Procedimientos para la identificación de inhibidores de entrada del SARS-CoV-2 como posibles antivirales utilizando pseudovirus basados en MLV

Resumen

Este artículo describe la metodología para generar partículas pseudotipadas de SARS-CoV-2 utilizando un sistema reportero luciferasa y su uso para identificar inhibidores de entrada. Estos protocolos se demuestran utilizando dos inhibidores de entrada diferentes, una proteína de fusión humana recombinante ACE2-Fc y el compuesto de pequeña molécula arbidolo.

Resumen

El virus SARS-CoV-2 es un patógeno zoonótico emergente que ha causado una enorme carga de enfermedades y mortalidad en todo el mundo desde su aparición en 2019. Plataformas seguras y accesibles para evaluar la entrada viral y posibles compuestos antivirales siguen siendo esenciales para el descubrimiento continuo de fármacos contra variantes emergentes. Este artículo describe un protocolo altamente optimizado para generar partículas pseudotipadas basadas en el virus de la leucemia murina (MLV) que expresen la proteína spike del SARS-CoV-2 y porten un gen reportero luciferasa, lo que permite el estudio de la entrada viral bajo condiciones de bioseguridad nivel 2. Los métodos descritos detallan el uso de líneas celulares optimizadas, una alta eficiencia de transfección utilizando reactivos rentables, la producción de pseudovirus altamente efectivos y la titulación de la infectividad para determinar el mínimo aporte viral en los ensayos de cribado. Los resultados representativos demuestran una actividad robusta de luciferasa en células infectadas en comparación con controles no infectados, mientras que los pseudovirus sin pico y VSV-G confirman la especificidad del ensayo. Además, el sistema apoya el cribado de compuestos cuantificando los efectos inhibidores sobre la entrada viral y evaluando la citotoxicidad mediante un ensayo de viabilidad MTT. En conjunto, este protocolo reproducible y escalable proporciona una plataforma fiable para el cribado de rendimiento medio a alto de nuevos inhibidores de entrada viral, contribuyendo a la identificación de candidatos antivirales y al avance de la investigación sobre los mecanismos de entrada del SARS-CoV-2.

Introducción

La aparición del Coronavirus 2 del Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS-CoV-2) a finales de 2019 provocó una pandemia global que provocó millones de muertes en todo el mundo y sigue representando una amenaza debido a nuevas variantes con mayor transmisibilidad y potencial de escape^{inmunitario 1}. Como virus de ARN envolto de la familia Coronaviridae, el SARS-CoV-2 utiliza su glicoproteína trimérica spike (S) para mediar la entrada de la célula huésped uniéndose al receptor de la enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2) y activando proteolíticas por TMPRSS2 y otras proteasas^{del hospedador 2,3}. Aunque se han desarrollado varias opciones de tratamiento para controlar los síntomas de la COVID-19, la evolución continua y el rápido desarrollo de variantes virales ponen de manifiesto la urgente necesidad de sistemas seguros y escalables para estudiar la entrada viral y evaluar nuevos compuestos antivirales que actúen en este primer paso de la infección⁴.

El virus SARS-CoV-2 sigue clasificado como agente^{de bioseguridad nivel 3} 5 en algunos territorios debido a su alto potencial de transmisión. Por lo tanto, cualquier tarea de laboratorio replicativo requiere una instalación BSL-3 de alta contención, lo que dificulta la capacidad de la mayoría de los laboratorios de campo para realizar investigación científica con este virus. Los sistemas basados en virus pseudotipados, también conocidos como pseudovirus (PV), ofrecen una alternativa práctica que permite estudios de entrada viral en laboratorios de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2), ampliando la accesibilidad para los esfuerzos de investigación^{globales 6}. Las partículas pseudotipadas que portan la proteína spike del SARS-CoV-2 no se replican, lo que las convierte en un sustituto seguro para evaluar la entrada del virus y detectar inhibidores de pequeñas^{moléculas 7}. Estas partículas pueden ser diseñadas para transportar un gen de luciferasa o reportero fluorescente, lo que permite una detección rápida y cuantitativa de la infección mediante la medición de la señal reportera en células infectadas. Los sistemas basados en el virus de la leucemia murina (MLV) o en esquemas lentivirales se han utilizado ampliamente para estudiar la entrada de SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, virus del Ébola, entre otros 8,9,10,11.

En estos protocolos, describimos la generación de PVs basados en MLV utilizando un sistema de tres plásmidos, basándonos en el trabajo reportado por Millet y^{Whittaker 8}. Los plásmidos utilizados incluyen un plásmido de empaquetado que codifica los genes centrales del MLV gag-pol (pCMV-MLVgagpol), un vector de transferencia que codifica el gen reportero luciferasa (pTG-Luc) y un plásmido que expresa la glicoproteína de pico SARS-CoV-2 correspondiente a la variante original de Wuhan-Hu-1. Además, también se generan pseudovirus utilizando la G-glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) para usarse posteriormente como contracribado de posibles hits. Los pseudovirus se producen en células derivadas de HEK293 y se utilizan para infectar células altamente susceptibles que expresan hACE2 y TMPRSS2 de forma estable. La eficiencia de transfección se evalúa primero utilizando un plásmido expresor de proteína fluorescente verde (GFP). Luego, utilizando condiciones de transfección optimizadas, se generan PVs mediante la co-transfección de estos tres plásmidos, seguida de la titulación de los virus resultantes. Utilizando la cantidad adecuada de PVs, se realiza un ensayo en placas de 96 pozos para detectar compuestos capaces de inhibir la entrada de los virus. Este protocolo utiliza polietilenimina ramificada (PEI) como reactivo de transfección rentable, facilitando la implementación de los procedimientos.

Protocolo

1. Transfección de alta eficiencia de células derivadas de HEK293T utilizando polietilenamemina ramificada (PEI)

NOTA: Realizar todos los pasos en un armario de bioseguridad utilizando la técnica aséptica estándar y los procedimientos BSL-2. Utilizar células derivadas de HEK293T para la transfección y generación de virus pseudotipados. En este método, las células se transfectan en placas de 6 pozos tratadas con cultivo celular. La solución stock del PEI se prepara tal como se describió previamente por Yang y sus colaboradores (2017)¹². Antes de proceder a realizar la triple transfección para generar el pseudovirus, se recomienda optimizar la mejor proporción de ADN por plásmido de PEI para asegurar una alta eficiencia de transfección (superior al 70-80%). Esta optimización debe realizarse mediante la transfección de un plásmido que expresa una proteína fluorescente verde (GFP) y luego comprobando la proporción de células fluorescentes utilizando un microscopio de fluorescencia. Para esta optimización, mantener el ADN plasmídico constante en 2,5 μg por pozo y analizar varias cantidades de PEI, en el rango de 1-20 μL. Estas son las mejores condiciones para estos lotes de células y PEI, que consisten en 5 μL de solución de stock de PEI (1 mg/mL) y 2,5 μg de plásmidos que expresan GFP por pozo en una placa de 6 pozos.

1. Sembrar 7,5 x¹⁰ 5 células derivadas de HEK293 por pozo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pozos, en un volumen total de 2 mL por pozo de medio completo (DMEM-C: Medio Modificado de Águila de Dulbecco suplementado con suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 10%, 20 mM de ácido bovino 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanolsulfónico (HEPES), 100 UI/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) 24 horas antes de la transfección.
   NOTA: Al sembrar células, evita mover la placa de cultivo en movimientos circulares, ya que esto puede causar agregación celular en el centro de los pozos, resultando en una distribución celular irregular y, en consecuencia, en menor eficiencia de transfección. Una placa de 6 pozos es suficiente para un experimento, incluyendo un pozo como control celular (no transfectado), y el resto de la placa para analizar varias proporciones de ADN de plásmidos PEI.
2. Incubar las células a 37 °C con un 5% de CO₂ durante la noche. Al día siguiente, asegúrate de que las células estén aproximadamente en un 50-60% confluentes.
3. El día de la transfección, preparar los complejos de ADN del plásmido PEI en tubos microcentrífugas estériles de 1,5 mL.
   1. Para cada pozo, preparar un tubo de solución PEI que contenga 5 μL de material PEI (1 mg/mL) en 50 μL de medio sérico reducido, y un tubo de solución de ADN que contenga 2,5 μg del plásmido que expresa GFP, en 50 μL del mismo medio.
   2. Si se van a transfectar varios pozos, las soluciones pueden escalarse en consecuencia. Mezcla cada tubo brevemente con el vórtice y gira hacia abajo durante 5 segundos. Incuba los tubos a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos.
4. Durante esta incubación, retira cuidadosamente el medio de cada pozo de la placa de 6 pozos, evitando la interrupción de la monocapa celular. Sustituye cuidadosamente con 1 mL/pozo de medio de transfección completo (DMEM-T, igual que DMEM-C, pero sin antibióticos).
5. Prepara el complejo de transfección. Tras la incubación de 10 minutos, añade los 50 μl del tubo de solución de ADN al tubo de solución PEI. Mezcla rápido pipeteando arriba y abajo seis veces y incuba en RT exactamente 3 minutos. Inmediatamente procede a añadir el complejo en sentido gota a las células de cada pozo correspondiente.
6. Sella los bordes de la placa con parafilm y centrifugadora a 1.000 x g durante 30 minutos en RT, sin freno, usando un rotor oscilante y un cubo de placa.
7. Tras la centrifugación, retira el parafilm suavemente e incuba la placa a 37 °C, 5% de CO₂ durante 3 horas.
8. Tras la incubación, retira suavemente el medio de transfección de cada pozo y reemplácialo lentamente por 2 mL de DMEM-C precalentado por pozo.
9. Incubar las células transfectadas a 37 °C con un 5% de CO₂ durante 48 horas.
10. Evaluar la eficiencia de la transfección mediante expresión de GFP utilizando microscopía de fluorescencia. La frecuencia de las células fluorescentes debe ser superior al 70-80% (Figura 1). Esto es fundamental para la eficiencia del siguiente método en la sección 2.

2. Generación de partículas pseudovirales pseudotipadas con pico y VSV-G por SARS-CoV-2

NOTA: Este método utiliza el mismo procedimiento que la sección 1, excepto que en lugar de usar el plásmido GFP, las células serán co-transfectadas con los tres plásmidos necesarios para generar virus pseudotipados, utilizando las condiciones óptimas de transfección para asegurar una alta eficiencia de transfección. El protocolo también utiliza células derivadas de HEK293T en placas de 6 pozos, suficientes para las siguientes tres condiciones requeridas: a) células no transfectadas (un pozo), b) células transfectadas solo con el plásmido de empaquetado MLV y el vector de transferencia de reporte luciferasa (un pozo; pseudovirus sin picos) y c) células transfectadas con estos dos plásmidos y el plásmido que expresa picos para generar virus pseudotipados SARS-CoV-2 (cuatro pozos). El plásmido que expresa el pico utilizado aquí codifica el spike de la cepa de Wuhan de SARS-CoV-2, y contiene modificaciones de secuencia para permitir una presentación eficiente de la proteína en PVs. El pseudovirus sin picos será necesario como control más adelante durante las infecciones, para validar la entrada dependiente del pico en células permisivas. De manera similar, los VSV-G-PV se generan utilizando el mismo diseño experimental para ser utilizados posteriormente como contracribado de posibles compuestos inhibitorios. Si se requiere un mayor volumen de pseudovirus, el protocolo puede escalarse hasta dos placas de 6 pozos, lo que también puede ser práctico para el paso de centrifugación de placas.

1. El día antes de la transfección, semilla las células derivadas de HEK293T en dos placas de 6 pozos, como se describe en la sección 1. Utiliza una placa para la generación de picos de PV y la otra para los VSV-G-PV.
2. El día de la transfección, prepara las mezclas de transfección como se muestra en la Tabla 1, siguiendo el paso 1.3.
   NOTA: La solución PEI se prepara como se informó^{previamente 12}. Los plásmidos pCMV-MLVgagpol y pTG-Luc se obtuvieron de Millet y Whittaker⁸. El plásmido pVSV-G se obtuvo de Gee et al 2020¹³. Todos los plásmidos deben prepararse con antelación como preparaciones de alta calidad, libres de endotoxinas. Se recomienda utilizar kits de maxiprep disponibles comercialmente, con un paso final de filtración estéril mediante un filtro de jeringuilla de baja unión y 0,2 μm.
3. Mezcla cada tubo como se describe en la sección 1 e incuba en RT durante 10 minutos.
4. Durante esta incubación, retirar cuidadosamente el medio de cada pozo de las placas de 6 pozos, evitando la interrupción de la monocapa celular. Sustituye poco a poco por 1 mL de medio DMEM-T precalentado en cada pozo, asegurando que el medio descorra por la pared del pozo y no directamente sobre las celdas.
5. Preparar los complejos de transfección tal y como se describe en la sección 1 y transfectar las células usando el protocolo previamente dado.
6. Tras la incubación de 48 horas post-transfección, recoge los sobrenacionantes, transfiere a tubos centrífugos cónicos estériles de 50 mL y centrifuga a 290 x g durante 7 minutos a 4 °C. Recoge el sobrenadante libre de células y filtrarlo usando una unidad de filtro estéril de botella de 0,45 μm con fluoruro de polivinilifeno (PVDF). Prepara alicotas de 1 mL y guárdalas a -80 °C.
   NOTA: Las partículas pseudotipadas permanecen estables a -80 °C durante varios meses. Evita ciclos repetidos de congelación y descongelación para preservar la contagiosidad.

	Para picos PV de SARS-CoV-2 (por pozo)	Para VSV-G-PVs (por pozo)	Para PVs sin picos (por pozo)
Solución para PEI:
PEI (1 mg/ml)1	5 μL	5 μL	5 μL
Medio sérico reducido	45 μL	45 μL	45 μL
Solución de ADN plasmídico:2
pCMV-MLVgagpol	0,79 μg	0,79 μg	0,79 μg
pTG-luc	0,92 μg	0,92 μg	0,92 μg
Puno1-spike	0,79 μg	-	-
pVSV-G	-	0,79 μg	-
Medio sérico reducido	a 50 μL	a 50 μL	A 50 μL

Tabla 1: Preparación de mezclas de transfección para la generación de PVs.

3. Titulación de partículas pseudotipadas SARS-CoV-2 y VSV-G

NOTA: Este paso es esencial para confirmar que las partículas pseudotipadas producidas son infecciosas y para determinar el volumen efectivo mínimo requerido para aplicaciones posteriores como el cribado de compuestos. La titulación debería realizarse para cada nuevo lote de pseudovirus. Para ello, las células altamente susceptibles a la infección por SARS-CoV-2 (células HSI) se infectan con cantidades decrecientes de los virus pseudotipados. La entrada de los pseudovirus, mediada por la interacción pico-humano ACE2, o por VSV-G con otros receptores celulares, se monitoriza 72 horas después mediante la detección de la actividad luciferasa en un ensayo de luminiscencia.

1. El día antes de la transducción, sembrar 2,5 x 10⁴ células HSI por pozo en una placa de cultivo tisular de 96 pozos, en 50 μL de medio completo (DMEM-C). Preparar tres pozos para cada cantidad de pseudovirus a probar, e incluir pozos para infección, también con pseudovirus sin picos y para células no infectadas. Incubar la placa a 37 °C con un 5% de CO₂ durante la noche.
2. El día de la transducción, descongela una alicuota de cada lote de pseudovirus para probarlo sobre hielo y mezclarlo suavemente por inversión. Incluye también una alitería del control sin picos. Añade directamente a cada pozo varias cantidades de la preparación del pseudovirus (100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5 y 0,8 μL). Ajusta los volúmenes de todos los pozos a 150 μL con DMEM-C.
3. Sella la placa con parafilm y centrífuga a 2.500 × g durante 45 minutos en RT, sin freno.
4. Retirar el sello de parafilm e incubar la placa durante 72 horas a 37 °C, 5% de CO₂.
5. Tras la incubación, prepárese para el ensayo de luciferasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Descongelan el sustrato de luciferasa (almacenado a -80 °C) y 5x tampón de lisis para el ensayo luciferasa (almacenado a -20 °C) y se equilibran en RT (10-15 min).
6. Diluye el tampón de lisis del ensayo de luciferasa a 1x con agua estéril. Prepara al menos 3 mL.
7. Aspira y elimina lenta y cuidadosamente el sobrenadante de cada pozo usando una pipeta multicanal.
8. Añade 30 μL de 1x buffer de lisis a cada pozo usando una pipeta multicanal. Coloque la placa en un agitador de placas durante 10 minutos a 150 rpm, en RT. Verifique la lisis completa bajo un microscopio invertido (todas las células deben estar lisadas y no distinguibles al examinar visualmente).
   NOTA: Prepara el lector de microplacas con antelación para realizar la detección de luminiscencia inmediatamente después de añadir el sustrato, asegurando la consistencia y evitando la decaimiento de la señal.
9. Transfiere los lisados a una placa opaca blanca de 96 pozos.
10. Añade 50 μL de sustrato de luciferasa a cada pozo y mezcle brevemente moviendo la placa en un movimiento circular. Coloca la placa en el luminómetro y mide la luminiscencia.
11. Analiza los datos obtenidos.
    1. Verifica que los controles proporcionen los valores de luminiscencia esperados. Asegúrese de que las células no infectadas proporcionen valores de luminiscencia de fondo muy bajos.
       NOTA: Las células infectadas con pseudovirus sin picos deben dar valores a nivel de células no infectadas, y las células infectadas con cantidades decrecientes de pseudovirus presentador de picos deben mostrar valores altos de luminiscencia dependientes de la dosis (Figura 2). Los valores de luminiscencia generados por los VSV-G-PV suelen ser mucho más altos que los de los SPIKE-PV, aproximadamente uno o dos órdenes de magnitud.
    2. Para los cribados posteriores, selecciona la cantidad de pseudovirus que genere una señal al menos cien a mil veces la de las células no infectadas.

4. Cribado de compuestos para inhibición de entrada pseudoviral usando SPIKE-PVs

1. Semillar 2,5 x 10⁴ celdas HSI por pozo en 50 μL de medio completo (DMEM-C) en una placa de 96 pozos, como se describe en la sección 3. Incubar durante la noche a 37 °C, 5% de CO₂.
   1. Consideremos un diseño de placas que incluye las columnas 1 a 11 para compuestos más pseudovirus, y la columna 12 para los controles. En la columna 12, asignar cuatro pozos para el control del virus (solo pseudovirus) y cuatro pozos para células no infectadas y no tratadas.
2. Al día siguiente, preparar diluciones seriadas (1:3) de compuestos a analizar, comenzando en 50 μM (concentraciones finales durante las infecciones: 50, 16,6, 5,5, 1,8, 0,6, 0,2 y 0,06 μM), en DMEM-C que contienen 0,5% de DMSO.
   1. Por comodidad, preparar las diluciones en una "placa de dilución" separada de 96 pozos, donde primero se realizan las diluciones en serie y luego se transfieren (50 μL) a la placa que contiene las celdas.
   2. Si el número de compuestos es muy grande, del orden de cientos o más, reduce esta primera serie de dilución a unos 4 puntos, usando un solo pozo por punto de dilución, y considera una pre-cribada. Luego, se vuelven a probar los impactos potenciales usando diluciones seriales de 7 puntos, 1:3, con tres réplicas, comenzando con la misma concentración de 50 μM.
3. Una vez que las diluciones de compuestos estén listas, aspirar suavemente el medio de las células usando una pipeta multicanal y añadir 50 μL de diluciones de compuestos a los pozos correspondientes. Incubar durante 1 hora a 37 °C, 5% de CO₂. Para los controles de la columna 12, añadir solo DMEM-C.
4. Sin eliminar los compuestos, se añade a cada pozo la cantidad predeterminada de pseudovirus SARS-CoV-2 pseudotipado, en un volumen de 50 μL de medio completo, conteniendo los compuestos a las mismas concentraciones. Sella las placas con parafilm.
5. Centrifugar la placa a 2.500 × g durante 45 minutos en temperatura recreativa sin freno, luego retirar la parapelícula e incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 72 horas.
6. Proceder con la cuantificación de la infectividad basada en luciferasa como se describe en la sección 3.
7. Realizar análisis de datos.
   1. Exporta los valores de luminiscencia a una hoja de cálculo para formatear los datos y luego importarlos en software de análisis y gráficos de datos.
   2. Prepara gráficos de barras que representen la media de cada punto de concentración, incluyendo el error estándar de las barras medias. Grafica también los valores obtenidos de controles positivos (PVs solos) y negativos (células no infectadas).
      NOTA: Los resultados del ensayo se consideran válidos si 1) las células no infectadas muestran valores muy bajos, 2) los controles PV muestran valores altos, 3) el control positivo de la inhibición (es decir, arbidol o hACE2-Fc) muestra inhibición de la infección, de manera dependiente de la dosis (Figuras 3A, B).
   3. Luego, observa los valores producidos por compuestos desconocidos para evaluar si existe inhibición y si existe un efecto dependiente de la dosis. Si es así, entonces someten estos compuestos a análisis confirmatorios adicionales.
      NOTA: Para confirmar más posibles impactos, siga los siguientes pasos. Primero, vuelve a probar los compuestos potenciales de impacto como se sugiere en el paso 4.2. Si se confirma el efecto respuesta a la dosis, se realiza un contracribado usando la misma serie de dilución pero infectando con los VSV-G-PVs. Esta prueba es importante para comprobar si la inhibición de entrada es específica para la interacción pico-ACE2, y no se debe a interferencias en ningún otro paso posterior durante la producción de la luciferasa en las células infectadas (Figuras 3A, B). Aquí, el compuesto positivo no debe mostrar actividad inhibitoria contra los VSV-G-PV. Si este es el caso, entonces la misma serie de concentraciones debe evaluarse para detectar citotoxicidad mediante un ensayo de viabilidad celular (ensayo MTT, mostrado en la sección 5). En resumen, un compuesto potencial de impacto debería mostrar inhibición de SARS-CoV-2-spik-PVs, y ninguna o menor inhibición de VSV-G-PVs, y no, o al menos una inhibición mucho más débil de la viabilidad de las células. Ajustar una curva dosis-respuesta utilizando los datos de luminiscencia permitirá estimar la concentración inhibitoria media máxima (IC₅₀) para la inhibición de los PVs, y una concentración citotóxica media máxima (CC₅₀) a partir del ensayo de viabilidad. La relación CC₅₀ / IC₅₀ se utiliza para calcular el índice de selectividad (SI), que es un indicador importante de la posible utilidad del compuesto positivo. Para el análisis de las curvas dosis-respuesta y la estimación de IC₅₀ y CC₅₀ se han descrito procedimientos muy^{detallados 14}.

5. Ensayo de viabilidad celular basado en MTT

1. Semilla 2,5 x 10⁴ celdas HSI por pozo en 50 μL de DMEM-C en una placa de 96 pozos. Incubar la placa durante la noche a 37 °C, 5% de CO₂. Asegúrate de que las células estén en torno al 50% de confluencia al día siguiente. Preparar suficientes pozos, considerando todas las diferentes concentraciones del compuesto a evaluar, células sin tratar y pozos en blanco que contienen solo medio, en triplicado. Analizar los compuestos potenciales de impacto en las mismas concentraciones evaluadas en el ensayo de inhibición de entrada PV.
2. Tras la incubación, retirar cuidadosamente el medio y sustituirlo por 100 μL de medio completo que contenga diferentes concentraciones del compuesto para evaluar, en un 0,5% de DMSO.
3. Centrifugar la placa a 2.500 × g durante 45 minutos en RT sin freno e incubar durante 72 horas a 37 °C, 5% de CO₂. Este paso se incluye para manejar las celdas exactamente como se hizo en la sección anterior, excepto por la adición de los PVs.
4. Prepara una solución de MTT de 0,5 mg/mL usando DMEM. Esteriliza filtrando a 0,2 μm y mantenlo a oscuras.
   NOTA: El bromuro 3-(4,5-Dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT) es sensible a la luz. Debe mantenerse congelado, en la oscuridad.
5. Retira cuidadosamente el medio de cada pozo y reemplázalo por 100 μL de solución MTT. Incubar durante 2 horas a 37 °C, 5% de CO₂.
6. Durante esta incubación, preparar una solución de solubilización que contenga 40 mM de HCl en alcohol isopropílico.
7. Retira cuidadosamente la solución MTT usando una pipeta multicanal, sin alterar los cristales de formazan en el fondo de cada pozo.
8. Añade 100 μL de la solución de solubilización a cada pozo. Envuelve el plato en papel de aluminio y colócalo sobre un agitador de platos a 150 rpm durante 15 minutos.
9. Registrar la absorbancia a 570 nm y 630 nm.
10. Realizar análisis de datos.
    1. Utilizando los valores brutos de densidad óptica, se restan los valores obtenidos a 630 nm de los obtenidos a 570 nm para cada pozo. Luego promediamos los valores corregidos de los pozos de células sin tratar. Considera estas células sin tratar como 100% viables.
    2. Luego normaliza los valores de las células tratadas frente a los pozos de las células no tratadas, usando la fórmula:
       Viabilidad (%) =
11. Grafica los porcentajes de viabilidad como barras que representan la media de réplicas ±± error estándar de la media. Realizar análisis estadísticos adicionales para comparar grupos utilizando procedimientos implementados en un software de análisis de datos y gráficos que comparan viabilidades en diferentes concentraciones con el control de células no tratadas.
12. Comparar las medias de cada punto de concentración con las de las células tratadas solo con DMSO usando Kruskal-Wallis no paramétrico con el post-test de Dunn (las diferencias se consideran significativas a valores p < 0,05). Para trazar una curva dosis-respuesta y estimar el CC₅₀ a partir de los valores OD, comprueba el procedimiento reportado en^{otros 14}.

Resultados

Se ha reportado que varios métodos de transfección generan PVs, incluyendo fosfato de^{calcio 15}, métodos basados en^{lípidos 16} y PEI, tanto lineales como ramificados. Este artículo muestra que la transfección de células derivadas de HEK293T con PEI ramificado permite una transfección de alta eficiencia (Figura 1), normalmente comparable a métodos de transfección que utilizan agentes transfectores basados en lípid...

Discusión

Esta versatilidad del sistema MLV para generar seudótipos para otros virus ha sido reportada por otros virus importantes, como el virus del^{Ébola 18}, MERS-CoV⁸, SARS-CoV¹⁹, el virus La^{Crosse 20}, el Hantavirus²⁰, el virus^{Visna 21}, el Arenavirus²², el virus de la^{gripe 23} y otros. Estos pseudrótipos han...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.2 & micro; m Filtros de jeringuilla de baja unión a proteínas	Termo Científica	720-1320	Filtros de jeringuilla (0.2 y mu; m,13 mm, PES, estéril)
Solución 1X de tripsina-EDTA al 0,25%	Gibco	25200-056	Tripsina-EDTA (0,25%), fenol rojo
0,45 & micro; m Unidades de Filtro de Botella PVDF	Avantor	514-1045	Sistemas de filtración al vacío con tapa de botella (PVDF, 250 ml, 50 mm, 0,45 y micro; m)
Tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	30123611	Caja fuerte-cerradura  Tubos
Solución 100 X de penicilina Estreptomicina	Corning	30-002-CI	Solución de penicilina-estreptomicina, 100x
5 búfer de lisis del ensayo de luciferasa	Promega	E2650	parte del Sistema de Ensayo de Luciferasa Promega Bright-Glo
Tubos cónicos estériles de 50 mL	Corning	352070	Tubo centrífugo PP de alta claridad de 50 mL, fondo cónico, estéril
Placas de cultivo de tejidos de 6 pozos	Termo Científica	140675	Multiplatos tratados con cultura celular
Placas de cultivo de tejidos de 96 pozos	Termo Científica	168055	Nunc™ Micropozo y comercio; 96-Pozo, Nunclon Delta, Microplaca de fondo plano
Clorhidrato de arbidol	Sigma-Aldrich	SML0860
Polietilenimina ramificada, 25 kDa	Sigma-Aldrich	408727
Microscopio láser confocal   (FV 3000)	Olympus Co.	SKU: FV3000
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco) con: alta glucosa, L-glutamina, fenol rojo, piruvato sódico)	Gibco	11995-065
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	26140-079	Inactivado por calor (56&º; C, 30 min)
Células derivadas de HEK293T (Línea Celular Lenti-X 293T)	Biografía de Takara	632180	Subclon altamente transfectable de la línea celular HEK293 y apoya altos niveles de expresión proteica viral
HEPES Buffer	Gibco	15630-080
Células altamente susceptibles a la infección (293T-ACE2. TMPRSS2 (mCherry) Línea Celda)	Recursos de BEI	NR-55293	HEK293T línea celular modificada para expresar ACE2 y TMPRSS2
Ácido clorhídrico	Sigma-Aldrich	H1758-500ML
Microscopio de contraste de fase invertido	Olympus Co.	SKU: 2404040005
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516-500ML
Sustrato de luciferasa	Promega	E2650	parte del Sistema de Ensayo de Luciferasa de Glo Brillante
Lector de microplacas con detección de luminiscencia	Agilent BioTek	BTH1MG
MTT [bromuro 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium]	Sigma-Aldrich	M2128
Placas opacas blancas de 96 pozos	Corning	3917	Microplacas de poliestireno blanco plano de fondo sólido de 96 pozos tratados con TC
Parafilm	Bemis	PM999
plásmido pcDNA3-EGFP	Addgene	13031	pcDNA3-EGFP fue un regalo de Doug Golenbock (plásmido Addgene # 13031; http://n2t.net/addgene:13031 ; RRID:Addgene_13031)
plásmido pCMV-MLVgagpol	-	-	Donado amablemente por el Dr. Gary Whittaker
Solución salina con fosfato tamponado sin Ca2+ ni Mg2+ (PBS)	Corning	21-040-CV	Solución salina tamponada con fosfato, 1X sin calcio ni magnesio
Sistema de plásmidos Promega PureYield Maxiprep	Promega	A2393
Plásmido pTG-Luc	-	-	Donado amablemente por el Dr. Gary Whittaker
Plásmido pústico pUNO1-SARS-CoV-2 (Wuhan)	Invivogen	P1-Spike
Plásmido pVSV-G	Addgene	138479	pVSV-G fue un regalo de Akitsu Hotta (plásmido de Addgene # 138479 ; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID:Addgene_138479)
Proteína de fusión humana recombinante ACE2-Fc	Invivogen	FC-HACE2
Medio sérico reducido (Opti-MEM)	Gibco	31985-070	Medio sérico reducido Opti-MEM