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Artículo de método

Investigación de la glucólisis en la microglía primaria mediante ensayo de flujo extracelular

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DOI:

10.3791/69638

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10 de abril de 2026

 , 
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University of Newfoundland

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe una forma rentable de realizar una prueba de esfuerzo de glucólisis para cuantificar la reprogramación metabólica en microglías primarias del ratón. Tras el aislamiento y la estimulación inflamatoria, se mide la tasa de acidificación extracelular (ECAR) utilizando reactivos recién preparados y ajustados con pH, seguida de la normalización de proteínas para permitir una evaluación precisa y reproducible de los desplazamientos glicolíticos.

Resumen

Las microglías, las células macrófagas residentes del sistema nervioso central, alteran dinámicamente sus programas metabólicos en respuesta a señales fisiológicas y patológicas. Comprender estos cambios metabólicos es crucial para esclarecer su papel en la inflamación. Aquí presentamos un protocolo detallado para evaluar el perfil glucolítico de la microglía primaria aislada de las cortezas cerebrales neonatales de ratón mediante una prueba de esfuerzo de glucólisis en un analizador de flujo extracelular. Este ensayo permite la medición en tiempo real de la ECAR, un indicador de la actividad glucolítica asociada a un pH bajo, como el lactato. Nuestro enfoque consiste en tratar microglía cultivada bajo diferentes condiciones para examinar cómo se alteran las vías metabólicas en respuesta a diversos estímulos, incluidos los proinflamatorios. De forma única, nuestro laboratorio prepara soluciones frescas de diferentes reactivos, incluyendo glucosa, oligomicina y 2-desoxiglucosa (2DG), para abordar los distintos aspectos de la vía, ajustando cuidadosamente el pH para cada reactivo para asegurar la precisión experimental y la reproducibilidad. Este método proporciona una plataforma sólida para investigar la glucólisis en la microglía primaria y ofrece información sobre sus estados funcionales bajo condiciones inflamatorias o relacionadas con enfermedades.

Introducción

Las células del sistema nervioso central cambian la forma en que producen energía en respuesta a condiciones normales y de enfermedad 1,2. Entre las principales vías metabólicas, la glucólisis y la fosforilación oxidativa (OXPHOS) son vías clave que regulan las funciones de las células inmunitarias: realizan una reacción robusta e inmediata a condiciones proinflamatorias e antiinflamatorias, respectivamente 3,4. Así, las células inmunitarias pueden cambiar entre vías metabólicas en respuesta a señales inflamatorias y estadosfuncionales 5. Las microglías, al igual que sus contrapartes mieloides, están metabólicamente ligadas a sus funciones y se adaptan rápidamente a diferentes vías como un combustible metabólico alternativo, demostrando flexibilidadmetabólica 6,7. La microglía sufre una rápida reprogramación metabólica durante la inflamación, con una glucólisis aumentada que sirve como una firma metabólica clave de los estadosproinflamatorios. Así, los ensayos que identifican la dependencia celular de un fenotipo metabólico nos permiten investigar sus estados funcionales bajo diversas condiciones. En el protocolo actual, nuestro objetivo es determinar si la microglía primaria depende de un aumento de la glucólisis durante condiciones proinflamatorias. Para ello, realizamos pruebas de esfuerzo de glucólisis de forma rutinaria. Aunque el analizador Seahorse XFe24 (analizador de flujo extracelular) se ha utilizado ampliamente para medir ECAR en líneas celulares inmortalizadas y células transformadas, la microglía primaria presenta desafíos técnicos únicos, incluyendo rendimientos celulares limitados, propiedades de adherencia variables y alta sensibilidad a condiciones de cultivo, lo que puede complicar las mediciones metabólicas. Además, proporciona una medición en tiempo real de la ECAR, permitiendo una evaluación precisa de la glucólisis impulsada por el lactato en múltiples momentos, que no puede ser capturada solo por ensayos finales de lactato. El perfil metabólico basado en flujo extracelular se ha adoptado ampliamente en la investigación metabólica para caracterizar la bioenergética celular, lo que hace que este protocolo sea muy adecuado para estudios que investigan cambios metabólicos en células durante la activación, modelado de enfermedades o pruebas de fármacos. Los lectores pueden determinar la idoneidad en función de su necesidad de mediciones glicolíticas dinámicas y de alta resolución dentro de las células primarias.

La glucosa se metaboliza en piruvato mediante glucólisis y luego se convierte en lactato en el citoplasma o en CO₂ y agua en las mitocondrias. La conversión de glucosa en lactato conduce a la liberación de protones en el espacio extracelular, lo que provoca la acidificación del medio de la superficie. El analizador de flujo extracelular cuantifica esta acidificación como el ECAR9. En la prueba de esfuerzo de glucólisis, las células se incuban primero en un medio libre de glucosa y piruvato, y se registra su ECAR basal. La primera inyección suministra una cantidad saturante de glucosa, que las células metabolizan mediante glucólisis para piruvato, produciendo ATP, NADH, agua y protones. El aumento de la liberación de protones eleva la ECAR, reflejando la 'glucólisis'. A continuación, se añade oligomicina para inhibir la síntesis de ATP mitocondrial, obligando a las células a depender únicamente de la glucólisis. Este cambio en el gradiente de protones aumenta aún más la ECAR y se mide como la capacidad máxima glicolítica de la célula. Finalmente, se introduce la 2DG, un análogo de la glucosa. Inhibe competitivamente la hexoquinasa, bloqueando la glucólisis y reduciendo la ECAR. Esta caída confirma que la ECAR previa era dependiente de la glucólisis. La diferencia entre la capacidad máxima glicolítica y el nivel de glucólisis define la reserva glicolítica. La ECAR inicial antes de la adición de glucosa representa la acidificación no glicolítica de otros procesos celulares (Figura 1).

Realizamos una prueba de esfuerzo de glucólisis utilizando el analizador de flujo extracelular. Los valores ECAR en bruto se exportaban a Excel para su análisis. Para cada condición, identificamos los puntos temporales correspondientes a la ECAR basal (antes de la adición de glucosa), la glucólisis (después de la inyección de glucosa) y la capacidad glucolítica (después del tratamiento con oligomicina). Los valores de ECAR de los puntos temporales relevantes dentro de cada fase y entre las cuatro réplicas técnicas se promediaron, y la glucólisis se calculó como el aumento de la ECAR tras la adición de glucosa. La capacidad glicolítica se calculó como un aumento de la ECAR tras la adición de oligomicina. La reserva glicolítica se calculó como una disminución de la ECAR tras la inyección de 2DG. Estos valores promedio se utilizaron después para comparar respuestas metabólicas entre grupos.

Por otro lado, para evaluar la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y evaluar las funciones mitocondriales, la prueba de esfuerzo mitocondrial (Agilent) es el enfoque estándar, que mide parámetros como la respiración basal, la respiración ligada a ATP, la fuga de protones, la respiración máxima, la capacidad respiratoria sobrante y la respiración no mitocondrial. Estas mediciones se obtienen inyectando secuencialmente inhibidores mitocondriales específicos, oligomicina (inhibidor de ATP sintasa), FCCP (cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi)fenilhidrazona), un desacoplador que impulsa la respiración máxima, y rotenona/antimicina A (inhibidores complejos I/III), permitiendo una evaluación cuantitativa de la salud mitocondrial y bioenergética 10,11,12,13. Por tanto, los ensayos ECAR y OCR se realizan bajo condiciones diferentes.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal y recibieron la aprobación del Comité de Cuidado Animal de la Universidad Memorial de Terranova bajo el protocolo número 22-01-DK.

1. Preparativos antes del inicio de los experimentos

  1. Prepara la solución para la disección añadiendo 10 mM de HEPES a 1x HBSS sin Ca2+ y Mg2+.
  2. Prepara la solución digestiva (por 2–3 cerebros) combinando 1 mL de tripsina al 2,5% (10 veces la calza, sin diluir), 2 mL de disolución para disección y 200 μL de DNasa I (1 mg/mL).
  3. Prepara medio glial mixto suplementando DMEM con 10% FBS, 1x Glutamax y 1x antibiótico/antimicótico.
  4. Prepara el medio microglógico suplementando DMEM con 10% de FBS, 1x Glutamax, 1x NEAA de MEM, 1x piruvato de sodio y 1x penicilina/estreptomicina.

2. Enchapado para cultivos gliales mixtos (Figura 2A)

  1. En el día 1:
    1. Recoge crías postnatales de día (P0)-P2 de ratones C57BL/6C y extrae las cortezas con un microscopio estereoscópico y elimina las meninges. Luego, disecciona las cortezas en pequeños trozos en solución de disección y transfiere a un tubo cónico de 15 mL. Deja que los tejidos se asienten en la parte inferior del tubo.
    2. Decantar la solución de disección y sustituirla por 3 mL de solución digestiva por cada 2–3 cerebros. Tritura suavemente usando una pipeta serológica de 2 mL para disociar el tejido.
    3. Coloca los tubos sobre un rotor dentro de una incubadora a 37 °C y mezcla triturando con una pipeta serológica de 2 mL cada 8 minutos, para un total de unos 24 minutos.
    4. Tras la digestión del tejido, centrifuga las células a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT). Luego, descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en 5 mL de medios glíales mixtos.
    5. Utilizando una aguja de 18 g en una jeringuilla de 5 mL, triturar las células y luego pasarlas por un colador de celdas de nylon de 70 μm. Centrifuga de nuevo las pilas recogidas a 300 x g durante 5 minutos en RT.
    6. Resuspende el pellet en 1 mL de medios gliales mixtos inicialmente y tritura varias veces para eliminar el agrupamiento celular, y luego vuelve a suspender en un volumen mayor, llegando a obtener hasta 12 mL en cada matraz T75 (se recomienda 2–3 cortezas cerebrales por matraz)
      NOTA: No es necesario recubrir el matraz con poli-D-Lisina u otro reactivo.
  2. El día 2, cambia todo el medio y añade medios glólicos mixtos frescos.
  3. El día 3, sustituye aproximadamente dostercios del medio por medio glólico mixto fresco. Deja que las células crezcan durante siete días adicionales, para un total de 10 días.
    NOTA: En este punto, se puede observar una capa de astrocitos.
  4. En el día 6, reemplaza dos tercios del medio por medios glíales mixtos frescos. Confirma la presencia de una capa confluente de astrocitos.

3. Obtención de microglía primaria pura (Figura 2A)

NOTA: Alrededor del día 10, se pueden ver pequeñas células redondas flotando sobre la capa de astrocitos; estas son predominantemente microglía (Figura 2B).

  1. Sacude el frasco a 250 rpm durante 2 horas a 37 °C. Recoge todo el medio que contiene las celdas flotantes en un tubo cónico de 15 mL y centrifuga a 300 x g durante 10 minutos.
  2. Resuspende el pellet en medios microglóricos y coloca alrededor de 250.000 células por pozo en las microplacas de cultivo celular del analizador de flujo extracelular.
    NOTA: Se obtienen alrededor de 3–4 millones de células por mL de tres frascos de T75; no es necesario recubrir las placas de cultivo celular con poli-D-lisina u otros reactivos.
  3. Incuba la microplaca al 5% deCO2 durante 30–45 minutos. Después de eso, cambia de nuevo el medio para obtener un cultivo puro de microglía y eliminar cualquier oligodendrócito que aún pueda estar flotando. Las células están listas para el tratamiento al día siguiente (Figura 2C).
  4. Excluya los cuatro pozos designados como controles de 'fondo' de la siembra de celdas: uno en cada fila (Figura 3C). Estos pozos reciben medios para ensayo.
    NOTA: Llenar los pozos no utilizados con agua estéril o PBS para evitar la evaporación del medio, y placar las células en un patrón aleatorio en lugar de en filas o columnas fijas para minimizar la variabilidad basada en placas.

4. Tratamiento de la microglía primaria con estímulos proinflamatorios

  1. En el día 11, trata las células con 100 ng/mL de lipopolisacárido (LPS) durante 24 horas. Aleatoriza los pozos de control y tratados con LPS para descartar cualquier efecto posicional.
    NOTA: La duración del tratamiento puede variar según las condiciones experimentales y necesitar optimización previa.

5. Preparación para el ensayo de flujo extracelular un día antes de realizar el experimento

  1. En el día 11, añade 1 mL de tampón calibrante a la placa de calibración (formato de 24 pozos; kit de ensayo de flujo extracelular) en todos los pozos. Deja la placa durante la noche a 37 °C sinCO2.
    NOTA: La placa de calibración consta de 4 pozos de inyección. Para la prueba de esfuerzo de glucólisis, se añade glucosa al puerto A, la oligomicina al puerto B y se inyecta 2DG en el puerto C (véase la Figura 4A).
  2. Prepara soluciones de glucosa y 2DG
    1. Glucosa – Disuelva 90 mg de glucosa en 2 mL de medios extracelulares de ensayo de flujo (Tabla de materiales). Inicialmente, disuelve en aproximadamente 1,9 mL para que, cuando el pH se ajuste al día siguiente con 1N NaOH, el volumen final no supere los 2 mL, lo cual es fundamental para mantener la molaridad.
    2. 2DG – Disolver 328 mg en 2 mL de medio de ensayo de flujo extracelular.
      NOTA: Conserva tanto la glucosa como la 2DG a 4 °C durante la noche
  3. Apói 30-40 mL de medio de ensayo en un tubo cónico de 50 mL y guarda a 4 °C para realizar los ensayos al día siguiente.

6. Ensayo de flujo extracelular (día 12)

  1. En el día 12, calienta la glucosa preconstituida, la 2DG y el medio de ensayo alicitado a 37 °C. Ajusta el pH de la glucosa y la 2DG, así como el del medio de ensayo alicotado, a 7,4 añadiendo 1N NaOH en incrementos (por ejemplo, 5 μL y luego 10 μL).
  2. Vórtice brevemente para una mezcla uniforme hasta que el pH supere 7.
    NOTA: Se recomiendan tiras indicadoras de pH para un seguimiento del pH constante.
  3. Añadir 2 μL de solución de stock de oligomicina de 10 mM en 2 mL de medio de ensayo ajustado por pH.
    1. Preparación de solución de 10 mM de oligomicina: Reconstituir un vial de 10 mg de oligomicina en 1 mL de DMSO estéril, obteniendo una concentración de 10 mg/mL, y almacenarla a -80 °C hasta su uso adicional.
  4. Saca las células de la incubadora (del paso 4) y recoge el medio en tubos microcentrífugas de 1,5 mL y centrífuga a 300 x g durante 5 minutos.
  5. Recoge el sobrenadante (descarta el pellet para eliminar células y restos) y guárdalo a -80 °C para las mediciones de lactato, mencionado en el Paso 8.
  6. Lava las células con 1 mL de medio de ensayo ajustado con pH muy suavemente para evitar que se desprendan de las células.
  7. Desechar el medio de ensayo y añadir 500 μL de medio ajustado por pH e incubar a 37 °C (sinCO2) durante 45 minutos a 1 hora.
  8. Mientras tanto, añadir todos los inhibidores necesarios a la placa de calibración del analizador de flujo extracelular en sus respectivos puertos: 55 μL de glucosa al puerto A en la parte superior izquierda de todos los pozos, 60 μL de oligomicina en el puerto B en los pozos superior derecho y 65 μL de 2DG en el puerto C en los pozos inferiores izquierdos (incluidos los pozos de fondo) (véase la Figura 4A).
    NOTA: El aumento de volumen en cada paso es necesario para mantener la molaridad, ya que los volúmenes aumentan con la adición previa de glucosa y oligomicina.
  9. Después de añadir los inhibidores, realiza una prueba de esfuerzo de glucólisis utilizando el software Agilent Seahorse Wave (véase la Figura 3). Luego, ejecuta la placa de calibración cuando se le pida.
    NOTA: Quita la tapa superior de la placa y la cubierta rosa entre las placas antes de colocar la placa de calibración en la máquina. Durante este paso, se probarán los sensores de pH yO2 y se revisará el control de calidad.
  10. Una vez finalizada la calibración, la máquina solicitará descargar la placa de calibración y cargar la placa de cultivo.
    1. Paso I: Seleccionar plantilla de ensayo (Figura 3A)
      1. Abre el software Wave y, desde la sección de Plantillas , elige la plantilla de ensayo adecuada para el experimento.
      2. En este caso, selecciona "Prueba de Esfuerzo de Glicólisis XF" en el analizador de flujo extracelular.
    2. Paso II: Definir grupos y estrategias de inyección (Figura 3B)
      1. Ve a la pestaña de Definiciones de Grupos y crea grupos experimentales (por ejemplo, Antecedentes, Control y LPS).
      2. Define la Estrategia de Inyección seleccionando los compuestos a inyectar en cada puerto (por ejemplo, glucosa, oligomicina, 2DG para prueba de esfuerzo de glucólisis; estos ajustes están preestablecidos por el software por defecto, comprueba en consecuencia).
    3. Paso III: Asignar grupos al mapa de placas (Figura 3C)
      1. Abre la vista del Mapa de Placas y asigna pozos a cada grupo arrastrando los nombres de los grupos (por ejemplo, Fondo = negro, Control = verde, LPS = rojo) al diseño de la placa.
      2. Asegúrate de que los pozos en blanco/fondo estén designados para una normalización precisa.
    4. Paso IV: Configurar el protocolo (Figura 3D)
      1. En la pestaña Protocolo , programa los ciclos de medición y las inyecciones. La secuencia típica para la prueba de esfuerzo de glucólisis incluye acidificación no glucolítica, inyección de glucosa (puerto A) → mide la glucólisis, inyección de oligomicina (puerto B) → mide la capacidad glicolítica, inyección de 2-DG (puerto C) → mide la reserva glicolítica
      2. Define el número de ciclos de medición tras cada inyección y ajusta el tiempo (por ejemplo, 3 ciclos de mezcla de 3 minutos, espera de 2 minutos, medición durante 3 minutos).
        NOTA: Para nuestros experimentos, usamos la configuración predeterminada del software.
      3. Revisa el tiempo total del ensayo antes de ejecutar el ensayo.
    5. Paso V: Normalización (Figura 3E)
      1. Normaliza los datos con los valores de concentración de proteínas obtenidos mediante el ensayo de ácido bicincónico (BCA) dentro del software Wave utilizando la opción de normalización incorporada (por ejemplo, por contenido de proteínas, número de células u otros métodos disponibles). Las mediciones de concentración de proteínas se muestran en la Tabla 1.
        NOTA: El protocolo para aislar la proteína para el ensayo BCA tras la medición ECAR se describe en el siguiente Paso 7.

7. Recogida de celdas para cuantificación y normalización de datos

  1. Una vez completado el ensayo de flujo extracelular, se retira la placa de cultivo y procede inmediatamente a la extracción de proteínas o se almacena a -80 °C hasta que esté lista para la extracción proteica.
    NOTA: Los ensayos proteicos nos permiten normalizar valores entre diferentes condiciones de tratamiento (son uno de los métodos para normalizar los datos, no el único).
  2. Para aislamiento inmediato de proteínas, retirar el medio de ensayo de los pozos y lavar una vez con 500 μL de PBS RT (1x) (se recomienda un lavado suave con un solo lavado para minimizar la alteración de la monocapa celular).
  3. Para recoger las células que puedan desprenderse durante este proceso, centrifuga la placa una vez a 300 × g durante 5 minutos, descarta el PBS y vuelve a suspender el pellet resultante en el tampón RIPA para asegurar mediciones totales precisas de proteínas.
  4. Añade unos 75–100 μL de buffer RIPA a cada uno de los pozos y coloca la placa sobre un agitador (rotación baja-media) durante 30 minutos (RT). Luego, transfiere el contenido a un tubo microcentrífuga nuevo de 1,5 mL.
    NOTA: Triturar y mezclar bien dentro de los pozos antes de transferir el tampón RIPA al tubo microcentrífuga de 1,5 ml.
  5. Incuba el tubo de microcentrífuga en un rotador durante unos 30 minutos en RT para la correcta lisis de las células. Durante este tiempo, enfría previamente la centrífuga a 4 °C.
  6. Centrifuga el lisado celular a 16.000 x g durante 15 minutos a 4 °C. Desecha el pellet porque contendrá restos celulares.
  7. Recoge el sobrenadante para cuantificar proteínas usando el ensayo BCA (o cualquier otro método preferido). Procede inmediatamente o almacena los lisados tras retirar todo el medio de ensayo a -20 °C (para almacenamiento a corto plazo) o -80 °C (para almacenamiento a largo plazo).
  8. Al reiniciar tras almacenar las muestras a -20 °C o -80 °C, déjalas descongelar sobre hielo durante unos 20–30 minutos, hacer un breve vórtice/giro y continuar con el protocolo estándar BCA.
  9. Alternativamente, cuenta las células por pozo usando un hemocitómetro o mediante un citómetro de flujo e intégralo en las estrategias de normalización. En ese caso, añade unos 100–200 μL de tripsina (precalentada a 37 °C) inmediatamente después de completar el ensayo y retirar el medio de ensayo, e incubar a 37 °C durante 5 minutos. Recoge las células añadiendo entre 100 y 200 μL de 10% FBS para neutralizar los efectos de la tripsina.
    1. Centrifuga las células a 300 x g durante 5 minutos, retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en aproximadamente 1 mL de 10% FBS antes de contar con un hemocitómetro. Alternativamente, las células pueden fijarse con un 4% de PFA durante 15 minutos antes de proceder con el recuento celular basado en citometría de flujo.
      NOTA: Si se procede inmediatamente al conteo celular, no es necesario fijar con PFA.
  10. Normaliza los valores de ECAR con la concentración de proteínas del Paso 7.8 o los conteos celulares del Paso 7.9.1 en cada pozo usando el software Wave , como en el Paso 6.10.5.1. Los valores resultantes son los valores normalizados para el ensayo de prueba de esfuerzo de glucólisis.
  11. Genera los resultados y el gráfico usando la opción "Exportar" seguida de la opción "Graph Pad Prism" y "Hoja de Excel" para cada valor de punto de datos para cuantificación.
    NOTA: En la placa de cultivo celular, la elección de cuatro pozos en blanco designados es flexible y puede ser ajustada por el experimentador. La disposición predeterminada de los espacios en blanco se muestra en la Figura 3C.

8. Mediciones de lactato a partir de cultivos sobrenadadores

  1. Ir descongelando gradualmente las alicuotas sobrenadantes sobre hielo que se recogieron en el día 12 y almacenaron a −80 °C desde el Paso 6.5.
  2. Determinar las concentraciones de L-lactato utilizando el kit de ensayo de L-lactato en modo fluorométrico siguiendo el protocolo del fabricante.
    Nota: El modo fluorométrico es mucho más sensible que el ensayo colorimétrico.
  3. Preparar los estándares mediante dilución serial del patrón de lactato proporcionado para generar una curva de calibración que va de 0 a 0,1 nmol/pozo.
  4. Añade muestras y estándares a una microplaca transparente de 96 pozos en duplicado, luego añade la mezcla de reacción que contiene la mezcla de enzimas lactato y la sonda fluorescente a cada pozo.
  5. Incubar en tiempo real durante 30 minutos protegido de la luz. Mide la intensidad de fluorescencia usando un lector de microplacas de fluorescencia con longitudes de onda de excitación/emisión ajustadas a 535/587 nm.
  6. Calcular las concentraciones de lactato en muestras a partir de la curva estándar y expresarlas como pM. Los niveles de lactato de los supernadantes de microglía primaria no tratada (control) y tratada con LPS se presentan en la Tabla 2.

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Resultados

La prueba de esfuerzo extracelular basada en flujo mide con éxito el perfil glucolítico de la microglía primaria. El ensayo mide la glucólisis basal, es decir, la glucólisis tras la inyección de glucosa, la capacidad glucolítica tras la inyección de oligomicina y la inhibición de la glucólisis tras la inyección de 2DG. Para nuestro experimento, comparamos microglías primarias de control (no tratadas) y tratadas con LPS. Observamos ligeros cambios morfológicos entre la microglía controlad...

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Discusión

La respuesta microglial durante la neuroinflamación va acompañada de una profunda reprogramación metabólica que permite a estas células satisfacer las demandas energéticas y biosintéticas de su estado funcional. La prueba de esfuerzo extracelular basada en flujo de glucólisis ofrece un método sensible y en tiempo real para medir el flujo glicolítico, permitiéndonos analizar cómo la microglía primaria adapta su metabolismo bajo condiciones proinflamatorias. En este estudio, utilizamos mic...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflicto de intereses que declarar.

Agradecimientos

El trabajo se financia mediante una subvención de proyecto del CIHR a DKK. El RTI al Dr. Craig Moore para el analizador XFe24 del ensayo de caballito de mar es muy reconocido.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución 1M HEPESSigma AldrichH0887
1X HBSSGibco y nbsp;  14175-079
2,5% de tripsinaGibco y nbsp;  15090-046
2DGMillipore sigma D6134
Antibiótico/Antimicoóticos y nbsp;Gibco15240-062
D y ndash; (+)Glucosa, anhidro y nbsp;Termociencia   A16828.36
DMEMGibco  11965-092
DNasa IMillipore sigma 11284932001- Roche
FBSFisherbrandFB12999102
GlutamaxGibco y nbsp;  35050-061
Kit de L-LactatoAbcamAB65330
LPS Sigma Aldrich  L4391
MEM: NEAA Gibco y nbsp;  11140-050
Oligomicina AMillipore sigma 495455
Penicilina/EstreptomicinaGibco y nbsp;  15240-062
Tiras indicadoras de pHFisherbrand13-640-516
Seahorse XFe24Agilent TechnologiesN/ANombre genérico: Analizador de flujo extracelular
Microplacas de cultivo celular Seahorse 24 V7 PSCaballito de Mar Agilent100777-004Nombre genérico: Microplacas de cultivo celular de flujo extracelular
Ensayo de caballito de mar XF Calibrant buffer (pH 7,4)Agilent Seahorse & nbsp;  100840-000Nombre genérico: Buffer de calibración de flujo extracelular
Medio DMEM XF para ensayo de caballito de mar (pH 7,4)Agilent Seahorse & nbsp;    103575-100Nombre genérico: Medios de ensayo de flujo extracelular
Kit de ensayo de flujo extracelular para caballitos de marAgilent Seahorse & nbsp;102342-100Nombre genérico: Placa de calibración de flujo extracelular  
Piruvato de sodio y nbsp;Gibco y nbsp;  11360-070

Referencias

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