Artículo de método

Caracterización de rasgos estomales y epidérmicos mediante peelings, limpieza y análisis de imágenes basados en IA

DOI:

10.3791/69615

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27 de marzo de 2026

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1Centre of Estonian Rural Research and Knowledge, 2Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 3Estonian Academy of Sciences

En este artículo

Resumen

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Este protocolo presenta un método comparativo para evaluar rasgos estomales y epidérmicos en dos especies distintas utilizando peelings epidérmicos, técnicas de limpieza y análisis de imágenes asistido por IA. El objetivo es permitir la cuantificación reproducible y de alto rendimiento de las estructuras celulares que subyacen a la función estomática para aplicaciones agrícolas y para la investigación vegetal en general.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La caracterización precisa de la morfología estomática y de los rasgos epidérmicos circundantes es esencial para comprender la función estomática. Se presenta un protocolo comparativo utilizando dos técnicas complementarias —peelings epidérmicos y limpieza de hojas— para evaluar el tamaño, forma y densidad celular estomática y epidérmica en dos especies de dicotiledóneas ecológicamente distintas, Fraxinus excelsior y Taraxacum officinale. El protocolo incluye pasos detallados para la preparación de la muestra, la obtención de imágenes y la cuantificación de rasgos utilizando mediciones manuales eficientes tanto en coste como en mano de obra (limpieza y descamación de tejidos), y análisis de imágenes asistido por IA con potencial para facilitar aplicaciones de alto rendimiento. Se evaluaron tres herramientas de segmentación —un modelo de detección estomática basado en YOLOv8, una herramienta generalista de aprendizaje profundo para segmentación celular y un clasificador basado en píxeles— por su precisión y idoneidad entre métodos. Se observan de forma constante diferencias significativas en los rasgos estomales y epidérmicos entre las técnicas de pelado y limpieza tanto en análisis manuales como en IA. Las herramientas de IA permitieron la cuantificación reproducible, con el modelo de detección estomática basado en YOLOv8 (StoManager1) que rinde mejor para rasgos estomales y una herramienta generalista de aprendizaje profundo para segmentación celular (Cellpose) para segmentación epidérmica. La detección de rasgos basada en IA fue muy consistente en T. officinale pero limitada en F. excelsior; los resultados seguían divergiendo de las mediciones manuales, ilustrando cómo la anatomía específica y la calidad de imagen afectan a la idoneidad del método. Estos hallazgos sugieren que, aunque el análisis asistido por IA proporciona un marco útil para la cuantificación de rasgos estomales y epidérmicos, la validación experta y las pruebas piloto siguen siendo esenciales antes de una aplicación más amplia o de alto rendimiento en general.

Introducción

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Los estomas son poros microscópicos en la epidermis que desempeñan un papel vital en la regulación del intercambio gaseoso y la transpiración vegetal. Por tanto, comprender la base morfológica del funcionamiento estomatal es clave para mejorar el rendimiento de loscultivos 1. Aunque la mayoría de los estudios sobre la estructura y función estomática se centran únicamente en la morfología estomática, una comprensión completa de la respuesta estomática también requiere caracterizar el tamaño y la forma de las células epidérmicas circundantes. La cuantificación precisa de estos rasgos es fundamental para comprender las relaciones estructura-función que subyacen al intercambio de gases y la mejora de cultivos.

A medida que la mejora de cultivos depende cada vez más de enfoques avanzados de edición genética, es fundamental comprender los rasgos morfológicos clave —como los estomas— que influyen en la fotosíntesis, la eficiencia intrínseca en el uso del agua y la ganancia de carbono. Esta necesidad es especialmente urgente ante el cambio ambiental en curso, ya que la demanda de cultivos resilientes que mantengan tanto la capacidad fotosintética como el rendimiento crece ante sequías y olas de calor másfrecuentes 2,3. Por ello, existe una gran necesidad de protocolos estandarizados de imagen y análisis. El peeling estomatal con barniz o esmalte de uñas es el método más sencillo para obtener impresiones superficiales de hojas y medir el tamaño, forma y densidad estomática y epidérmica 4,5,6. Su procedimiento es rápido, no destructivo, lo que permite un procesamiento rápido de muestras. El método de limpieza tisular es un enfoque alternativo que permite la caracterización simultánea de la red de venas y, potencialmente, una caracterización más completa de la hidráulica foliar.

La eliminación química suaviza y vuelve los tejidos ópticamente transparentes, permitiendo la obtención de imágenes in situ de estomas y células epidérmicas sin interrupciones mecánicas. El aclaramiento es aplicable ampliamente a una variedad de tipos de tejido, incluyendo muestras secas o delicadas, y puede utilizarse no solo para la imagen estomática sino también para la visualización de redes de nervaciones, imagen por fluorescencia y estructuras anatómicasinternas 7,8,9,10,11,12 , permitiendo así analizar los rasgos estomales junto con otros rasgos funcionales. Existen varios métodos de despejado, que incluyen disolventes orgánicos, soluciones acuosas, hiperhidratación o incrustación de hidrogel 13,14,15. Estos difieren en duración, compatibilidad de imagen y disponibilidad de reactivos. El protocolo utilizado aquí es sencillo, rentable y no requiere habilidades especializadas. Ambas técnicas son económicas y rápidas en comparación con métodos más laboriosos como la microscopía óptica o la microscopía electrónica de barrido, que requieren la fijación química, incrustación y seccionamiento de muestras.

Los métodos tradicionales para analizar características estomáticas y epidérmicas suelen basarse en la segmentación manual de imágenes microscópicas, lo cual es laborioso, laborioso y propenso a sesgos del observador, lo que limita el rendimiento y reduce la eficiencia de la cadena de análisis16. Además, características anatómicas como los tricomas y las paredes celulares irregulares presentan desafíos adicionales para la cuantificación consistente de los rasgos. Aunque las herramientas automatizadas de análisis de imágenes ofrecen un gran potencial para la extracción de datos de alto rendimiento, han sido optimizadas para tejidos vegetales específicos y no son fácilmente transferibles entre tipos de hojas y métodos de preparación. Por ejemplo, StoManager1 (Figura Suplementaria 1) proporciona alta precisión en la detección de estomas utilizando un modelo de detección de objetos basado en YOLOv8, pero está entrenado específicamente para rasgos estomatales. Cellpose (Figura suplementaria 2) es un modelo de segmentación generalista y preentrenado que funciona bien cuando los datos de entrada se asemejan a sus modelos preentrenados (por ejemplo, cito, cito2), basados originalmente en células animales y orgánulos. Ilastik (Figura suplementaria 3) es una herramienta de clasificación basada en píxeles que se basa en anotaciones definidas por el usuario. Tanto Cellpose como Ilastik son fáciles de usar, pero cada uno puede requerir reentrenamiento o ajuste fino para adaptarse a variaciones en la calidad de imagen, artefactos de fondo y características específicas de los tejidos.

Además, la morfología de los estomas y la epidérmica muestra una alta variabilidad entre las especies17. Rasgos como la densidad y el tamaño estomatal son especialmente variables, pero suelen estar inversamente relacionados y en conjunto determinan las diferencias entre especies en la cinética estomática. Los estomas más grandes pueden compensar parcialmente la menor densidad, pero generalmente presentan una cinéticamás lenta 5, lo que puede ser desventajoso bajo olas de calor cada vez más frecuentes, donde las respuestas rápidas de los estomas son fundamentales para mantener la asimilación del carbono y prevenir una pérdida excesiva de agua. En conjunto, esta variabilidad complica la medición de rasgos estomales y puede comprometer la validez del protocolo seleccionado y la robustez de los resultados basados en IA.

Este protocolo integra dos técnicas clásicas de preparación: peelings epidérmicos y eliminaciones químicas, con herramientas modernas de inteligencia artificial (IA) y aprendizaje automático (ML) para la segmentación y medición de rasgos. Utilizando dos especies comunes de dicotiledóneas que demandan luz y con estrategias ecológicas contrastantes (F. excelsior y T. officinale), examinamos la variabilidad en los rasgos estomales y epidérmicos para evaluar cómo se comparan tres métodos y dónde pueden surgir posibles inexactitudes. Se evaluó el rendimiento de tres herramientas de IA: StoManager1 (un modelo de aprendizaje profundo basado en YOLOv8 para detección estomática), Cellpose (una herramienta generalista de segmentación de aprendizaje profundo) e ilastik (un clasificador basado en píxeles para tejidos epidérmicos). Este enfoque integrador permite la cuantificación reproducible y de alto rendimiento de rasgos estomales y epidérmicos, ofreciendo un marco robusto y escalable para el análisis fenotípico tanto en investigación ecológica como agrícola. Sin embargo, características anatómicas como tricomas densos, cutículas gruesas o bajo contraste en la frontera celular pueden reducir la precisión de segmentación y deben tenerse en cuenta al seleccionar entre enfoques de peeling y clearing y al aplicar cuantificación basada en IA.

Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo paso a paso que compara directamente los enfoques de peeling epidérmico y eliminación química en combinación con múltiples herramientas de segmentación basadas en IA para la cuantificación tanto de rasgos estomales como epidérmicos. Al unir técnicas clásicas de microscopía con flujos de trabajo de aprendizaje automático accesibles, el protocolo reduce el sesgo del usuario, aumenta el rendimiento y facilita la fenotipización reproducible entre especies. Esto hace que el enfoque sea ampliamente aplicable a la ecología, la mejora de cultivos y la investigación sobre cambio climático, y proporciona una base para la expansión continua de las herramientas mediante el reentrenamiento del modelo o el aprendizaje por transferencia.

Protocolo

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NOTA: No se requerían permisos ni aprobaciones específicas para la recogida de hojas de T. officinale y F. excelsior , ya que estas especies no protegidas se tomaron muestras de áreas de jardín de acceso público. La recogida de todas las muestras cumplió con las directrices institucionales y locales.

1. Recogida de material vegetal

  1. Selecciona hojas sanas para un análisis comparativo. Para el experimento actual, se seleccionaron hojas maduras sanas y expuestas al sol de dos especies de dicotiledóneas con distribución estomática contrastante: el árbol hipoestomatoso F. excelsior, que solo presenta estomas en la superficie inferior de la hoja, y la planta herbácea perenne anfitistomatosa T. officinale.
  2. Para cada tipo/ubicación de muestra, toma de 3 a 5 hojas replicadas.
  3. Despega la hoja con tijeras limpias o una cuchilla de afeitar. Coloca la hoja cortada inmediatamente en agua para evitar la deshidratación.
  4. Tras la recogida, sumerge completamente el pecíolo en agua y guárdalos a 4°C.
  5. Proceder con las secciones 2 o 3 del protocolo en un plazo de 48 horas.

2. Preparación y visualización de las cáscaras de impresión de estomas

NOTA: Todos los residuos químicos generados durante el protocolo de limpieza se gestionaron conforme a las normativas institucionales y locales de seguridad. Las soluciones que contenían glutaraldehído se recogían por separado y se eliminaban como residuos químicos peligrosos. Las soluciones de hidróxido de sodio (NaOH) se neutralizaron a pH 6-8 antes de su eliminación, cuando se permitió. Las soluciones diluidas de lejía y etanol se tiraron por el desagüe junto con grandes cantidades de agua fría en los lugares donde la normativa institucional y municipal lo permitía. Las soluciones TBO se recogían y eliminaban como residuos químicos según las directrices locales. Los usuarios deben consultar la oficina de seguridad de su institución para obtener procedimientos aprobados para la eliminación.

  1. Si es necesario, enjuaga suavemente la superficie de la hoja seleccionada con agua para eliminar el polvo o los restos. Seca inmediatamente la superficie de la hoja con papel de filtro o una toalla de papel suave para eliminar el exceso de humedad. No seques al aire, ya que esto puede provocar la contracción del tejido, lo que puede llevar a mediciones de tamaño inexactas de estomas y células epidérmicas.
  2. Etiqueta la lámina del microscopio con detalles de la muestra (por ejemplo, especie, lado de la hoja y fecha de preparación) utilizando un rotulador permanente para asegurar la trazabilidad de cada muestra durante la imagen, análisis e interpretación de datos, y permite un almacenamiento adecuado de la muestra para su uso futuro.
  3. Para especies con tricomas no glandulares (peludos), se retiran los tricomas de la superficie de la hoja con una cuchilla antes de la preparación del peeling, ya que su presencia puede ocultar los límites celulares y reducir la calidad de imagen (Figura 1).
  4. Con un pincel pequeño, aplica una capa fina y uniforme de esmalte transparente y no extensible (evita fórmulas de "elasticidad" o "despegante") en la zona objetivo. Siempre selecciona la parte central de la hoja para la preparación de la piel, evitando la punta y la base.
  5. Deja que el esmalte se seque completamente (normalmente entre 2 y 5 minutos a temperatura ambiente). La exposición prolongada puede causar decoloración tisular (por ejemplo, tinte rojizo en hojas más blandas), que puede ser visible en la pelación final, e interferir con los análisis posteriores que requieren una coloración uniforme.
  6. Una vez seco, aplica una tira de cinta transparente sobre la zona recubierta. Empieza por un borde del esmalte y coloca la cinta poco a poco sobre la superficie, presionando suavemente para asegurar una buena adherencia y evitar burbujas o pliegues de aire. Usa guantes de nitrilo para evitar huellas dactilares.
  7. Retira cuidadosamente la cinta junto con la película de esmalte (impresión epidérmica).
  8. Coloca la cinta (con el lado pegajoso hacia abajo) sobre una lámina limpia del microscopio, evitando pliegues o solapamientos.
  9. Guarda las láminas preparadas a temperatura ambiente, protegidas del polvo y de la luz solar directa.
  10. Examina la lámina bajo un microscopio óptico compuesto a 400x de aumento. Guarda las imágenes según la guía del software, junto con la escala correspondiente.

3. Preparación y visualización de secciones despejadas

  1. Corta trozos de hoja de aproximadamente 1cm 2. Realiza todos los pasos usando guantes de nitrilo y trabajando bajo una campana extractora.
  2. Transfiere las muestras a un vial marcado, cúbrelas con solución fijante (aldehído glutárico al 4% en un tampón fosfato de 0,1 M, pH = 6,9) (PRECAUCIÓN) y almacene a 4°C durante 24 horas (Tabla 1, para la preparación de la solución fijante).
  3. Retira la solución fijante con una pipeta y cubre las muestras con agua destilada. Sal 30 minutos. Repite tres veces (Figuras 2A-C).
  4. Retira el agua y cubre las muestras con 1 M de solución de NaOH (disuelve 20 g de NaOH en 0,5 L de agua destilada).
  5. Durante la limpieza de hojas, la solución de NaOH se pondrá verde. Sustituye la solución de NaOH una vez al día por una solución nueva. Continúa durante 3 a 4 días, o hasta que las muestras se vuelvan de amarillo pálido y la solución de NaOH permanezca clara (Figura 2D-F).
  6. Retira la solución de NaOH y cubre las muestras con lejía (5% de NaClO). La lejía doméstica comercial con esta concentración es adecuada.
  7. Incuba las muestras en lejía durante 1-2 minutos. Las muestras se volverán blancas y translúcidas (Figura 2G-I).
  8. Retira la solución anterior y cubre las muestras con agua destilada durante 2 minutos. Deshidrata las muestras mediante una serie graduada de agua destilada-etanol de la siguiente manera: 75:25, 50:50, 25:75 y 100% etanol.
  9. Retirar el etanol y cubrir las muestras con una solución alcohólica al 3% de toluidina azul O (TBO, disuelva 3 g TBO en 100 mL de etanol al 100%). Marcharse durante la noche.
  10. Retira la solución de tinción y cubre las muestras con etanol al 100% durante 2 minutos. Repite este paso usando una serie graduada de agua destilada-etanol de la siguiente manera: 25:75, 50:50, 75:25 y finalmente agua destilada (Figura 2J-L). Consulte la Figura 3 para los errores comunes y los pasos de solución de problemas asociados al proceso de limpieza.
  11. Mantén las muestras en agua destilada a 4°C hasta la visualización.
  12. Transfiere las muestras a una lámina de vidrio, añade una gota de agua destilada y cubre con una cubierta de vidrio para visualización microscópica e imagen.
  13. Examina la lámina bajo un microscopio óptico compuesto a 400x de aumento. Guarda las imágenes según la guía del software, junto con la escala correspondiente. Consulte la Tabla de materiales para más información.

4. Análisis y mediciones de imágenes

  1. Utiliza Fiji23 (distribución ImageJ, versión 1.54p) para el procesamiento y análisis de imágenes.
  2. Usando la herramienta Línea, dibuja una línea sobre la barra de escala, luego selecciona Analizar > Establecer escala, modifica la distancia conocida a la longitud de la barra de escala y cambia la unidad de longitud a μm.
  3. Ve a Analizar > establecer medidas. Asegúrate de que se comprueben las opciones de Área y diámetro de los Feret .
  4. Utiliza la herramienta de selección de polígonos para delinear el objeto de interés. Registra la medición pulsando la tecla M .
  5. Mide los siguientes rasgos estomales y epidérmicos en Fiyi y calcula tanto para muestras eliminadas como para peelings estomales (Figura 3).
  6. Calcula el número de estomas (Ns).
    1. Determina el área media del estoma (As).
    2. Determinar el ancho medio de los estomas (Ws): usando el diámetro mínimo de Feret.
    3. Calcula la densidad estomática (DE) mediante la siguiente fórmula:
      Ecuación 1
      ; por unidad Ia (el área de hoja seleccionada para las mediciones, mm2).
    4. Determina el área media de las células epidérmicas (Ae).
    5. Determina la densidad celular epidérmica (ECD) usando la siguiente fórmula:
      Ecuación 2

5. Estadísticas

  1. Utiliza ANOVA y la prueba post-hoc HSD de Tukey para comprobar las diferencias entre grupos de muestras.
  2. Realiza todos los análisis estadísticos en R21.
  3. Analiza un total de 3 hojas replicadas por especie y observa 3 cáscaras de cada hoja.

6. Análisis asistido por IA

  1. Selecciona herramientas de aprendizaje automático para segmentación.
    1. Selecciona herramientas de segmentación basadas en aprendizaje automático adecuadas basadas en la estructura objetivo (estomas o células epidérmicas), la calidad de imagen y los objetivos de análisis.
    2. Utilizar un modelo de aprendizaje profundo específico para estomas para la detección y medición automática de rasgos estomales y utilizar herramientas generalistas de aprendizaje profundo o segmentación basada en píxeles para la segmentación celular epidérmica.
    3. Consulte la sección de Herramientas y Software de Aprendizaje Automático para implementaciones específicas de software (archivo suplementario).
    4. Realizar pruebas piloto sobre un subconjunto de imágenes antes de un análisis a gran escala para evaluar el rendimiento de la segmentación e identificar posibles fuentes de falsos positivos.
  2. Prepara el entorno informático.
    1. Utiliza una estación de trabajo equipada con un procesador de 8-12 núcleos, al menos 32 GB de RAM y una GPU compatible con NVIDIA CUDA con un mínimo de 24 GB de VRAM.
    2. Utiliza una pantalla de alta resolución (preferiblemente 4K) para facilitar la anotación y la inspección visual.
    3. Instala todas las herramientas de software seleccionadas según las instrucciones de los desarrolladores y registra las versiones del software para garantizar la reproducibilidad.
  3. Prepara imágenes para el análisis de aprendizaje automático.
    1. Importar imágenes de microscopía en formato TIFF o PNG, utilizando imágenes en escala de grises de 8 o 16 bits cuando sea posible.
    2. Asegúrate de que cada imagen contenga una barra de escala visible o haya sido calibrada espacialmente antes del análisis.
    3. Selecciona regiones de interés con escombros, pliegues o burbujas de aire mínimos, iluminación uniforme y límites celdas claramente definidos.
    4. Excluye imágenes con bordes borrosos, sombras intensas o bajo contraste, ya que reducen la precisión de segmentación.
  4. Realizar segmentación estomática.
    1. Carga las imágenes en el modelo de aprendizaje profundo específico de estomas (Sección suplementaria de archivo 1).
    2. Configurar parámetros de detección, incluidos los límites de tamaño de los objetos y los umbrales de confianza, según la especie y la resolución de la imagen.
    3. Ejecuta detección automática para segmentar complejos estomales y extrae métricas de salida como el número de estomas, el área y los diámetros de Feret.
    4. Exporta máscaras de segmentación y tablas de medición para análisis posteriores. Inspecciona visualmente las superposiciones de segmentación y excluye manualmente los objetos detectados incorrectamente si es necesario.
  5. Realizar segmentación celular epidérmica.
    1. Carga imágenes en una herramienta generalista de segmentación de aprendizaje profundo o en un clasificador basado en píxeles (Sección suplementaria de archivos 2 - 4).
    2. Entrena o ajusta finamente el modelo usando imágenes representativas con ejemplos anotados manualmente de células epidérmicas, límites celulares y fondo.
    3. Ejecuta segmentación para generar máscaras de objeto y exporta las máscaras para su postprocesado en ImageJ/Fiji o software de análisis de imágenes equivalente.
    4. Aplica filtrado basado en tamaño o cuantiles para eliminar objetos pequeños falsos positivos y verifica la precisión de la segmentación mediante inspección visual antes de extraer métricas epidérmicas celulares como el área celular y la densidad celular.
  6. Documenta los parámetros y realiza el control de calidad.
    1. Registrar todas las versiones de software, ajustes de parámetros, umbrales de filtrado y especificaciones de hardware utilizadas durante el análisis.
    2. Conservar superposiciones representativas de segmentación para documentar la calidad de la segmentación.
    3. Valida visualmente los resultados automatizados de segmentación antes del análisis estadístico o la presentación de datos.
  7. Preparación de imagen para todo el procesamiento de ML
    1. Imagen de muestra
      NOTA: Dado que la segmentación basada en ML se basa en gradientes de intensidad, continuidad de bordes y geometría consistente del objeto en lugar del contexto biológico, el preprocesamiento de imágenes y la selección de regiones determinan críticamente el rendimiento del modelo y la estructura de errores.
      1. Captura imágenes de alta resolución de superficies de hojas despejadas o peladas con una barra de escala visible. Para buenos flujos de trabajo de aprendizaje automático, asegúrate de que los objetos medibles sean nítidos, continuos y de alto contraste en toda la imagen.
    2. Selección de regiones y calidad de imagen
      NOTA: Tras la adquisición de imágenes en la Sección 6.7.1, las imágenes se inspeccionan visualmente y, cuando la escala la permite, se seleccionan manualmente regiones de interés libres de artefactos para segmentación posterior. Selecciona regiones de interés con artefactos mínimos (por ejemplo, escombros, pliegues, burbujas de aire, iluminación desigual). Para modelos estomales (por ejemplo, StoManager1), prioriza la visibilidad clara de los poros y una silueta bien definida de la celda de guardia. Para modelos epidérmicos (por ejemplo, Cellpose, ilastik), asegurar gradientes de intensidad estables a lo largo de los contornos celulares; los bordes discontinuos o de bajo contraste reducen sustancialmente el rendimiento de segmentación. Las imágenes con límites mal definidos deben ser excluidas o reprocesadas antes de la segmentación.
    3. Formato de archivo
      Guardar archivos en formato TIFF o PNG (se recomienda la escala de grises de 8 o 16 bits para segmentación).
    4. Mejora de imagen opcional
      1. Aumenta el contraste o resta fondo en ImageJ/Fiji si los límites son débiles.
      2. Céntrate en la geometría de los bordes, ya que estos pueden crear falsos gradientes interpretados como bordes de celdas.
      3. Aplica estos ajustes de forma consistente en todas las imágenes dentro de un conjunto de datos.
        NOTA: Se debe prestar especial atención a la geometría de los bordes, ya que sombras, halos o degradados de fondo desiguales pueden crear transiciones de intensidad artificiales que los modelos de aprendizaje automático pueden interpretar erróneamente como bordes de celdas.
  8. StoManager1 (versión GUI v1.0.0)
    NOTA: StoManager1 permite la detección, medición y análisis automatizados y de alto rendimiento de estomas foliares de plantas mediante redes neuronales convolucionales (YOLOv8-seg-x). La herramienta cuantifica métricas estomáticas clave (área, densidad, proporción poro/célula protectora, índices de agregación, etc.) de varios tipos de imagen, reduciendo el esfuerzo manual y el sesgo, y facilitando estudios ecológicos y fisiológicos a gran escala. Está disponible una aplicación para Windows fácil de usar, que no requiere habilidades de programación salvo un postprocesado opcional (Sección de archivo suplementario 1)23.
    1. Ejecutar StoManager1: instalar y configurar
      1. Acceso a través de GitHub (https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1) o la aplicación independiente de Windows ((Archivo suplementario sección 1)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)23.
      2. Asegurar versiones compatibles de bibliotecas (dependencias de Python); pueden surgir conflictos si se instala otro software de ML/imágenes.
    2. Inicia StoManager1 mediante interfaz gráfica o interfaz de línea de comandos.
    3. Elige tu directorio de entrada que contiene imágenes de hojas.
    4. Selección de modelos; Consulta el modelo YOLOv8-seg-x para métricas más detalladas basadas en segmentación. Déjalo desmarcado para el modelo de caja delimitadora (YOLOv3), menos métricas.
    5. Ajuste de parámetros; Ajusta los umbrales de detección, la resolución de la imagen, la dilatación de la máscara y los límites de tamaño de objeto según sea necesario para tu modalidad/especie de imagen. Por favor, utiliza parámetros por defecto cuando algunos objetos de estomas permanezcan sin ser detectados, principalmente (1) disminuir el umbral de confianza de detección para recuperar más estomas verdaderos mientras se verifica la detección de falsos positivos; y (2) aumentar la resolución de la imagen, ya que un valor mayor puede mejorar la detección de estomas pequeños a costa de una mayor demanda computacional.
    6. Segmentación de ejecuciones:
      1. Haz clic en " Iniciar proceso" para detectar, segmentar y medir estomas y estomas enteros.
      2. Haz clic en " Análisis Estadístico" para procesar estadísticas a nivel de grupo.
    7. Recoge resultados. La salida se guarda en YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/ (modo de segmentación) o directamente en YOUR_OUTPUT_PATH (modo de caja delimitadora). Los archivos CSV contienen métricas por objeto y de resumen; También se generan máscaras e imágenes de resultados.
    8. Inicia el procesamiento por lotes.
    9. Al completar, recoge la salida: máscaras de segmentación y archivos de resultados CSV por imagen. Los resultados por imagen incluyen: número y área estomática, diámetro de Feret (máximo/min), métricas de células guardián, índices de agregación/uniforme/divergencia y relaciones poro/célula guardián.
    10. Revisa los resultados usando Excel, R o Python para obtener estadística y visualización adicionales.
    11. Control de calidad; Inspecciona visualmente las mascarillas y las superposiciones. Elimina objetos atípicos por tamaño, forma o curación manual si es necesario (véase más abajo).
      NOTA: Los protocolos detallados y los pasos de postprocesamiento para Cellpose e ilastik se proporcionan en el archivo suplementario. Para un rendimiento óptimo con grandes conjuntos de datos e imágenes complejas, recomendamos un sistema con un procesador de 8-12 núcleos, al menos 32 GB de RAM y una GPU NVIDIA compatible con CUDA y un mínimo de 24 GB de VRAM. También se recomienda encarecidamente una pantalla grande y de alta resolución (preferiblemente 4K) para una anotación y visualización eficientes.

Resultados

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Comparación de los resultados entre despegado y despejado

Tanto T. officinale como F. excelsior mostraron variabilidad en los rasgos estomales y epidérmicos dependiendo de si las muestras se eliminaban o pelaban (Figura 4). Las muestras eliminadas generalmente proporcionaban límites celulares más nítidos y una visualización más clara de la forma de la célula protectora y la apertura de los poros, aunque las capas de tejido superpuestas ocasionalmente ocultaban estomas más pequeños y sesgaban estimaciones de tamaño hacia arriba. En F. excelsior, el área y la anchura media de los estomas fueron significativamente mayores en muestras eliminadas que en peelings, mientras que en T. officinale no se observaron diferencias significativas. La densidad estomática fue significativamente mayor en muestras peladas de F. excelsior, mientras que no se detectó ningún efecto de método en T. officinale. El área celular epidérmica no difería entre métodos en ninguna de las especies, pero la densidad celular epidérmica era ligeramente mayor en muestras peladas de F. excelsior.

En general, las diferencias dependientes del método fueron específicas de rasgos y especies, lo que sugiere que la despegadura ofrece una opción fiable para las mediciones estomáticas, especialmente cuando los estomas varían en tamaño (por ejemplo, en hojas en desarrollo), mientras que los rasgos epidérmicos no se vieron afectados en gran medida (Figura 5).

Resultados de IA y cómo resuenan con los métodos de peeling y clearing

El modelo específico para estomas, StoManager1, detectó estomas de forma más fiable en imágenes peladas (Figura 6), mientras que el rendimiento disminuyó notablemente en muestras eliminadas (Figura 7). Para evaluar más a fondo el rendimiento de StoManager1 en los métodos de preparación, comparamos la detección de rasgos estomales en T. officinale y F. excelsior utilizando tanto peelings como imágenes despejadas (Figura 8). En T. officinale, el modelo detectó de forma fiable la presencia y densidad estomática a través de los métodos de preparación. Sin embargo, los valores resultantes diferían significativamente de las mediciones manuales (Tabla 2 y Figuras 5 y 8). La mayoría de los rasgos estomales diferían significativamente (p < 0,05) entre muestras peladas y eliminadas (Figura 8), lo que indica que las canaletas de detección de IA son muy sensibles a los métodos de preparación y requieren una validación cuidadosa antes de su aplicación a gran escala. En cambio, en F. excelsior, la detección se limitó a la superficie abaxial debido a la ausencia de estomas adaxiales, y en muestras eliminadas la detección fue inconsistente, con falsos positivos frecuentes (Figura 8). Estos resultados ponen de manifiesto la fuerte influencia de las características anatómicas específicas de cada especie y la calidad de la imagen en la eficacia de los análisis basados en IA. Herramientas generalistas de aprendizaje automático como Cellpose (Figura 9A) e Ilastik (Figura 9B) segmentaron las células epidérmicas de forma más eficaz en imágenes peladas que en imágenes borradas. Sin embargo, ambas herramientas produjeron numerosos falsos positivos con ambas técnicas de preparación (peeling y clearing), especialmente en condiciones de bajo contraste o cuando los contornos celulares estaban difuminados. En tales casos, los contornos estomales o epidérmicos indistintos a menudo se sobresegmentaban en múltiples objetos diminutos erróneamente clasificados como células epidérmicas individuales (véase la Figura 10). Por ello, el postprocesamiento es esencial, no solo la eliminación de valores atípicos sino también el filtrado por cuantiles superiores, para conservar celdas identificadas de forma fiable.

Figura 1
Figura 1: Hojas estomáticas de hojas de F. carica antes y después de la extracción de tricomas usando una cuchilla de afeitar. Los tricomas grandes pueden dejar marcas en la piel, formando bolsas de aire que resultan en superficies desiguales y dificultan la concentración constante (visibles como grandes puntos grises). F. carica fue incluido como un caso atípico para extender el protocolo a hojas peludas. (R) A 200x de aumento, la imagen antes de la retirada del tricoma queda parcialmente obstruida por las impresiones del tricoma. (B) La calidad de la imagen mejora tras la eliminación de los tricomos. (C) A un aumento de 400x la imagen antes de la extracción del tricoma está en gran medida obstruida por impresiones de tricomas. (D) La obstrucción es mínima en la imagen tras la extracción de los tricomas con una cuchilla de afeitar. Las barras de escala son 100 μm (A, B) y 50 μm (C, D). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Pasos consecutivos del protocolo de compensación. Imágenes representativas de T. officinale, F. excelsior y F. carica ilustran las etapas sucesivas del protocolo de despeje. (A-C) Hojas frescas. (D-F) se va tras despejar con NaOH. (G-I) se va después de blanquear con NaClO. (J-L) hojas tras teñirlas con toluidina azul O. Esta ayuda visual muestra la apariencia esperada de la muestra antes de pasar al siguiente paso y resalta la variabilidad del protocolo entre especies. F. carica fue incluida como especie atípica para demostrar la aplicabilidad del protocolo en una gama más amplia de morfologías foliares y de nervuras. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3
Figura 3: Ejemplos de mediciones de rasgos estomales y epidérmicos. Los rasgos medidos se ilustran en la imagen de la siguiente manera: As = área estomática; Ls = longitud estomática; Ws = ancho estomatal; Ae = área celular epidérmica. Se calcularon la densidad estomática y la densidad celular epidérmica dentro del área marcada, según se describe en el protocolo. Imagen con ampliación de 400x. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Comparación de imágenes obtenidas con el protocolo de eliminación y el protocolo de pelado. Imágenes representativas de T. officinale y F. excelsior comparando imágenes de aclaramiento y peeling estomatal que muestran la visibilidad y variabilidad del tamaño y densidad de las células de estomas y epidermis. Barra de escala 50 μm, y las imágenes se toman con una ampliación de 400x. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Diferencias en los resultados de medición manual de rasgos entre el protocolo de limpieza y el peeling. Diagramas de caja que muestran diferencias en los rasgos estomales y epidérmicos entre los métodos de limpieza y peeling epidérmico en T. officinale y F. excelsior. (A) Área media de los estomas: (B) ancho medio de los estomas, (C) densidad estomática (D), área celular epidérmica media, y (E) densidad celular epidérmica. Los asteriscos indican niveles de significación estadística (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). La significación estadística se evaluó utilizando ANOVA unidireccional seguida de la prueba post-hoc HSD de Tukey. Tamaño de muestra por grupo: n = 3-5. Abreviaturas: As = área estomática; Ws = ancho estomatal; SD = densidad estomática; Ae = área celular epidérmica; ECD = densidad celular epidérmica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6
Figura 6: Ejemplo de resultados de segmentación utilizando un modelo de detección estomática en una muestra de peeling. Resultado de segmentación StoManager1 para una muestra pelada de T. officinale (cara inferior de una hoja madura expuesta a sombra), mostrando buena precisión en la detección. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7
Figura 7: Ejemplo de resultado de segmentación utilizando un modelo de detección estomática en una muestra eliminada. Resultado de segmentación StoManager1 para una muestra eliminada de T. officinale (lado inferior de una hoja madura expuesta a la sombra), mostrando una menor precisión en la detección en comparación con las muestras peladas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8
Figura 8: Diferencias en los resultados de medición de rasgos asistidos por IA entre el protocolo de limpieza y peeling. Diagramas de caja que muestran mediciones derivadas de IA de rasgos anatómicos estomales a partir de imágenes procesadas por StoManager1 en T. officinale y F. excelsior. Las características incluyen el área estomática (As), la anchura estomática (Ws), la longitud estomática (Ls) y la densidad estomática (Ds). Las unidades son como en la Figura 5. La significación estadística se evaluó utilizando ANOVA unidireccional seguida de la prueba post-hoc HSD de Tukey. Los asteriscos indican niveles de significación estadística (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). Tamaño de muestra por grupo: n = 3-5. Abreviaturas: As = área estomática; Ws = ancho estomatal; Ls = longitud estomática; Ds = densidad estomática. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 9
Figura 9: Capturas de pantalla que muestran la segmentación con una herramienta generalista de aprendizaje profundo y un clasificador basado en píxeles. Segmentaciones de muestras de F. excelsior pelado (superficie abaxial de la hoja) con (A) herramienta generalista de aprendizaje profundo (Cellpose (cito2)) y (B) clasificador basado en píxeles (ilastik). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 10
Figura 10: Mascarilla de segmentación Ilastik para una muestra pelada de F. excelsior (lado abaxial de una hoja), mostrando numerosos falsos positivos. Los diminutos puntos se clasifican erróneamente como células epidérmicas distintas. Durante el postprocesado, se requiere una inspección manual (visual) para establecer umbrales basados en el tamaño y así filtrar eficazmente los falsos positivos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

SoluciónPreparaciónVolumen final
Base para el buffer 17,12 g (Na2HPO4 *2H2O) en 200 mL de dist. H2O200 mL
Base para el buffer 27,12 g de Na2HPO 4 *2H2O) en 200 mL de dist. H2O200 mL
Amortiguador de fosfatoMezcla 36 mL de base 1, 14 mL de base 2 + 50 mL de dist. H2O100 mL
Solución fijadoraMezcla 9,25 mL de glutaraldehído al 5% con 12,5 mL de tampón fosfatado y 28,25 mL de dist. H2O50 mL

Tabla 1: Receta para la solución defijación 24. Composición de las soluciones utilizadas en este estudio.

EspeciesSideMétodoHombre (As)IA (As)Hombre (Ws)IA (Ws)Hombre (Ls)IA (Ls)
FraxinusAbaxialPeel177.439.3212.712.8517.583.58
TaraxacumAbaxialAutorizado408.0918.8420.14.1926.145.39
TaraxacumAbaxialPeel262.5413.9315.183.4722.24.68
TaraxacumAdaxialAutorizado414.4814.9120.113.4426.095.71
TaraxacumAdaxialPeel258.7211.3715.723.321.154.08

Tabla 2: Comparaciones indicativas sobre mediciones manuales y IA. ML (StoManager1) escaló resultados. El hombre y la IA indican, correspondientemente, resultados manuales y de IA (StoManager1). Las unidades son como en la Figura 5. Las mediciones manuales y de IA difieren significativamente. Algunas comparaciones no están disponibles por diversas razones, incluyendo la ausencia de estomas (por ejemplo, F. excelsior adaxial) o la detección fallida (por ejemplo, los estomas fueron más difíciles de detectar en muestras eliminadas debido a los contornos celulares más difusos).

Figura suplementaria 1: Ejemplos de errores comunes que ocurren durante la limpieza de hojas que afectan a los resultados. Imágenes mostradas para fines de diagnóstico: (A) tinción desigual debido a la rehidratación incompleta de la muestra durante la sección 3.10; (B) daños mecánicos derivados del mal manejo de la muestra muy frágil procesada químicamente; (C) tono verdoso en el centro de la muestra debido a la eliminación incompleta de clorofila durante la sección 3.5. Por favor, haz clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 2: Ejemplo de la interfaz de usuario de StoManager1. Captura de pantalla de la interfaz de usuario de StoManager1 mostrando la configuración de entrada y la tabla de resultados (izquierda), y las vistas micrográficas con imágenes originales (arriba a la derecha) y la superposición de detección de estomas (abajo a la derecha, superficie adaxial de una muestra pelada de T. officinale ). Por favor, haz clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 3: Ejemplo de la interfaz de usuario de Cellpose. Captura de pantalla de la segmentación de Cellpose en curso a través de la interfaz gráfica con parámetros ajustables (por ejemplo, selección de modelo - modelo cyto2 preentrenado recomendado o un modelo entrenado a medida, umbrales y calibración del diámetro celular). La anotación manual supervisada de las células epidérmicas destaca cada célula con un color único para guiar la calibración del modelo. La superposición muestra la segmentación de un peeling epidérmico abaxial de F. excelsior . Por favor, haz clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 4: Proceso de segmentación de Ilastik. La superposición ilustra la clasificación basada en píxeles sobre una imagen de peeling epidérmico abaxial de F. excelsior . (A) Captura de pantalla de la segmentación de ilastik en curso mostrando entrenamiento supervisado con clases etiquetadas manualmente: células epidérmicas (amarillas), contornos celulares (azules) y fondo no epidérmico como tricomas (rojo). (B) Captura de pantalla que muestra solo la clase de la epidermis (amarillo), ilustrando cómo el clasificador aísla células epidérmicas individuales. Observa la presencia de múltiples detecciones "diminutas" de falsos positivos, especialmente en regiones de bajo contraste o iluminación desigual. (C) Captura de pantalla que muestra solo la clase de contorno (azul), ilustrando cómo el clasificador aísla los límites celulares del tejido epidérmico circundante. Obsérvese que algunos contornos son discontinuos y que ocurren múltiples detecciones de falsos positivos "pequeñas", especialmente en regiones de bajo contraste o iluminación desigual. (D) Captura de pantalla mostrando la clase de antecedentes. La mascarilla resalta complejos estomáticos, tricomas glandulares y restos diversos (rojo), excluyendo los cuerpos celulares epidérmicos. Numerosas pequeñas detecciones falsas positivas "diminutas" son visibles en las regiones epidérmicas, derivadas de artefactos en escala de grises y mala clasificación basada en texturas. Por favor, haz clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 5: Configuraciones de entrenamiento de Cellpose. Ejemplo de ajustes de entrenamiento (GUI) de Cellpose para una muestra de T. officinale aprobada (ambas superficies de hoja), mostrando los parámetros predeterminados del modelo antes del ajuste. Se selecciona el modelo cyto2 preentrenado, con una tasa de aprendizaje de 0,1 y 100 épocas de entrenamiento (valores por defecto), que determinan la velocidad de actualización de los pesos del modelo y el número de pasadas de entrenamiento, respectivamente. Estos valores predeterminados suelen modificarse (por ejemplo, tasa de aprendizaje = 0,15; épocas = 12) para reducir el tiempo de entrenamiento y adaptar el modelo a la morfología epidérmica de las plantas; sin embargo, números de época más bajos pueden reducir el rendimiento de detección y aumentar los falsos positivos. Por favor, haz clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 6: Cellpose "etiqueta" la máscara. Aplicación de la máscara de "etiquetas" Cellpose para una muestra pelada de F. excelsior (superficie abaxial de la hoja), mostrando el resultado de un entrenamiento supervisado en el que a cada objeto segmentado se le asigna un identificador único. Las células epidérmicas (marcadas e) dominan, mientras que también se detectan pares de células guardianas estomáticas (marcadas con g). Los falsos positivos son evidentes cuando los tricomas se clasifican erróneamente como células epidérmicas (arriba a la izquierda) o estomas (parte inferior central), así como falsos negativos cuando las células epidérmicas permanecen sin etiquetar en partes de la imagen. Este tipo de máscara se utiliza para la cuantificación y refinamiento posterior de modelos supervisados. Por favor, haz clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 7: Cuantificación de células epidérmicas segmentadas en ImageJ/Fiji. Capturas de pantalla que muestran la cuantificación de células epidérmicas segmentadas tras la clasificación de píxeles de ilastik para una muestra pelada de F. excelsior (superficie abaxial de la hoja). (A) En la máscara exportada, cada cúmulo de píxeles detectado corresponde a una partícula individual, lo que permite la extracción automática de métricas a nivel de objeto (por ejemplo, área, perímetro, diámetros de Feret). La ventana de Resultados (abajo) muestra mediciones en bruto para miles de objetos; Observa el número excepcionalmente alto de partículas pequeñas que surgen de ruido de puntos "diminutos" y contornos fragmentarios, lo que indica la presencia de numerosos falsos positivos. Estos artefactos requieren un filtrado biológico informado posteriormente para aislar las verdaderas células epidérmicas antes del análisis estadístico posterior. (B) Filtrado basado en áreas de objetos epidérmicos segmentados en ilástico en ImageJ/Fiji. Se excluyen pequeños fragmentos y ruido aplicando un umbral de área mínima de 150-350 μm², reduciendo el número de partículas detectadas aproximadamente un orden de magnitud (diez veces) respecto a la máscara sin filtrar del panel A. Aunque este paso de filtrado elimina sustancialmente pequeños falsos positivos, persiste una clasificación imperfecta: los contornos fragmentados y los elementos no epidérmicos residuales permanecen y requieren refinamientos adicionales, como umbrales de circularidad o un análisis post-cribado biológicamente informado. Por favor, haz clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 8: Post-procesamiento de una máscara de "etiquetas" de Cellpose en ImageJ/Fiji. Al utilizar el plugin Labels to ROIs para una muestra pelada de F. excelsior (superficie abaxial de la hoja), cada objeto segmentado en la máscara se convierte en una región de interés (ROI), lo que permite la inspección y medición individual de células epidérmicas y complejos celulares protectores estomatales. Los ROI se superponen sobre la micrografía original (izquierda), mientras que la ventana de Resultados (abajo a la derecha) muestra métricas a nivel de celda (por ejemplo, área, diámetros de Feret, perímetro). Este paso permite una curación biológicamente informada, permitiendo a los usuarios verificar si cada ROI corresponde a una verdadera célula epidérmica y descartar artefactos como tricomas o estomas mal segmentados que persisten tras el filtrado umbral, informando así los pasos posteriores de análisis. Por favor, haz clic aquí para descargar esta figura.

Discusión

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Para mediciones estomáticas consistentes, deben tomarse peelings de la lámina central para obtener resultados estandarizados, evitando las venas principales, ya que la densidad estomática muestra una fuerte variación dentro de la hoja, disminuyendo hacia la base, punta y márgenes25,26. Las hojas frescas producen las cáscaras más fiables, siempre que se utilicen esmalte de uñas transparente y no encogedor y cinta transparente de alta calidad para evitar deformaciones o artefactos. Los retrasos posteriores a ~12 horas reducen la claridad del contorno por deshidratación. Como los peelings se montan temporalmente y pueden atrapar aire, se recomienda una imagen temprana, aunque la calidad sigue siendo aceptable incluso después de un mes.

Existen varios métodos de limpieza para tipos específicos de tejido, objetivos de imagen y consideraciones de seguridad 13,14,15. La eliminación química se realizó utilizando un protocolo acuoso basado en NaOH por su accesibilidad, baja toxicidad y amplia aplicabilidad entre tipos de hojas. Debido a que las respuestas tisulares varían entre especies, se requieren pruebas y optimización. Las hojas esclerófilas pueden requerir ≥2 semanas, y el tejido verde residual puede interferir con la tinción y ocultar características anatómicas (Figura suplementaria 1C). Para un despeje más rápido, la concentración de NaOH puede aumentarse a 2,5 M o 5 M. Las hojas blandas se vuelven frágiles tras el blanqueo (Sección 3.7; Figura suplementaria 1B), y la sobreexposición al hipoclorito de sodio (NaClO) pueden degradar tejido o causar separación de la capa epidérmica. Aunque 30 s a 2 minutos de blanqueo son suficientes para la mayoría de las hojas blandas, las especies más resistentes pueden requerir hasta 1 h27. Aunque el desmonte es más lento que la preparación de la pelada, requiere ~5 días y no tiene entrenamiento especializado, puede ajustarse para diversas especies. Las muestras limpiadas y teñidas pueden almacenarse en agua destilada a 4°C, recomendándose un montaje permanente para su conservación a largoplazo 15,27.

El StoManager1 específico de estomas detectó de forma fiable complejos estomales en la mayoría de los tipos de imagen (figura suplementaria 2), con resultados de detección generalmente consistentes con la anotación manual para métodos basados en peel. Sin embargo, las mediciones de áreas estomáticas diferían sistemáticamente de las mediciones manuales (Tabla 2), lo que requirió calibración basada en un pequeño subconjunto medido manualmente (por ejemplo, 10-20 estomas por especie) antes del análisis a gran escala. StoManager1 aumenta sustancialmente el rendimiento, siendo necesaria la verificación manual en casos no estándar.

La segmentación simultánea estoma-epidermis es un reto porque la nitidez óptima difiere, y la heterogeneidad en morfología y claridad de membranas introduce error de segmentación. De la misma manera, el entrenamiento en conjuntos de imágenes grandes (por ejemplo, superficies adaxiales/abaxiales, peladas/borradas) pierde especificidad. No existe un modelo Cellpose preentrenado para la epidermis vegetal; Los modelos estándar "CYTO" y "CYTO2", entrenados principalmente en células animales, tienen un rendimiento inferior en imágenes epidérmicas. Por tanto, se requiere formación personalizada para garantizar la fiabilidad (Sección suplementaria 2). Incluso después del entrenamiento, la sobresegmentación y los falsos positivos siguen siendo frecuentes, especialmente en imágenes de bajo contraste o sin aclarar (Figura suplementaria 3).

En ilastik (sección suplementaria 3, figura suplementaria 4), deben generarse máscaras objeto para las clases celulares objetivo (por ejemplo, clase 1 para la epidermis), manteniendo las máscaras de clase para auditoría y corrección manual. El procesamiento por lotes y los flujos de trabajo posteriores de ImageJ/Fiji pueden ahorrar tiempo y reducir errores manuales. Un filtrado consistente por área, desviación estándar o cuantiles es esencial para suprimir el ruido y las detecciones espurias. Tras el filtrado, el área mediana de las células y los conteos de células se acercan a los valores manuales. El comparativo con mediciones manuales y herramientas alternativas de aprendizaje automático (Weka, RootPainter) sigue siendo esencial para ajustar parámetros y evaluar la calidad de la segmentación. El procesamiento por lotes de ML requiere muchos recursos. El entrenamiento estable y la segmentación por lotes a gran escala requieren una GPU compatible con NVIDIA CUDA y ≥32 GB de RAM. En sistemas de gama media (por ejemplo, 16 GB de RAM con gráficos integrados), el entrenamiento supervisado suele requerir ~5-10 minutos para <10 imágenes y frecuentemente se bloqueaba cuando se usaban múltiples clases de anotación o tipos de imagen heterogéneos. CUDA aumentó la velocidad de procesamiento en ~10-20 veces respecto a la ejecución de la CPU o GPU integrada.

Las diferencias en el rendimiento entre Cellpose, ilastik y StoManager1 surgen de sus representaciones de características distintivas. Cellpose predice campos de flujo vectorial hacia los centros del objeto y es sensible a halos ópticos y límites refractivos abruptos, que interrumpen el flujo y generan grupos de falsos positivos en F. excelsior eliminado. Ilastik, como clasificador de píxeles guiado por humanos, sobresegmenta paredes celulares o halos de pavimento en alto relieve, a menos que esté explícitamente etiquetado como fondo. StoManager1 detecta complejos estomales usando patrones de forma a nivel de objeto (celdas guardián emparejadas con un poro central) y funciona bien en preparaciones de peeling, incluyendo F. excelsior28; sin embargo, el desenfoque inducido por halo afecta la visibilidad de los poros al aclararse para producir falsos negativos en lugar de una clasificación errónea (Secciones suplementarias1 y 3). En consecuencia, Cellpose y StoManager1 funcionan como segmentadores automatizados, mientras que ilastik funciona como clasificador guiado por humanos (Archivosuplementario sección 1-3)28,.

La arquitectura celular específica de cada especie modula el rendimiento de la IA. En T. officinale, los márgenes de celda de guardia suaves y elípticos coinciden con la distribución de entrenamiento de StoManager1, lo que permite la detección en muestras despegadas (figura suplementaria 2), mientras que las herramientas generalistas frecuentemente confundían celdas de guardia y de pavimento. En F. excelsior, los estomas empotrados y las células pavimentadas en alto relieve provocan falsos negativos en imágenes borradas. Estas discrepancias reflejan geometrías de imagen dependientes de la especie y la preparación. Las diferencias sistemáticas entre mediciones manuales y derivadas de IA provienen de dos fuentes: la falta de codificación a escala de la imagen por parte de la IA y los artefactos ópticos inducidos por la preparación. Las estrategias de mitigación incluyen la triaje visual de borrones y halos de la preparación tisular, uso preferente de peelings bajo las condiciones descritas anteriormente, calibración manual con corrección lineal en un pequeño subconjunto de estomas (manual = a + b × IA). Estrategias adicionales incluyen aumentos específicos de taxones y diseño de clases auxiliares para el entrenamiento (aunque los entrenados por su cuenta probablemente seguirán siendo inferiores a los modelos preentrenados en conjuntos de datos grandes y diversos), y el filtrado de cuantiles superiores tras la segmentación.

Dado que los errores de segmentación de IA son sistemáticos y no aleatorios, el postprocesamiento es esencial. Los diagnósticos de calidad de imagen pueden seguir un árbol de decisión sencillo. Empieza comprobando el contraste y la nitidez epidérmica: si es agudo, pasa a falsos positivos; Si se desenfoca, espera pequeños artefactos de alta frecuencia y ajusta los filtros. Si los falsos positivos (por ejemplo, puntos, escombros) son mínimos, suele ser suficiente el filtrado de ±2-3 valores atípicos de SD. Si predominan pequeños artefactos, utiliza filtrado basado en cuantiles. Luego compara las distribuciones de rasgos (por ejemplo, mediana Ae) con expectativas biológicas o datos manuales. Refinar los umbrales según sea necesario: mantener solo cuantiles superiores del 10-50% en conjuntos de datos ricos en artefactos garantiza resultados significativos (Figuras suplementarias7 y 8). Debido a las altas tasas de falsos positivos producidas por herramientas de aprendizaje automático epidérmico, no se pudieron obtener estimaciones fiables de densidad estomática automáticamente, mientras que StoManager1 proporcionó mediciones estomáticasprecisas 28 cuando los límites estaban claros (véanse las Figuras 6 y 7). Para la mediana epidérmica, la Ae resultó robusta, siendo menos sensible a falsos positivos pequeños que la media.

La elección del método influyó en la detección de rasgos. El peeling superó la limpieza para la densidad estomática al exponer completamente los estomas (Figura 3), mientras que el despejado a menudo ocultaba los estomas más pequeños en tejidos en capas o pigmentados, a pesar de que a veces conservaban mejor la forma estomática27. Entre las herramientas de IA, StoManager1 proporcionó consistentemente mediciones estomáticas robustas con una curación mínima, especialmente en preparaciones depeeling 23, y el peeling también mejoró las mediciones epidérmicas al aumentar las células correctamente identificadas y la coberturade imagen 2. Las ganancias futuras probablemente provengan de modelos preentrenados grandes y taxonómicamente diversos, para integrarlos en canales de imagen automatizados para la ecofisiología y la mejora de cultivos.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores reconocen el Programa H2020 de la Unión Europea (proyecto GAIN4CROPS, GA nº 862087). El Centro de Excelencia AgroCropFuture Agroecology y nuevos cultivos en climas futuros (Ministerio de Educación e Investigación de Estonia), Consejo de Investigación de Estonia (PRG 3201 y PRG 2207 y TARISTU24-TK28).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Desinfectante limpiador líquido NaClO < 5%Domestos, GBH000023244  Quemaduras en la piel y quemaduras en la piel;
Dihidrato de fosfato de hidrógeno sódico (Na2HPO4. 2H2O) PENTA, CZ10028-24-7NA
Etanol, abs. 100% de a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000  Altamente inflamable y no es bueno;
Vial de vidrio 2 mLVWR Life Science, EE. UU.548-0045
Solución de glutaraldehído al 50%VWR Life Science, EE. UU.23H2856331Mortal si se inhala. Tóxico si se ingiere. Lleva guantes protectores, etc; ropa,   gafas.
Portaobjetos de microscopioNormax, PT5470308ANA
Capa superior para el cuidado de las uñas seca rápidoBfigure-materials-1K (INEZA), TENIENTELT-02244NA
Nikon Eclipse E600 y Nikon DS0Fi1 5 MPCorporación Nikon, JPhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600NA
Puntas de pipeta y puntasTermociencia, FIKJ16047NA
Hojas de acero de un solo filoInstrumentos de Oxford51-1625-0182NA
Dihidrógeno fosfato de sodio dihidrato (NaH2PO4 . 2H2O) puroPENTA, CZ13472-35-0NA
Pellets de hidróxido de sodio (NaOH) purosMerck KGaA, DE1310-73-2Quemaduras graves.
Cinta transparente para material de papeleríaFOROFIS, LV91231NA
Azul toluidina, grado de uso generalThermoFisher Scientific, GB2045836NA

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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