espesor de membrana).
  11. Retira todas las piezas de las cámaras previamente montadas y aplica cola de silicona en el borde inferior de las cámaras. Para una colocación precisa del pegamento, usa una jeringuilla de 1 ml y llénala con cola de silicona (Figura 2Ci).
  12. Coloca una punta de pipeta de 200 μL en la punta de la jeringuilla (en lugar de la aguja) para aplicar pegamento (Figura 2Cii) y atornilla al extremo de la jeringuilla, como con la punta de la aguja (Figura 2Ciii). Esto permitirá aplicar pegamento fino en el borde inferior de cada cámara (Figura 2Civ).
  13. Coloca la cámara sobre la membrana (Figura 1, parte i) con un objeto lastrado para asegurar que se asiente. Dejarlo reposar toda la noche a temperatura ambiente (20–25 °C/mínimo de 16 h) (Figura 2D, E).
    NOTA: Utiliza cualquier objeto plano con peso. Este protocolo utilizaba una pieza de acrílico de 2,5 kg (Figura 2E).
  14. Corta el exceso de membrana de las cámaras usando tijeras curvas (Figura 3A).
  15. Antes de usar la cámara para alimentar garrapatas, retira cualquier film plástico restante (donde se prepara la membrana (paso 2.1) (Figura 3B).
  16. Vuelve a montar las piezas de la cámara, incluye una placa de Petri de 35 mm x 10 mm en la parte inferior y utiliza las tapas de las antenas como tapas de las cámaras invirtiendo y colocándolas entre los imanes (Figura 3C,D).
    NOTA: Utiliza las tapas invertidas, ya que el anillo del soporte de la tapa es un ajuste exacto para la tapa si está invertido (ver descripciones de las piezas en la Figura 3C,D).
  17. Remojas la membrana de la cámara en agua destilada utilizando la parte inferior de placas de Petri de 35 mm x 10 mm. Deja reposar la membrana en agua durante la noche a temperatura ambiente (20–25 °C/mínimo de 16 h). Dado que la membrana es inicialmente hidrofóbica, remojarla en agua antes de añadir sangre ayudará a reducir la formación de burbujas atrapadas.
    NOTA: La ausencia de burbujas confirma que la hidrofobicidad ha sido eliminada.

3. Alimentación de garrapatas y preparación de sangre

  1. Haz 2–3 pequeños orificios para respirar en las tapas de cada cámara (de las placas de Petri de 35 mm x 10 mm) (parte iv en la Figura 1A) mencionados en el paso 2.16 (Figura 3E). Utiliza un bisturí metálico calentado o una espátula fina para hacer los agujeros de respiración en la tapa.
    NOTA: Los orificios de respiración permiten internalizar la humedad dentro de la carcasa de la cámara.
  2. Suplementar la sangre con sulfato de gentamicina a una concentración final de 50 μg/mL. Añade solo antibióticos a la sangre destinada a su uso en un plazo de 1 semana y almacenádelos a 4 °C. Mantén sangre bovina (o cualquier otra sangre animal) a 4 °C antes y después de añadir antibióticos.
  3. Coloca 2–3 mL de sangre en una placa de Petri limpia de 35 mm x 10 mm, y luego coloca la cámara sobre ella. Ajusta la altura de la cámara para aumentar o reducir la cantidad de sangre utilizada por cámara girando el anillo de ajuste (parte iii de la Figura 1A). Ajusta la altura de la cámara, dejando un espacio de 1–2 mm desde la base de la placa de Petri hasta la membrana. Consulta las flechas magenta en la Figura 4A para referencia.
    NOTA: El diseño del anillo de ajuste de las cámaras permite controlar el volumen de sangre utilizado. es decir, un espacio mayor entre la base de la placa de Petri y la membrana requerirá un volumen mayor para llenar el espacio.
  4. Coloca garrapatas sin alimentar dentro de cámaras en igual número de machos y hembras. Asegúrate de que ambos sexos estén siempre incluidos en la cámara, ya que esto puede afectar las tasas de alimentación (la Figura 4B muestra 4 machos y 4 hembras de A. americanum adulto dentro de la cámara). Se utiliza un máximo de 10–15 ticks por cámara (para la etapa adulta) para facilitar el manejo.
    NOTA: Al trabajar con etapas inmaduras, el número de garrapatas es mayor (20–50 ninfas por cámara, no presentado en este protocolo).
  5. Colocar las cámaras en baños secos cubiertos a 37 °C ± 1 °C con una fuente de humedad (es decir, vasos de agua) que mantenga una humedad relativa del 63% ± 2% (Figura 4C) bajo un fotoperiodo claro-oscuro de 12:12 h.
    NOTA: Estos requisitos pueden variar según la especie de garrapata y las condiciones de laboratorio; Prueba otros ajustes de humedad si es necesario y evalúa la mejor configuración para el laboratorio.

4. Reemplazo de sangre y cámaras

  1. Prepara dos botellas de pulverización con las soluciones que se usarán para enjuagar la membrana entre cambios de sangre. En una botella, añadir una solución de nistatina al 0,005% en agua destilada; En la segunda botella, añade agua destilada.
  2. Después de 12–16 horas, prepara nuevas placas de Petri con sangre fresca y colócalas en el baño seco a 37 °C antes de colocar la cámara.
  3. Mientras la sangre fresca se calienta, retira la cámara de la sangre utilizada y enjuaga la parte inferior de la membrana con agua destilada durante 3–5 segundos, luego con solución de nistatina al 0,005% durante 3–5 segundos para evitar la contaminación por hongos. Enjuaga la membrana de nuevo con agua destilada para eliminar cualquier residuo restante de nistatina.
    NOTA: Este proceso dura menos de 5 minutos y no afecta a la alimentación de garrapatas adheridas a la membrana en la superficie superior.
  4. Desechar toda la sangre usada y enjuagar agua en un recipiente que contenga una solución de hipoclorito sódico al 0,5% (10% de lejía). Los residuos de sangre se desechan conforme al protocolo de seguridad institucional.
  5. Después de enjuagar, coloca la cámara en la nueva placa de Petri con sangre.
    NOTA: Utiliza las cámaras hasta 2–3 meses antes de lavar, siempre que no haya contaminación ni fugas. Las cámaras y membranas se ensucian y corren riesgo de contaminación más allá de 3 meses de uso sin lavado. Esto reduce las tasas de alimentación de las garrapatas. Reutiliza las cámaras hasta durante 1,5 años (~10 ciclos de lavado).
  6. Reutiliza las cámaras colocándolas en una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% (10% de lejía) durante hasta 30 minutos, y luego lava con jabón para platos. No expongas las cámaras a lejía durante períodos prolongados (>30 minutos), ya que el olor reduce las tasas de unión y puede debilitar la integridad de la resina con el tiempo.
    NOTA: La exposición prolongada a lejía hace que la cámara sea flexible cuando está húmeda y quebradiza al secarse, lo que puede provocar roturas. Esto hace que la cámara no dure más de 4–5 ciclos de lavado según observaciones repetidas. El uso continuo de la misma cámara sin lavado (hasta 3 meses) resulta en una fijación de garrapatas más rápida (1–3 días después de colocarla en la cámara) en comparación con una cámara recién lavada (a menudo >7 días en acoplarla). Esto probablemente se deba al olor a excrementos y otras feromonas de agregación de las garrapatas alimentándose en la cámara, lo que puede estimular la alimentación de lasgarrapatas 35,36.

Resultados

Grosor de membrana para cada especie de garrapata.
Se observaron tasas más altas de alimentación de garrapatas con las siguientes especificaciones de grosor de membrana para cada especie adulta: Amblyomma americanum 100–200 μm; A. maculatum 100–250 μm; Rhipicephalus sanguineus 70–100 μm; Ixodes scapularis <150 μm, Dermacentor variabilis <150 μm. Todas las especies de garrapatas se mantuvieron bajo las mismas condiciones de humedad y temperatura durante la alimentación (63% de humedad relativa y 37 °C) (Tabla 1).

Garrapatas y fuentes de sangre utilizadas en este protocolo
Todas las garrapatas se obtuvieron de la instalación de cría de garrapatas de la Universidad Estatal de Oklahoma y se mantuvieron a una humedad relativa del >90% a 20 °C, bajo un fotoperiodo claro-oscuro de 12:12 h. Todas las garrapatas fueron alimentadas con sangre bovina o humana desfibrinada como parte de un proyecto de investigación que investigó los niveles de alfa-gal (αGal) en varias especies de garrapatas. Este estudio comparó los efectos de la alimentación en diferentes fuentes de sangre dentro de un proyecto más amplio sobre el síndrome alfa-gal (SGA) llevado a cabo por el grupo de investigación. La mayoría de los ejemplares de garrapatas descritos aquí fueron diseccionados antes de la congestión total para realizar análisis de cuantificación de αGal en garrapatas parcialmente alimentadas (2–5 días de alimentación). Solo un subconjunto de garrapatas Amblyomma americanum (aquellas que no eran necesarias para la cuantificación de αGal) se permitía alimentarse hasta la reposición. Aunque aquí no se presentan comparaciones detalladas entre las tasas de alimentación de garrapatas alimentadas con bovinos y con humanos, es notable que el congestión completa (es decir, el éxito de la alimentación) se logró más en garrapatas alimentadas con sangre bovina. Entre las garrapatas que se permitió permanecer en los comederos durante largos periodos (n = 35), 15 alcanzaron la congestión completa, lo que representa una tasa de éxito alimentaria del 42,8%. De estos, 9 se alimentaron con sangre bovina y 6 con sangre humana (60% alimentados con bovinos frente a 40% con humanos).

Tasas de alimentación de garrapatas vs. tasas de éxito de alimentación con garrapatas
Las tasas de alimentación de garrapatas en este estudio se determinaron en función de la adquisición de garrapatas parcialmente alimentadas (2–5 días de alimentación), mientras que el éxito de la alimentación se definió como congestión total, típicamente indicada por un cambio en la coloración del aloscutum de la hembra (datos disponibles solo para Amblyomma americanum). Las tasas de alimentación masculina se definieron como alimentación continua durante más de 2 días (2–5 días). Las tasas generales de alimentación se calcularon combinando datos de garrapatas alimentadas con sangre bovina y humana y calculando los porcentajes de garrapatas que lograron entre 2 y 5 días de alimentación o congestión completa a partir de garrapatas colocadas en las cámaras. Se consideraron las garrapatas que no se adhieren o que murieron tras <2 días de adhesión para el cálculo de las tasas de alimentación. Aunque no se presentan datos cuantitativos sobre la influencia de la fuente de sangre en las tasas de alimentación de las garrapatas, esta evidencia observacional sugiere que, para la mayoría de las especies de garrapatas, las tasas de unión y alimentación no difieren sustancialmente entre la sangre bovina y la humana durante el periodo de alimentación de 2 a 5 días. Se observó una excepción para Rhipicephalus sanguineus, que mostró tasas de alimentación más bajas con sangre humana entre los días 3 y 5 en comparación con la sangre bovina. Las tasas de alimentación de todas las especies de garrapatas que lograron alimentación parcial y congestión total utilizando este sistema in vitro de alimentación de garrapatas se resumen en la Tabla 1.

Clasificación del peso y etapa de alimentación femenina de Amblyomma americanum
Las hembras parcialmente alimentadas de A. americanum se clasificaron según los días de alimentación como: (1) no alimentadas, (2) 2–3 días parcialmente alimentadas, (3) 4–5 días parcialmente alimentadas y (4) congestionadas (Figura 5). La etapa de alimentación ingestionada incluyó garrapatas al inicio de la fase de congestión rápida (con pesos que iban de 48,9 mg a 109 mg) y garrapatas completamente congestionadas (con pesos que iban de 272,7 mg a 348,7 mg).

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Figura 1: Cámara de alimentación de garrapatas - modelo 3D e ensamblaje impreso con membrana. Modelo 3D explosivo y cámara ensamblada final que muestra componentes individuales: (i) cuerpo de la cámara (carcasa de garrapatas), (ii) anillo de soporte de tapa, (iii) anillo de ajuste de altura, (iv) tapa de placa de Petri de 40 mm x 10 mm, y (v) fondo de placa de Petri de 40 mm x 10 mm con sangre (A). El montaje del modelo impreso en 3D y los tamaños individuales de las piezas se muestran en mm (B). Cámara ensamblada impresa en resina gris de resolución 8K (C). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Preparación del conjunto de membrana y recámara de silicona. (i) Un film transparente de 30 cm × 30 cm asegurado con cinta adhesiva, asegurando que no se arruguen a la vista, (ii) hojas individuales de papel de limpieza de lentes colocadas sobre el envolvente, separadas aproximadamente 5 cm, (iii) mezcla suave de los componentes de silicona con una espátula mediante movimientos circulares, (iv) cada hoja de papel de lente asegurada aplicando 1–2 g de la mezcla de silicona a lo largo de sus bordes, (v) la mezcla de silicona se distribuye uniformemente sobre el papel de la lente usando un instrumento de borde recto más grande que el papel (la imagen muestra el borde de una tapa de vidrio), (vi) observa la menor cantidad de mezcla de silicona durante la distribución, la silicona retenida en la herramienta se devuelve y se redistribuye para asegurar una cobertura uniforme (A). Las membranas correctamente extendidas no mostraron burbujas de aire ni huecos (B). Preparación de la jeringuilla para la aplicación de pegamento: (i) una jeringuilla de 1 mL llena de cola de silicona, (ii) una punta de pipeta de 200 μL instalada en la punta de la jeringuilla, (iii) la punta de la pipeta atornillada para asegurar un sello a prueba de fugas, y (iv) la colocación del pegamento en el borde inferior de la parte i (C). La cámara se coloca sobre la membrana seca (D) y un objeto lastrado (un grueso bloque acrílico de 2,5 kg; flecha magenta) se coloca encima para asegurar una adherencia firme (E). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Pasos finales en la preparación de la cámara y la membrana antes de su uso. Recorte de los bordes de la membrana que rodea la cámara usando tijeras pequeñas curvas (A), retirada del film transparente antes de usar la cámara (B), ensamblaje final del modelo (C), colocación de la cámara en una placa de Petri de 40 mm x 10 cm que contiene agua, y uso de la tapa de la placa de Petri como tapa de la cámara (D) (los números i-v indican las piezas según se especifica en la Figura 1A), y tapas de cámara que muestran orificios para respirar (indicados por puntas de flecha magenta) (E). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Configuración de alimentación con sangre y colocación de garrapatas. Cámara colocada en un plato lleno de sangre, con el anillo de ajuste de altura resaltado (flechas magenta) (A). Vista interior de la carcasa de la cámara que contiene un número igual de machos y hembras de garrapatas (B). Cámaras para garrapatas situadas en baños secos con una fuente de humedad, manteniendo una humedad relativa (HR) del 63% ± 2% y una temperatura de 37 °C ± 1 °C (C). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 5: Variación del tamaño y peso de Amblyomma americanum durante la alimentación. Se muestra el tamaño de la garrapata no alimentada y el peso medio de las garrapatas parcialmente alimentadas. Las imágenes representan ejemplos típicos correspondientes al peso medio registrado en cada intervalo de alimentación. La tabla adjunta presenta pesos medios, desviaciones estándar, el número de garrapatas analizadas, mediana y cuarteles 1 y 3 para cada momento de alimentación. Las garrapatas alimentadas durante 2–3 días mostraron un peso que oscilaba entre 7,4 mg (mínimo) y 19,2 mg (máximo). Las garrapatas alimentadas durante 4–5 días iban de 20,6 mg a 44,8 mg. Las garrapatas al inicio de la fase de congestión rápida y las garrapatas completamente ingestionadas pesaban entre 48,9 mg y 348,7 mg. Imagen adjunta de hembras de A. americanum alimentadas 4-5 días (punta de flecha amarilla) y hembra completamente inchada (punta de flecha magenta). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Especies de garrapatas y sexoNúmero de garrapatas alimentadas/ Total de garrapatas colocadas en cámaras (Número de garrapatas muertas)Velocidad de alimentación (garrapatas adheridas 2-5 días)Peso medio (mg) (DS)Grosor de membrana utilizado (μm)
Hembras de A. americanum85/97 (12)87.60%37.3 (54.40)*100 - 200
A. americanum males19/22 (2)86.30%No registrado100 - 200
Hembras de A. maculatum45/66 (21)68.20%122.4 (141.65)100 - 250
Machos de A. maculatum36/47 (11)76.60%No registradoNo registrado
Hembras de R. sanguineus34/60 (26)56.60%No registrado70 - 100
Hembras de I. scapularis15/23 (8)65.20%No registrado<150
*La tasa de éxito de la alimentación evaluada en un subconjunto de garrapatas adultas Aa alimentadas con bovinos es (n=35) del 42,8%

Tabla 1: Tasas de alimentación de garrapatas y pesos medios.

Figura suplementaria 1: Alimentación de bajo volumen (100 μL) de las garrapatas individuales ya unidas a un sitio de la cámara 3D. Un pequeño tubo de PCR, fijado en la base de la membrana artificial con cola de silicona, se llena con 100 μL de sangre. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los sistemas de alimentación por membrana artificial para garrapatas son herramientas altamente eficaces para la investigación de garrapatas y se utilizan ampliamente en muchos laboratorios de investigación como alternativas viables a la alimentación de animalesvivos 28,29. El valor principal de estos sistemas radica en su capacidad para administrar o recuperar diversos agentes a través de la harina de sangre, incluyendo patógenos, acaricidas, compuestos derivados de garrapatas y otras moléculasmoduladoras 22,23,25,27. La optimización de los sistemas de alimentación por membrana artificial podría facilitar el desarrollo de una crianza sostenible en colonias de garrapatas, reduciendo así la dependencia de animales vivos.

El sistema de alimentación in vitro de garrapatas descrito en este protocolo ha sido especialmente exitoso con adultos de Amblyomma americanum e Ixodes scapularis. Las tasas de éxito en la alimentación de garrapatas se definen como la proporción (o porcentaje) de garrapatas que completan con éxito la alimentación hasta la congestión completa. Sin embargo, las garrapatas parcialmente alimentadas (normalmente 3–4 días después del inicio de la alimentación) suelen ser suficientes para abordar hipótesis experimentales específicas en la mayoría de los laboratorios de investigación de garrapatas que estudian la biología o fisiología de las garrapatas. En este protocolo de sistema de alimentación por membrana artificial, y para abordar objetivos específicos de investigación en el proyecto alfa-Gal (αGal), los términos "tasa de alimentación de garrapatas" se utilizaron para referirse a la adquisición de garrapatas parcialmente alimentadas (2–5 días de alimentación) y "éxito de alimentación de garrapatas" para referirse a la congestión completa en A. americanum. Las tasas de alimentación más altas se dieron en hembras de A. americanum (87,6%), seguidas de machos de A. americanum (86,3%), hembras de A. maculatum (68,2%), machos de A. maculatum (76,6%), hembras de I. scapularis (65,2%) y hembras de R. sanguineus (56,6%), mientras que la tasa de éxito alimentaria de A. americanum fue del 42,8% (Tabla 1). Las hembras parcialmente alimentadas de A. americanum se clasificaron según días de alimentación en 4 categorías (fases de alimentación), modificadas respecto a publicaciones anteriores de la siguientemanera: (1) no alimentada, (2) 2–3 días parcialmente alimentada, (3) 4–5 días parcialmente alimentada y (4) inflojada (Figura 5). La etapa de alimentación ingestionada incluyó garrapatas al inicio de la fase de congestión rápida (con pesos que iban de 48,9 mg a 109 mg) y garrapatas completamente ingestionadas (con pesos que iban de 272,7 mg a 348,7 mg) (Figura 5). Este sistema de alimentación con membrana artificial de garrapatas ha permitido múltiples estudios dentro del mismo grupo de investigación y colaboradores, al permitir la generación de garrapatas parcialmente alimentadas en sangre bovina, que posteriormente se utilizaron para infestar ratones y probar la hipótesis de transmisión del síndrome alfa-gal (AGS), una alergia a la carne roja inducida por mordeduras de garrapata, y para un estudio N-glucómico11,21, 37. La comodidad de la configuración individual permitía el uso de diferentes fuentes de sangre, y la tapa transparente y la altura mínima de la cámara facilitaban la visualización de las garrapatas durante el periodo de alimentación bajo un estereomicroscopio con suficiente distancia de trabajo.

Modificaciones recientes en la humedad (de baño maria, 90% HR, a baño seco, 63% ± 2% HR), temperatura (de 37 °C a 35 °C y de nuevo a 37 °C) y grosor de membrana (Tabla 1) han permitido la alimentación exitosa de múltiples especies de garrapatas. Aunque la temperatura y la humedad relativa (HR) son variables importantes para controlar en la alimentación in vitro de garrapatas, el grosor y la resistencia de la membrana son factores críticos que aseguran la alimentación exitosa entre diferentes especies degarrapatas 33,38. Es fundamental tener en cuenta que las garrapatas con piezas bucales cortas, como Rhipicephalus sanguineus y Dermacentor variabilis, requerirán membranas más finas que aquellas con piezas bucaleslargas 39, como Amblyomma spp e Ixodes spp. Las tasas más altas de alimentación de garrapatas se dieron en Amblyomma americanum y A. maculatum, con un grosor de membrana de 100–200 μm; Rhipicephalus sanguineus con espesores entre 70 y 100 μm; Ixodes scapularis con espesores <150 μm, y Dermacentor variabilis <150 μm (Tabla 1). Un factor clave a tener en cuenta en la alimentación con garrapatas de membrana artificial es que todavía ocurren fluctuaciones en las tasas de alimentación. En este sistema, un ligero cambio de temperatura, es decir, de 37 °C a 35 °C y de nuevo a 37 °C tras un par de días, suele mejorar o restaurar las tasas de alimentación de las garrapatas. Además, cambiar de baño seco a baño de agua da resultados similares para Amblyomma spp. e Ixodes scapularis; sin embargo, este efecto no se observó en Rhipicephalus sanguineus, que se alimenta de forma más eficaz con un 63% ± un 2% de humedad relativa en baños secos.

Otros sistemas artificiales de alimentación de garrapatas, como los adaptados del sistema de flujo continuo de cinco partes desarrollado por Ueti, M. et al. (USDA-ARS) y posteriormente modificado para especies adicionales de garrapatas por Yamasaki, Y. et al., han demostrado alta eficiencia, proporcionando tasas de éxito consistentemente altas de alimentacióncon garrapatas 27,40. Sin embargo, los estudios que requieren acceso frecuente al sistema para la disección de garrapatas parcialmente alimentadas hacen que estos montajes sean menos adecuados, ya que la apertura y cierre repetido de la cámara de carcasa de garrapatas puede ser engorroso. La cámara impresa en 3D descrita en este protocolo cuenta con una tapa magnética de seguro seguro y placas de Petri individuales, lo que permite un fácil manejo e inspección visual de la alimentación de garrapatas sin alterar la instalación. La tapa transparente permite un seguimiento visual sin interrupciones y se fija de forma segura a la cámara mediante imanes incrustados, a diferencia de los sistemas de alimentación de garrapatas más comunes, como los optimizados por el diseño original de Kröber y Guerin22,29, donde la visualización individual no es posible sin retirar la cámara de alimentación de la sangre, ya que todas las unidades de alimentación están integradas en una sola placa y donde se utilizan métodos para evitar que las garrapatas escapen No permitas la visualización. Además, este sistema de alimentación in vitro con garrapatas puede perfeccionarse aún más para suministrar volúmenes de sangre más pequeños y específicos del lugar. Por ejemplo, una vez que las garrapatas hembras están unidas a lugares de alimentación definidos, la placa de Petri inferior podría ser reemplazada por pequeños reservorios, como la parte superior de un tubo PCR de 100 μL, que contenga menos de 100 μL de sangre situada directamente debajo del área de inserción (Figura suplementaria 1). Este enfoque de alimentación de bajo volumen permitiría estudios detallados sobre la adquisición y transmisión de patógenos, así como investigaciones sobre los efectos de los tóxicos de garrapatas y los anticuerpos derivados del huésped. Se ha demostrado que este protocolo es eficaz para obtener garrapatas parcialmente alimentadas de diversas especies adultas. Para los fines de este estudio, las tasas de puesta de huevos y de congestión completa no se evaluaron en este protocolo; sin embargo, se está llevando a cabo una optimización adicional con el objetivo de obtener descendencia de garrapatas, lo cual podría lograrse con Amblyomma americanum e Ixodes scapularis basándose en observaciones preliminares. Quizá la característica más innovadora de este sistema es su flexibilidad para manipulaciones experimentales a pequeña escala, permitiendo una variación controlada de tratamientos y condiciones ambientales, al tiempo que apoya aplicaciones de cría en colonias.

La alimentación in vitro de garrapatas es una herramienta valiosa para investigadores que estudian la biología, fisiología y competencia vectorial de las garrapatas. Sin embargo, la alimentación con garrapatas de membrana artificial es una tarea que consume mucho tiempo y esfuerzo. Este protocolo, que cuenta con una cámara impresa en 3D con un sistema de seguro seguro y una membrana sencilla fabricada en laboratorio, ofrece una configuración sencilla una vez impresas las cámaras y las membranas preparadas, permitiendo un uso prolongado. Además, ajustando el grosor de la membrana, el sistema puede adaptarse eficazmente a diferentes especies de garrapatas. Una optimización adicional, incluyendo el tamaño de la cámara y el grosor de la membrana, puede permitir su aplicación en diversas etapas de vida de las garrapatas.

Divulgaciones

Los autores no declaran intereses financieros materiales relacionados con la investigación descrita en este artículo.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer el trabajo diligente de los estudiantes y trabajadores de grado, Kara Golden, Sydney Ingham y Omayma Jaddou Najma, quienes ayudaron con la alimentación de las garrapatas y la instalación de la cámara y la membrana.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringuilla Luer-Lok de 1 mLBD309628Luer-Lok Tip
Silicona Transparente Avanzada  General Electric2810435Silicona transparente. Esta masilla forma una barrera impermeable al agua tras el curado.
Pegamento epoxi transparenteJB Weld-Clear‎ B009EU5ZM0Número de producto de Amazon
Envolvente transparente para alimentos (sello adherible)Me alegroCLO00020
Sangre bovina desfibrinadaLaboratorios HemostatDBB100
Sangre humana desfibrinadaBioIVT
Espátulas desechablesLevGo, Inc.17211Número de producto de Amazon
Incubadoras de baño secoONiLAB ScientificHB120-SNúmero de producto en Amazon. El bloque calefactor se invierte para obtener una superficie plana.
Sal sulfato de gentamicinaMillipore SigmaG3632-5G
Papel de limpieza de lentesTiffenEK1546027T
Puntas de micropipeta, 200 y mu; L Biotix uTIP63300057Para jeringuilla. Aplicador de silicona para masilla
Guantes de nitriloInspireCOBALT-OGNúmero de producto de Amazon
NistatinaBiorreactivos de FisherBP2949-5
Placa de Petri 35 mm x 10 mmHalcón351008
Impresora de resina Phrozen Sonic MEGA 8K V2PhrozenB0F9NBXVVTVolumen de construcción de 320 x 175 x 300 mm. Se puede comprar en Amazon si prefieren la impresión interna
Pro 8K fotopolímero   Resina Gris AquaPhrozenA través de la Universidad de ArizonaBaja encogimiento. Alta calidad y modelos 3D extremadamente intrincados con resolución 8K.
Imanes redondos de 3 mm x 2 mmMealosB08NZTN426Número de producto de Amazon
RPG fotopolímero Resina Smoke WhitePhrozenA través de la Universidad de ArizonaAlta calidad y modelos 3D extremadamente intrincados. Gran flexibilidad con una curvatura impresionante.
Aceite de siliconaMillipore Sigma378321-250ml
Diseño de software 3D gratuito en TinkercadTinkercadN/Ahttps://www.tinkercad.com
Pesaje de barcos (capacidad de 100 mL)Pura PontaMDO-AZOC-1030

Referencias

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