Inducción de ferroptosis en glioma por calceolarioside A mediante modulación de la vía PI3K/Akt/Nrf2

Resumen

Este estudio explora el potencial terapéutico de la Calceolariosida A en el glioma, demostrando su capacidad para inhibir la señalización PI3K/Akt y promover la degradación de Nrf2, induciendo así la ferroptosis y suprimiendo la progresión tumoral tanto in vitro como in vivo.

Resumen

Este protocolo demuestra el flujo de trabajo experimental utilizado para investigar los efectos de la Calceolarioside A (CaA) en la inducción y modulación de la ferroptosis de la vía fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)/Quinasa de la proteína B (Akt)/factor eritróide 2-relacionado (Nrf2) en modelos de glioma. Los procedimientos incluyen una serie de ensayos celulares en líneas de glioma humano U251 y U87 para evaluar la viabilidad, proliferación y quimiosensibilidad celular tras el tratamiento con CaA. Los cambios asociados a la ferroptosis se evalúan midiendo especies reactivas de oxígeno (ROS), glutatión (GSH), malondialdehído (MDA) y niveles de hierro lábilo, junto con la expresión de proteínas relacionadas con la ferroptosis como la peroxidasa de glutatión 4 (GPX4), la subunidad antitransportadora de cisteína/glutamato (xCT) y la ferritina a través de western blot. Para evaluar la afectación de las vías, el protocolo detalla ensayos basados en qRT-PCR, western blot e inmunoprecipitación para la expresión y ubiquitinación de Nrf2. Se incluyen experimentos de sobreexpresión de NRF2 para confirmar su papel en la regulación de la ferroptosis. El protocolo demuestra además el uso de un modelo de xenoinjerto para ratones, donde las células de U87 se implantan de forma subcutánea, seguidas de la administración intraperitoneal de CaA para evaluar el crecimiento y toxicidad tumoral in vivo. Se realiza un análisis histológico de los órganos principales para evaluar la seguridad sistémica. Además, el acoplamiento molecular se utiliza para predecir la unión directa entre CaA y la subunidad PI3K p110α (PIK3CA). En conjunto, estos procedimientos proporcionan un marco reproducible para examinar los mecanismos de la ferroptosis y la eficacia terapéutica de compuestos naturales en la investigación del glioma.

Introducción

Los gliomas, especialmente los glioblastomas de alto grado, representan una de las formas más letales de tumores cerebrales, caracterizadas por una rápida proliferación, resistencia al tratamiento y un pronóstico^{deficiente 1}. En los últimos años se han explorado diversos agentes antiglioma, incluyendo quimioterapias tradicionales como la temozolomida y una variedad de compuestos naturales como la^{curcumina 2}, resveratrol³ y galitaquina^{galato 4}. Estos agentes ejercen sus efectos a través de múltiples mecanismos, incluyendo la inducción de la apoptosis, la inhibición de la angiogénesis y la modulación de las vías de estrés oxidativo. Sin embargo, muchos de estos compuestos se enfrentan a limitaciones como la baja biodisponibilidad o una caracterización mecanicista incompleta. Esto pone de manifiesto la necesidad crítica de metodologías integrales que no solo confirmen la actividad antitumoral, sino que también diseccionen sistemáticamente los mecanismos farmacológicos subyacentes. Establecer estos flujos de trabajo mecanicistas es especialmente importante para acelerar el desarrollo de nuevos compuestos antigliomas desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.

Para apoyar este objetivo, un número creciente de estudios integra ahora herramientas computacionales y experimentales avanzadas para mejorar la resolución^{mecanicista 5,6}. Los modelos de diseño de fármacos basados en la estructura e inteligencia artificial (IA) —como AlphaFold3 y el acoplamiento molecular— están facilitando la identificación de interacciones prometedoras fármaco-objetivo con una velocidad y precisión sin^{precedentes 7,8}. Estas herramientas complementan los métodos experimentales prediciendo afinidades de unión e identificando posibles objetivos moleculares antes de la validación en laboratorio. Al mismo tiempo, la aparición de ensayos funcionales basados en vías, la imagen de células vivas y técnicas proteómicas de alta resolución permite a los investigadores evaluar el impacto celular de nuevos compuestos a través de múltiples ejes reguladores, incluyendo respuestas al estrés oxidativo, cascadas de transducción de señales y modalidades de muerte celular como la^{ferroptosis 9,10,11}.

Entre las vías de señalización implicadas en la biología del glioma, las vías fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)/Quinasa de proteína B (Akt) y factor 2 relacionado con el factor eritróide nuclear (Nrf2) son de particular interés debido a su papel en el crecimiento tumoral, la homeostasis redox y la resistencia a la terapia^12,13. La señalización PI3K/Akt promueve la supervivencia, la proliferación y la adaptación metabólica en las células glioma, mientras que Nrf2 actúa como regulador maestro de la respuesta antioxidante, suprimiendo la muerte celular^{ferroptótica 14}. La activación persistente de estas vías contribuye a la evasión del tratamiento, convirtiéndolas en objetivos atractivos para la intervención farmacológica¹⁵. Los métodos convencionales para la interrogación de vías incluyen western blot para proteínas totales y fosforiladas, así como qRT-PCR para análisis de expresión génica. Sin embargo, un análisis en profundidad de la señalización de Nrf2 requiere ensayos adicionales que evalúen la estabilidad de proteínas, la translocación nuclear y las modificaciones postraduccionales como la ubiquitinación. Estas estrategias de detección multifacéticas son esenciales para entender cómo ciertos compuestos interrumpen o refuerzan la regulación redox y el control ferroptótico.

La calceolariosida A (CaA), un derivado del ácido hidroxicinámico, ofrece un mecanismo dual al inhibir simultáneamente la señalización PI3K/Akt y promover la degradación proteasómica de Nrf2, aumentando así la sensibilidad ferroptótica. Esta estrategia de doble objetivo puede mejorar la reproducibilidad y la profundidad mecanicista respecto a agentes existentes como la erastin o RSL3, que actúan a la deriva de las defensas antioxidantes. Este protocolo presenta un enfoque experimental integrado para investigar el mecanismo farmacológico de CaA, que incluye acoplamiento molecular para identificar sitios de unión a PI3K, inmunoblot e inmunoprecipitación para detectar la expresión y ubiquitinación de Nrf2, y marcadores de ferroptosis como especies reactivas de oxígeno (ROS), glutatión (GSH) y malondialdehído (MDA). Además, se utiliza un modelo de ratón con xenoinjerto para evaluar la eficacia terapéutica y la seguridad sistémica de CaA. Este flujo de trabajo integral proporciona una plataforma reproducible e informativa para estudiar el mecanismo de acción de los agentes anticancerígenos, con énfasis en la integración de la modulación de las vías de señal y la regulación de la muerte celular.

Protocolo

Cultivo celular y tratamiento
Las células neuronales murinas HT22 y las líneas celulares de glioma humano U87 y U251 se cultivaron en el Medio Águila Modificado de Dulbecco, suplementado con suero bovino fetal al 10% y 4 mM de L-glutamina, bajo condiciones humidificadas a 37 °C con un 5% de CO₂. Para agilizar la consistencia experimental, todos los tratamientos celulares fueron estandarizados y descritos aquí. Esta sección describe las condiciones específicas utilizadas en cada grupo de tratamiento y los ensayos posteriores correspondientes.

Tratamiento de CaA:
Las células HT22 se trataron con concentraciones crecientes de CaA (0, 0,1, 0,5, 1, 10, 50, 100, 250 y 500 μM) durante 72 horas. Las células gliomas U87 y U251 se trataron con CaA a concentraciones de 5, 20 o 50 μM durante 24 horas en la mayoría de los experimentos, o con 50 μM durante 0, 6, 12 o 18 horas en estudios temporales. Estos tratamientos se utilizaron en los siguientes análisis: western blot para la subunidad antitransportadora de cisteína/glutamato (xCT), peroxidasa de glutatión 4 (GPX4), ferritina (FTH1), glutaminasa y PI3K/Akt/objetivo mamífero de rapamicina (mTOR)/ factor de iniciación eucariota 4B (EIF4B) (niveles total y fosforilado); reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR) para Nrf2 y la proteína asociada a ECH similar a Kelch 1 (Keap1); Medición ROS usando diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA); cuantificación GSH y MDA; detección de Fe²⁺ basada en FerroOrange; ensayo de proliferación de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU); Ensayo de formación de colonias; Ensayo de viabilidad celular de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT).

Cotratamiento con liproxstatina-1 (Lip1):
Las células fueron pretratadas con 50 nM Lip1 durante 2 horas antes de la adición de 50 μM CaA. Estas condiciones se utilizaron en el ensayo MTT (0, 24, 48, 72 h); ensayo de formación de colonias; Ensayo EdU; Ensayo de apoptosis Annexin V/PI (con/sin cisplatino de 20 nM).

Cotratamiento con MG132:
Las células se trataron con 10 μM de MG132 sola o combinadas con 50 μM CaA durante 24 horas. Esto se aplicó al western blot para la estabilización de la proteína Nrf2 (total y nuclear); Ensayos de inmunoprecipitación (IP) para Nrf2 y Keap1 ubiquitinados.

Cotratamiento con cisplatino:
Las células fueron tratadas con cisplatino de 20 nM sola o en combinación con 20 μM CaA durante 24 horas. Estos tratamientos se utilizaron en el ensayo de apoptosis con Anexina V/yoduro de propidio (PI).

Sobreexpresión de Nrf2 :
Las células fueron transfectadas con plásmidos de sobreexpresión de Nrf2 de 2,5 μg o vector vacío utilizando agente transfector durante 18 horas, y luego tratadas con 50 μM CaA durante 24 horas. Esta condición se utilizó en western blot para xCT, GPX4, FTH1 y glutaminasa; ensayos ROS, MDA, GSH; Tinción FerroOrange para hierro intracelular.

Un diagrama de flujo de trabajo (Figura suplementaria S1) resume las condiciones experimentales anteriores y los análisis correspondientes. Esta figura vincula visualmente cada protocolo de tratamiento con sus ensayos posteriores específicos para mejorar la claridad y reproducibilidad.

Evaluación de la viabilidad celular
La viabilidad celular se evaluó utilizando el método colorimétrico convencional MTT como se describió^{anteriormente 16}. Las células HT22, U251 y U87 se emplacaron en placas de cultivo de 96 pozos e incubaron durante la noche para permitir la adherencia. Tras completar el periodo de tratamiento, se introdujeron 15 μL de solución de MTT en cada pozo y las placas se incubaron durante 4 horas a 37 °C. Luego se descartó el medio y se añadieron 150 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) para solubilizar los cristales formados de formazan. La absorbancia se registró posteriormente a 490 nm usando un lector de microplacas. Valores de absorbancia más altos indican una mayor viabilidad celular, mientras que una reducción en la absorbancia sugiere efectos citotóxicos.

Ensayo de incorporación de EdU
Para evaluar la síntesis de ADN y la proliferación celular, se realizaron ensayos de incorporación de EdU utilizando un Kit de Imagen EdU como se describió^{anteriormente 17}. Brevemente, las células de glioma U251 y U87 se siembraron en placas de 24 pozos. Tras el tratamiento, las células se incubaron con EdU (concentración final de 10 μM) y se cultivaron durante 24 horas adicionales. Tras el paso de incubación, las células se fijaron usando paraformaldehído al 4% y luego se permeabilizaron con 0,5% de Triton X-100, y se teñieron según las instrucciones del kit. El porcentaje de células EdU positivas (células proliferantes) se cuantificó mediante microscopía de fluorescencia y se normalizó a núcleos totales tintidos con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).

Ensayo de formación de colonias
Para el ensayo de formación de colonias, las células de glioma U251 y U87 se colocaron en platos de 3,5 cm a baja densidad (500 células por plato). Tras el tratamiento, el medio de cultivo se intercambiaba por un medio fresco sin fármacos, y las células se mantenían durante otros 14 días para permitir la formación de colonias, con cambios de medio realizados cada tres días. Las colonias resultantes se fijaron posteriormente usando paraformaldehído al 4%, teñido con 0,1% de violeta cristalino y contado manualmente bajo un microscopio. Los racimos que superaban los 75 μm de diámetro fueron marcados como colonias. Cada experimento se realizó en triplicado y se repitió tres veces. Este ensayo siguió protocolos comúnmente aceptados para evaluar la capacidad proliferativa a largo^{plazo 18}. Las colonias deben aparecer como racimos densos y circulares; Menos colonias y más pequeñas sugieren una capacidad proliferativa reducida.

Evaluación de la apoptosis celular
La muerte celular apoptótica se evaluó utilizando el kit de detección de apoptosis FITC-Annexin V, como se describió^{anteriormente 16}. Las células de glioma U87 y U251 se trataron con cisplatino de 20 nM en presencia o ausencia de 20 μM de CaA durante 24 horas antes de la tinción. Para experimentos que implicaron inhibición de la ferroptosis, las células fueron pretratadas con 50 nM Lip1 durante 2 horas, seguidas de un cotratamiento con 20 μM CaA y 20 nM cisplatino durante 24 horas adicionales. Tras los tratamientos indicados, se extrajeron células (300 × g, 5 minutos) y se teñieron con Annexin V-FITC y PI según las instrucciones del fabricante. Tras el marcado, las muestras se examinaban en un citómetro de flujo. La adquisición de datos se realizó utilizando canales FL1 (FITC) y FL2 (PI), aplicándose ajustes de compensación para minimizar la superposición espectral. Posteriormente, se calculó la proporción de células V-positivas para la Anexina para determinar el grado de apoptosis.

Análisis de Western blot
El western blot se realizó según los procedimientos^{establecidos 19,20}. Brevemente, tras los tratamientos indicados, las células se lisaron en un tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa, y los niveles de proteínas se determinaron mediante el ensayo de Bradford. Para experimentos que evaluaban la distribución subcelular de Nrf2, se extrajeron proteínas nucleares y citoplasmáticas utilizando un kit comercial de extracción nuclear según las instrucciones del fabricante.

Un total de 40 μg de proteína de cada muestra se resolvió en un gel SDS-PAGE al 10% y posteriormente se transfirió a las membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% preparada en PBST (PBS con 0,1% Tween-20) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguida de una incubación nocturna con anticuerpos primarios a 4 °C. Tras el lavado, se aplicaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP (1:5.000) durante 1 hora a 37 °C, y las señales se detectaron mediante un sistema de quimioluminiscencia (ECL) mejorada.

Se midieron los niveles de expresión de xCT, glutaminasa, GPX4 y FTH1, utilizando gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control de carga. Las proteínas fosforiladas (p-PI3K, p-Akt, p-mTOR y p-EIF4B) se cuantificaron en relación con sus respectivos niveles totales de proteínas, mientras que las proteínas totales se normalizaron frente a GAPDH. El Nrf2 nuclear se normalizó a Lamin B. Los resultados esperados incluyen una reducción dependiente de la dosis y del tiempo en Nrf2 y p-PI3K/Akt/mTOR/EIF4B, y la regulación a la baja de marcadores relacionados con la ferroptosis en células tratadas con CaA.

Para ensayos de ubiquitinación, las células se trataron con MG132 (10 μM) con o sin CaA (50 μM) durante 24 horas. Tras la lisis, los complejos proteicos fueron inmunoprecipitados usando anticuerpos anti-Nrf2 o anti-Keap1; se usó IgG normal de conejo como control negativo. Posteriormente, los inmunoprecipitados fueron sondeados con anticuerpos anti-ubiquitina para detectar formas ubiquitinadas, mientras que los lisados totales también se sondearon para determinar los niveles de Nrf2 y la proteína ECH-asociada a Kelch (Keap1) para confirmar la entrada.

Extracción de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
La extracción de ARN y la qRT-PCR se realizaron siguiendo los protocolos^{estándar 21}. Brevemente, las células gliomas U87 y U251 se trataron con o sin CaA de 50 μM durante diferentes duraciones (6 y 18 horas). El ARN total se aislaba y convertía en ADNC mediante transcripción inversa. La PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se realizó utilizando una mezcla maestra SYBR Green qPCR en una plataforma de PCR en tiempo real. La expresión génica relativa se determinó mediante el cálculo 2-ΔΔCt. Las secuencias de cebador utilizadas para Nrf2, Keap1 y el gen de mantenimiento GAPDH fueron las siguientes:

Delantero Nrf2 , 5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′;
Nrf2 reversa, 5′-GGAATGTCTGCCAAAAGCTG-3′

Keap1 delantero, 5′-CAACTTCGCTGAGCAGATTGGC-3′;
Keap1 reversa, 5′-TGATGAGGGTCACCAGTTGGCA-3′

GAPDH delantero, 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCG-3′;
GAPDH inverso, 5′-AGCCTTCTACATGGTGGTGAAGAC-3′

Transducción Nrf2
Las células de glioma U251 y U87 fueron transfectadas transitoriamente con un plásmido de sobreexpresión de Nrf2 o un vector de control vacío correspondiente utilizando el reactivo de transfección basado en lípidos; El procedimiento se basaba en métodos convencionales de transfección^{transitoria 22}. En resumen, las células se sembraron en placas de 6 pozos con una densidad de 3 × 10⁵ células por pozo y se cultivaron durante la noche para lograr aproximadamente un 70-80% de confluencia en el momento de la transfección. Para cada pozo, se diluyeron 2,5 μg de ADN plasmídico en 125 μL de Medio Sérico Reducido y se mezclaron con 5 μL del reactivo de transfección. Por separado, se diluyeron 3,75 μL del reactivo de transfección en otros 125 μL del medio sérico reducido. El ADN diluido y las mezclas de reactivos transfeccionantes se combinaron, mezclaron suavemente e incubaron durante 10-15 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación compleja. Los complejos de transfección resultantes (volumen total 250 μL) se añadieron gota a gota a cada pozo que contenía células en un medio fresco completo.

Tras 18 horas de incubación a 37 °C en una incubadora de CO₂, el medio de transfección fue reemplazado por medio fresco de cultivo. Posteriormente, se realizaron ensayos posteriores de células, incluyendo western bloting, análisis ROS, cuantificación MDA/GSH y estudios de acumulación de hierro. Este protocolo sigue procedimientos ampliamente aceptados de expresión génica transitoria y permite una expresión robusta de Nrf2 en un plazo de 24-48 horas tras la transfección.

Medición del hierro intracelular
Se midieron los niveles intracelulares de^{Fe 2+} utilizando el indicador fluorescente FerroOrange. Las células de glioma Brief, U251 y U87 se siembraron en placas de 24 pozos y se trataron con concentraciones variables de CaA (5, 20 y 50 μM). Para evaluar el efecto de la sobreexpresión de Nrf2 en la ferroptosis, las células U87 y U251 fueron transfectadas con un plásmido de expresión de Nrf2 o un vector vacío. Tras 18 horas, se reemplazó el medio y se trataron las células con 50 μM de CaA durante 24 horas. Posteriormente, las células se expusieron a 1 μM de FerroOrange en un medio libre de suero e incubadas a 37 °C durante 30 minutos antes del análisis. Tras la incubación, las células se enjuagaron y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia, utilizando un conjunto de filtros TRITC (excitación ~543 nm, emisión 560-600 nm), donde el aumento de la intensidad de fluorescencia naranja indica niveles más altos de Fe²⁺ lábil, típicamente localizado en el citoplasma. Este método fue adaptado a partir de ensayos de hierro basados en sondas^{fluorescentes establecidos 23}.

Medición de GSH y MDA
Los niveles intracelulares de GSH y MDA se determinaron tras protocolos de evaluación estandarizados para evaluar el estrés^{oxidativo 24}. Las células de glioma Brief, U251 y U87 se siembraron en placas de 24 pozos y se trataron con concentraciones variables de CaA (5, 20 y 50 μM). Para evaluar el efecto de la sobreexpresión de Nrf2 en la ferroptosis, las células U87 y U251 fueron transfectadas con un plásmido de expresión de Nrf2 o un vector vacío. Tras 18 horas, se reemplazó el medio y se trataron las células con 50 μM de CaA durante 24 horas. Posteriormente, las células se lisaron en el tampón RIPA y se midieron las concentraciones totales de proteínas utilizando un kit de cuantificación de proteínas BCA. Los contenidos de GSH y MDA se analizaron posteriormente utilizando kits de detección comerciales de acuerdo con los protocolos de los fabricantes.

Ensayo ROS
La generación intracelular de ROS se evaluó utilizando la sonda fluorescente DCFH-DA de acuerdo con los protocolos^{establecidos 25}. Las células de glioma Brief, U251 y U87 se siembraron en placas de 24 pozos y se trataron con concentraciones variables de CaA (5, 20 y 50 μM). Para evaluar el efecto de la sobreexpresión de Nrf2 en la ferroptosis, las células U87 y U251 fueron transfectadas con un plásmido de expresión de Nrf2 o un vector vacío. Tras 18 horas, se reemplazó el medio y se trataron las células con 50 μM de CaA durante 24 horas. Posteriormente, las células se trataron con 5 μM DCFH-DA a 37 °C durante 1 hora, seguidas de lavados PBS para eliminar el exceso de colorante. Las señales de fluorescencia se visualizaron usando un microscopio de fluorescencia invertida, equipado con un filtro FITC (excitación 488 nm, emisión 525 nm), y se capturaron imágenes para su análisis. El aumento de la intensidad de la fluorescencia verde corresponde a niveles elevados de ROS intracelular.

Experimentos con animales
Todos los experimentos con animales se realizaron de estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales del Hospital Popular Weifang bajo el número de aprobación [2025SDL579]. Para generar el modelo de xenoinjerto de glioma, se resuspendieron 2 ×^{10 células de 6} U87 en 0,2 mL de PBS y se inocularon subcutáneamente en el flanco izquierdo de ratones BALB/c machos de 4 semanas. Tras permitir que los tumores se desarrollaran durante 7 días, los ratones fueron asignados aleatoriamente a tres grupos (n = 8 por grupo): control no tratado, tratado con CaA (2,5 mg/kg) y CaA (2,5 mg/kg) combinado con Lip1 (10 mg/kg). Los tratamientos se administraron mediante inyecciones intraperitoneales diarias durante 14 días consecutivos. Las dimensiones tumorales se midieron cada 3 días con calibradores, y los volúmenes se calcularon usando la fórmula: volumen = (longitud × ancho²) / 2. En el día 21, todos los ratones fueron eutanasiados y se extirparon tumores y se fotografiaron para análisis posteriores.

Secuenciación de ARN y análisis de vías KEGG
Se realizó secuenciación de ARN para perfilar cambios transcripcionales tras la exposición a CaA. La integridad del ARN se confirmó mediante el uso de un espectrofotómetro UV-VIS de microvolumen y un sistema de electroforesis basado en capilares antes de la secuenciación en la plataforma Illumina. Las lecturas limpias se mapearon al genoma de referencia humano (GRCh38) con HISAT2, y la expresión génica se cuantificó como FPKM. Se identificaron genes expresados diferencialmente usando DESeq2 (FDR < 0,05, |log₂FC| ≥ 1), y el enriquecimiento funcional se evaluó mediante análisis de vías KEGG (ajustado P < 0,05).

Análisis de acoplamiento molecular
Se empleó acoplamiento molecular para predecir la interacción entre CaA y la vía PI3K/Akt. La estructura cristalina de la subunidad catalítica humana PI3K p110α (PIK3CA) se obtuvo del Banco de Datos de Proteínas (PDB ID: 8BFU). La estructura de CaA fue recuperada de PubChem y minimizada la energía usando software de modelado molecular. Utilizando software de preparación para acoplamiento molecular, se eliminaron todas las moléculas de agua y ligandos no esenciales de la estructura PIK3CA, y se añadieron átomos de hidrógeno. Se definió una cuadrícula de acoplamiento alrededor del sitio activo de PIK3CA (basada en coordenadas conocidas del sitio de enlace), y se utilizó un algoritmo de acoplamiento para realizar el acoplamiento. Las poses de unión con mayor puntuación de CaA se seleccionaron según la afinidad de unión (kcal/mol) y se examinaron para detectar interacciones clave. Las interacciones proteína-ligando, como enlaces de hidrógeno y contactos hidrofóbicos, se visualizaron con software de visualización molecular y una herramienta de mapeo de interacciones 2D.

Seguridad y eliminación de residuos
Todos los experimentos que involucraban reactivos químicos como DMSO, tintes fluorescentes (DCFH-DA, FerroOrange) y fijadores se realizaron en una campana extractora con equipo de protección personal (EPI) adecuado, incluyendo guantes y gafas de seguridad. El DMSO y las sondas fluorescentes se manejaron con precaución debido a su capacidad para penetrar la piel y su posible citotoxicidad. Los materiales contaminados, incluyendo puntas de pipeta, placas de cultivo y guantes, se desechaban en contenedores de residuos peligrosos designados. Los tejidos y cadáveres animales se trataron como residuos biopeligrosos y fueron incinerados o autoclavados según las normativas institucionales de bioseguridad y las directrices medioambientales locales.

Análisis estadístico
Todos los resultados se presentan como la media ± desviación estándar (DS). Las diferencias entre dos grupos se evaluaron mediante una prueba t de Student de dos colas. Para análisis que involucraban a varios grupos, se aplicó ANOVA unidireccional seguida de comparaciones post hoc adecuadas (como la prueba de Tukey). Un valor p inferior a 0,05 se consideraba indicativo de significación estadística.

Resultados

Supresión de la proliferación y mayor quimiosensibilidad de las células U251 y U87 in vitro por CaA
La Figura 1A ilustra la estructura de CaA. Primero evaluamos los efectos citotóxicos de CaA utilizando un ensayo MTT en células neuronales murinas normales HT22 y en células de glioma humano U251 y U87. En comparación con las células no tratadas (0 μM CaA), el CaA tuvo un impacto mínimo en la viabilidad de las células HT22 a conce...

Discusión

CaA exhibe un efecto antitumoral convincente en el glioblastoma al modular de forma única dos ejes críticos de supervivencia: la vía PI3K/Akt/mTOR y el mecanismo de defensa contra la ferroptosis Nrf2. La vía PI3K/Akt está frecuentemente hiperactivada en el glioblastoma multiforme (GBM, alterado en hasta ~88-90% de los casos) debido a la pérdida de PTEN o activación de RTK, lo que impulsa la proliferación y la resistencia a^{la terapia 26}. Sin embargo, atacar solo es...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agilent 2100 Bioanalyzer			sistema de electroforesis capilar
Annexin V-FITC Apoptosis Kit	Roche Diagnostics	11858777001	N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)			software de preparación para acoplamiento molecular (algoritmo de acoplamiento)
Calceolarioside A (CaA)	Sigma-Aldrich	SMB00246	N/A
Chem3D			software de modelado molecular
cDNA Synthesis Kit	Vazyme Biotech	R223	N/A
DCFH-DA	Sigma-Aldrich	D6883	N/A
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	N/A
DMSO	Merck	D8418	N/A
FerroOrange probe	Dojindo	F374	N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442	N/A
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAriaIII Flow Cytometry	Instrumento para analizar células teñidas con Annexin V
Fluorescence microscope	Olympus	IX73	Instrumento para observar la fluorescencia de FerroOrange y DCFH-DA
FTH1 antibody	Abcam	ab75973	AB_1310150
GAPDH antibody	Abcam	ab8245	AB_2107448
GLS antibody	Abcam	ab93434	AB_10563527
GPX4 antibody	Abcam	ab125066	AB_10972289
HT22 murine neuronal cell line	AddexBio	C0011008	CVCL_0321
jetPRIME transfection reagent	Polyplus-transfection	114-07	reactivo de transfección basado en polímeros
Keap1 antibody	Abcam	ab139729	AB_2732852
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	N/A
LigPlot+			herramienta de mapeo de interacciones 2D
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific		reactivo de transfección basado en lípidos
Liproxstatin-1	Selleck	S7699	N/A
MG132	Selleck	S2619	N/A
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	H1M	Instrumento para medir la absorbancia en el ensayo MTT (a 490 nm)
MTT	Sigma-Aldrich	M5655	N/A
NanoDrop			espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen
Nrf2 antibody	Abcam	ab62352	AB_945626
Nude BALB/c mice	Vital River, China	N/A	IMSR_CRL:028
OptiMeM reduced serum medium
PyMOL			software de visualización molecular
QuantStudio 5 Real-Time PCR System
SYBR Green Master Mix	Vazyme Biotech	Q711	N/A
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	N/A
U251 human glioma cell line	CLS Cell Lines Service	300385	CVCL_0021
U87 human glioma cell line	ATCC	HTB-14	CVCL_0022
Ubiquitin antibody	Abcam	ab7780	AB_306981
xCT/SLC7A11 antibody	Abcam	ab175186	AB_2715513