Inducción de ferroptosis en glioma por calceolarioside A mediante modulación de la vía PI3K/Akt/Nrf2

Resumen

Este estudio explora el potencial terapéutico de la Calceolariosida A en el glioma, demostrando su capacidad para inhibir la señalización PI3K/Akt y promover la degradación de Nrf2, induciendo así la ferroptosis y suprimiendo la progresión tumoral tanto in vitro como in vivo.

Resumen

Este protocolo demuestra el flujo de trabajo experimental utilizado para investigar los efectos de la Calceolarioside A (CaA) en la inducción y modulación de la ferroptosis de la vía fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)/Quinasa de la proteína B (Akt)/factor eritróide 2-relacionado (Nrf2) en modelos de glioma. Los procedimientos incluyen una serie de ensayos celulares en líneas de glioma humano U251 y U87 para evaluar la viabilidad, proliferación y quimiosensibilidad celular tras el tratamiento con CaA. Los cambios asociados a la ferroptosis se evalúan midiendo especies reactivas de oxígeno (ROS), glutatión (GSH), malondialdehído (MDA) y niveles de hierro lábilo, junto con la expresión de proteínas relacionadas con la ferroptosis como la peroxidasa de glutatión 4 (GPX4), la subunidad antitransportadora de cisteína/glutamato (xCT) y la ferritina a través de western blot. Para evaluar la afectación de las vías, el protocolo detalla ensayos basados en qRT-PCR, western blot e inmunoprecipitación para la expresión y ubiquitinación de Nrf2. Se incluyen experimentos de sobreexpresión de NRF2 para confirmar su papel en la regulación de la ferroptosis. El protocolo demuestra además el uso de un modelo de xenoinjerto para ratones, donde las células de U87 se implantan de forma subcutánea, seguidas de la administración intraperitoneal de CaA para evaluar el crecimiento y toxicidad tumoral in vivo. Se realiza un análisis histológico de los órganos principales para evaluar la seguridad sistémica. Además, el acoplamiento molecular se utiliza para predecir la unión directa entre CaA y la subunidad PI3K p110α (PIK3CA). En conjunto, estos procedimientos proporcionan un marco reproducible para examinar los mecanismos de la ferroptosis y la eficacia terapéutica de compuestos naturales en la investigación del glioma.

Introducción

Los gliomas, especialmente los glioblastomas de alto grado, representan una de las formas más letales de tumores cerebrales, caracterizadas por una rápida proliferación, resistencia al tratamiento y un pronóstico^{deficiente 1}. En los últimos años se han explorado diversos agentes antiglioma, incluyendo quimioterapias tradicionales como la temozolomida y una variedad de compuestos naturales como la^{curcumina 2}, resveratrol³ y galitaquina^{galato 4}. Estos agentes ejercen sus efectos a través de múltiples mecanismos, incluyendo la inducción de la ....

Protocolo

Cultivo celular y tratamiento
Las células neuronales murinas HT22 y las líneas celulares de glioma humano U87 y U251 se cultivaron en el Medio Águila Modificado de Dulbecco, suplementado con suero bovino fetal al 10% y 4 mM de L-glutamina, bajo condiciones humidificadas a 37 °C con un 5% de CO₂. Para agilizar la consistencia experimental, todos los tratamientos celulares fueron estandarizados y descritos aquí. Esta sección describe las condiciones específicas utilizadas en cada grupo de tratamiento y los ensayos posteriores correspondientes.

Tratamiento de CaA:
Las células HT22 se tra....

Resultados

Supresión de la proliferación y mayor quimiosensibilidad de las células U251 y U87 in vitro por CaA
La Figura 1A ilustra la estructura de CaA. Primero evaluamos los efectos citotóxicos de CaA utilizando un ensayo MTT en células neuronales murinas normales HT22 y en células de glioma humano U251 y U87. En comparación con las células no tratadas (0 μM CaA), el CaA tuvo un impacto mínimo en la viabilidad de las células HT22 a conce.......

Discusión

CaA exhibe un efecto antitumoral convincente en el glioblastoma al modular de forma única dos ejes críticos de supervivencia: la vía PI3K/Akt/mTOR y el mecanismo de defensa contra la ferroptosis Nrf2. La vía PI3K/Akt está frecuentemente hiperactivada en el glioblastoma multiforme (GBM, alterado en hasta ~88-90% de los casos) debido a la pérdida de PTEN o activación de RTK, lo que impulsa la proliferación y la resistencia a^{la terapia 26}. Sin embargo, atacar solo es.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agilent 2100 Bioanalyzer			sistema de electroforesis capilar
Annexin V-FITC Apoptosis Kit	Roche Diagnostics	11858777001	N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)			software de preparación para acoplamiento molecular (algoritmo de acoplamiento)
Calceolarioside A (CaA)	Sigma-Aldrich	SMB00246	N/A
Chem3D			software de modelado molecular
cDNA Synthesis Kit	Vazyme Biotech	R223	N/A
DCFH-DA	Sigma-Aldrich	D6883	N/A
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	N/A
DMSO	Merck	D8418	N/A
FerroOrange probe	Dojindo	F374	N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442	N/A
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAriaIII Flow Cytometry	Instrumento para analizar células teñidas con Annexin V
Fluorescence microscope	Olympus	IX73	Instrumento para observar la fluorescencia de FerroOrange y DCFH-DA
FTH1 antibody	Abcam	ab75973	AB_1310150
GAPDH antibody	Abcam	ab8245	AB_2107448
GLS antibody	Abcam	ab93434	AB_10563527
GPX4 antibody	Abcam	ab125066	AB_10972289
HT22 murine neuronal cell line	AddexBio	C0011008	CVCL_0321
jetPRIME transfection reagent	Polyplus-transfection	114-07	reactivo de transfección basado en polímeros
Keap1 antibody	Abcam	ab139729	AB_2732852
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	N/A
LigPlot+			herramienta de mapeo de interacciones 2D
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific		reactivo de transfección basado en lípidos
Liproxstatin-1	Selleck	S7699	N/A
MG132	Selleck	S2619	N/A
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	H1M	Instrumento para medir la absorbancia en el ensayo MTT (a 490 nm)
MTT	Sigma-Aldrich	M5655	N/A
NanoDrop			espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen
Nrf2 antibody	Abcam	ab62352	AB_945626
Nude BALB/c mice	Vital River, China	N/A	IMSR_CRL:028
OptiMeM reduced serum medium
PyMOL			software de visualización molecular
QuantStudio 5 Real-Time PCR System
SYBR Green Master Mix	Vazyme Biotech	Q711	N/A
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	N/A
U251 human glioma cell line	CLS Cell Lines Service	300385	CVCL_0021
U87 human glioma cell line	ATCC	HTB-14	CVCL_0022
Ubiquitin antibody	Abcam	ab7780	AB_306981
xCT/SLC7A11 antibody	Abcam	ab175186	AB_2715513