Mapeo genómico de modificaciones de histonas y sitios de unión a factores de transcripción en líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas neuroendocrinas utilizando CUT&RUN

Resumen

Se describe un protocolo optimizado de Cliavage Under Targets and Release Using Nuclease followed by next generation sequencing (CUT&RUN-seq) para líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas neuroendocrinas. Permite el mapeo genómico de diversas modificaciones de histonas y sitios de unión a factores de transcripción (por ejemplo, E2F7) para investigar la desregulación epigenética y transcripcional en la patobiología de SCLC.

Resumen

Las proteínas de remodelación de la cromatina y los factores de transcripción (TF) desempeñan un papel fundamental en la biología tumoral del cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). La caracterización genómica de modificaciones posttraduccionales (PTMs) y sitios de unión a las fibras de las histonas es esencial para identificar elementos reguladores del ADN y vías génicas que conducirán a una comprensión mecanicista más profunda de la SCLC y designarán objetivos para la intervención terapéutica. La escisión bajo objetivos y liberación mediante nucleasa, seguida de secuenciación de nueva generación (CUT&RUN-seq), es un método potente para mapear modificaciones específicas de histonas y determinar los perfiles de unión al ADN de una amplia gama de proteínas in situ en el genoma celular. En CUT&RUN, la nucleasa microcócica (MNasa) fusionada con la proteína A/G se recluta mediante anticuerpos hacia las ubicaciones genómicas de las proteínas asociadas a la cromatina, donde los fragmentos de ADN subyacentes se liberan de la cromatina masiva tras la activación y la clivación de la MNasa. Esta digestión localizada genera pequeños fragmentos de ADN específicos del locus, adecuados para la secuenciación.

Aquí presentamos un protocolo detallado para perfilar modificaciones de histonas H3K4me3 (asociadas a promotores activos o abiertos) y H3K4me1 (asociadas a potenciadores activos), así como el factor de transcripción E2F7, en SCLC. Este protocolo ha sido optimizado para modelos de líneas celulares de SCLC neuroendocrinas (NE), que suelen caracterizarse por núcleos grandes, citoplasma escaso y crecimiento como agregados no adherentes en suspensión.

Introducción

Las modificaciones postraduccionales de histonas (PTMs) y los factores de transcripción (TF) son reguladores centrales de la expresión génica. Las PTM de histonas, como la acetilación, metilación, fosforilación y ubiquitinación, principalmente en sus colas N-terminales, influyen en la estructura^{de la cromatina 1,2}. En el cáncer, las PTM de histonas suelen estar desreguladas, lo que conduce a una activación aberrante de oncogenes o al silenciamiento de genes supresores^{tumorales 3}. Las TF se une a secuencias específicas de ADN en los promotores o potenciadores para activar o reprimir genes objetivo, reclutando a menudo enzimas modificadoras de histonas que coordinan la remodelación de la^{cromatina 4}. Las enzimas que escriben, borran o leen marcas de histonas, como las acetiltransferasas de histonas (HATs), desacetilasas de histonas (HDAC) y metiltransferasas (HMTs), frecuentemente están mutadas o desreguladas en el cáncer, lo que las convierte en objetivos terapéuticos^{atractivos 5}.

En el SCLC, los cambios epigenéticos y los factores de transcripción que definen el linaje (LDTFs) son factores clave de la biología^{tumoral 6}. A diferencia de las mutaciones genéticas, las alteraciones epigenéticas, incluyendo la metilación del ADN y las modificaciones de histonas, regulan la expresión génica sin cambiar la secuencia subyacente de ADN. Estas modificaciones pueden silenciar genes supresores tumorales o activar oncogenes, alimentando el comportamiento agresivo del SCLC. Por ejemplo, la metiltransferasa de histonas KMT2D muta frecuentemente con una frecuencia de alteración del 12,9% en una gran cohorte real de pacientes^{SCLC 7} y es responsable de la monometilación de la lisina 4 de la histona H3 (H3K4me1), una marca asociada a regiones potenciadoras activas en el genoma. El SCLC es una enfermedad molecularmente heterogénea. Los SCLC se clasifican en subtipos moleculares basados en la expresión diferencial de cuatro LDTFs: homólogo de aquete-escudo 1 (ASCL1), factor de diferenciación neurogénico 1 (NEUROD1), proteína asociada a sí 1 (YAP1) y homeobox 3 clase 2 de POU (POU2F3). Los subtipos neuroendocrinos (NE), incluyendo ASCL1 y NEUROD1, representan aproximadamente el 70-80% de los casos de^{SCLC 8}. Por lo tanto, investigar la distribución y los perfiles de diferentes PTM de histonas y sitios de unión a TF en los distintos subtipos de SCLC puede aclarar programas génicos específicos de subtipo vulnerables a intervención terapéutica.

El método tradicional para identificar las PTM de las histonas y los sitios de unión de proteínas reguladoras específicas de secuencia a nivel genómico es la secuenciación por inmunoprecipitación por cromatina (ChIP-seq⁾⁹. Sin embargo, ChIP-seq requiere un gran número de células de entrada y a menudo produce un alto nivel de fondo en todo el genoma. Como resultado, ChIP-seq requiere un alto nivel de enriquecimiento de la proteína objetivo para distinguir la señal real del ruido y necesita una secuenciación profunda para un análisis efectivo de datos. Además, la reticulación de formaldehído utilizada en ChIP-seq puede enmascarar epítopos y generar sitios de unión^{falsos positivos 10}. Clivaje Under Targets and Release Using Nuclease followed by next-generation sequenciing (CUT&RUN-seq) es una alternativa de alta resolución para mapear los PTM de histonas y los sitios de unión TF in situ dentro de células intactas. En este método, las células permeabilizadas se incuban con un anticuerpo dirigido a la proteína asociada a la cromatina de interés, seguida de la unión de una proteína de fusión de la proteína A(G)-micrococcal nucleasa (MNasa). La digestión dirigida del ADN que flanquea la proteína de interés se induce entonces en condiciones de alto contenido en calcio y baja en sal, liberando fragmentos específicos de ADN para su purificación. Los fragmentos de ADN purificados se utilizan para construir bibliotecas de secuenciación con código de barras, que pueden agruparse para secuenciar de alto rendimiento^{11, 12, 13 y 14}. En comparación con ChIP-seq, CUT&RUN requiere significativamente menos células como entrada, produce menos ruido de fondo, evita artefactos de reticulación y requiere menos lecturas de secuenciación, lo que lo hace especialmente adecuado para estudiar estados dinámicos de cromatina en cáncer de forma rentable.

La tecnología CUT&RUN se ha desarrollado para investigar las ubicaciones genómicas de las proteínas que interinteraccionan con la cromatina, incluyendo modificaciones de histonas, sitios de unión a la TF y complejos asociados a la cromatina, revelando así paisajes reguladores^{epigenéticos 11,12}. Esta técnica ha permitido análisis detallados de la arquitectura potenciador-promotor, la regulación de redes transcriptionales y la dinámica del estado de la cromatina durante el desarrollo y la progresión de la^{enfermedad 15}. En investigación oncológica, CUT&RUN permite un mapeo preciso de las marcas de^{histonas 16,17} y la ocupación de factores de transcripción oncogénicos, ayudando a identificar programas regulatorios específicos de linaje y posibles objetivos terapéuticos^15,16. Además, CUT&RUN puede realizarse in situ en células, incluyendo la célula^{T CD8+ 17}, así como en muestras de tejido^18,19.

Para detectar la ubicación genómica de las PTM y los sitios de unión del factor de transcripción E2F7 en subtipos de SCLC, aplicamos CUT&RUN-seq a cuatro modelos de líneas celulares de SCLC NE: H146 y DMS79 (subtipo ASCL1), así como H446 y H82 (subtipo NEUROD1), con o sin mutaciones KMT2D. Perfilamos la marca de histonas H3K4me1, una modificación asociada a potenciadores principalmente catalizada por KMT2D, y E2F7, que se ha demostrado que es un cofactor de^{ASCL1 20}. La marca de histonas H3K4me3, asociada a promotores activos, sirvió como control positivo, mientras que IgG sirvió como control negativo.

Aquí presentamos un protocolo detallado CUT&RUN-seq para las líneas celulares SCLC NE, basado en lo siguiente: un kit CUT&RUN disponible comercialmente (véase la Tabla de Materiales), el trabajo original de Skene y Henikoff 11,12,13, y nuestras propias optimizaciones de laboratorio.

Protocolo

NOTA: Este protocolo (Figura 1) proporciona instrucciones paso a paso para realizar CUT&RUN-seq en líneas celulares SCLC NE, que normalmente crecen como agregados no adherentes o agrupaciones flotantes.

1. Cultivo celular

1. Mantener las líneas celulares DMS79 (subtipo ASCL1), H146 (subtipo ASCL1), H82 (subtipo NEUROD1) y H446 (subtipo NEUROD1) en 13 mL de medios RPMI-1640 suplementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina (véase Tabla de Materiales) en matrazas de 75 mL. Cultiva las células en una incubadora a 37 °C con un 5% de_CO2.
   NOTA: Todas las células utilizadas en este estudio fueron adquiridas en ATCC y han sido autenticadas con perfilado en tándem corto.

2. Permeabilización celular

NOTA: Una adecuada permeabilización celular es esencial para permitir que los anticuerpos, la pAG-MNasa y los fragmentos de proteína-ADN digeridos difundan libremente dentro y fuera de las células. Antes de iniciar el protocolo CUT&RUN en una nueva línea celular, deben realizarse optimizaciones para determinar la concentración ideal de digitonina para una permeabilización efectiva. La concentración más baja que logre más del 95% de permeabilización (95% de las células "muertas") debe usarse para el protocolo CUT&RUN.

1. Coloca el stock de digitonina al 5%, el inhibidor de proteasas y la espermidina sobre hielo y deja que se descongelen completamente.
2. Prepara el Wash Buffer según la Tabla 1 y mantén el buffer sobre hielo.
3. Preparar una solución de trabajo de digitonina al 0,05% mezclando 10 μL del material al 5% con 990 μL de tampón de lavado. Mezcla bien mediante vórtices y mantenlo en hielo.
4. Genera una serie de dilución de digitoninas (0,05%, 0,01%, 0,001% y 0,0001%)" diluyendo secuencialmente la solución anterior a un volumen final de 1 mL de cada tubo. Haz vórtices en cada dilución antes de pasar a la siguiente. Al mismo tiempo, preparar un control de 0,05% de Dimetil Sulfóxido (DMSO) en Wash Buffer (100 μL total; véase la Tabla 2).
   NOTA: La digitonina y el DMSO son productos químicos peligrosos. Manipula con precaución y desecha todos los residuos en un contenedor de residuos peligrosos correctamente etiquetado y con tapas seguras.
5. Mantén todas las soluciones de dilución de digitonina y el control DMSO sobre hielo hasta que se usen.
6. Determina el número de celdas necesarias multiplicando el número de condiciones de permeabilización por el número de células requeridas por prueba. Incluye un 20% adicional para compensar la variación del pipeteo (por ejemplo, para cinco condiciones a 5×10⁵ celdas cada una, preparar aproximadamente 1,2 x 5 x 5 x 10⁵ celdas).
7. Recoger el número requerido de células cultivadas mediante centrifugación a 600 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente (RT). Resuspende el pellet en 600 μL de 1× PBS (100 μL por condición más un 20% extra).
8. Alicuota de 100 μL de las celdas resuspendidas por PBS en cinco tubos microcentrífugas de 1,5 mL: uno para cada concentración de digitonina y otro para el control DMSO.
9. Centrifuga los tubos a 600 × g durante 3 minutos en RT.
10. Retirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender cada pastilla en 50 μL del correspondiente buffer de control de digitonina o DMSO.
11. Incuba las muestras en RT durante 10 minutos.
12. Mezclar 10 μL de las células tratadas con 10 μL de azul de tripán y cargar 10 μL de la mezcla en una lámina de conteo celular.
13. Utiliza un contador celular para cuantificar células viables (sin teñir) y células positivas permeabilizadas no viables (teñido de azul).
14. Identificar la concentración más baja de digitonina que produce la mayor proporción de células positivas en azul de tripán. Utiliza esta concentración para el experimento CUT&RUN aguas abajo. Confirma que el control DMSO mantiene la viabilidad típica de un cultivo celular sano normal.

3. SEQ DE CORTAR Y CORRER

NOTA: Los reactivos de este protocolo están escalados para 5 reacciones, añadiéndose un extra para compensar la pérdida por pipeteo. Para una lista de materiales y equipos, consulte la Tabla de Materiales. Se recomiendan al menos dos réplicas biológicas independientes para cada experimento CUT&RUN.

1. Día 1
   1. PREPARACIÓN DEL BUFFER DE CORTE Y CORRIDA
      1. Prepara el tampón de lavado combinando el tampón pre-lavado, 25x inhibidor de proteasas y 1 M de espermidina como se indica en la Tabla 3.
      2. Prepara el Buffer de Permeabilización Celular añadiendo un 5% de Digitonina al Wash Buffer según la Tabla 3.
      3. Prepare el tampón de anticuerpos añadiendo 0,4 μL de EDTA a 100 μL de tampón de permeabilización celular con la concentración adecuada de digitonina, como se describe en la Tabla 3. Coloca el buffer preparado sobre hielo.
      4. Almacena el tampón de permeabilización celular restante a 4 °C para usarlo en el segundo día.
   2. Activación de las perlas de concanavalina A (ConA)
      1. Resuspende suavemente la suspensión de talones ConA para asegurar su distribución uniforme.
      2. Transfiere 55 μL de la suspensión de las perlas (11 μL por muestra) a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
      3. Coloca el tubo en una rejilla magnética de 1,5 mL hasta que las perlas se hayan separado completamente, luego haz una pipete para eliminar el sobrenadante.
      4. Lava inmediatamente las perlas dos veces con 500 μL de buffer de activación de perlas helado (100 μL por muestra). Resuspende las cuentas pipeteando suavemente en cada lavado y utiliza la rejilla magnética para descartar el sobrenadante entre lavados.
      5. Tras el lavado final, retirar el sobrenadante y volver a suspender suavemente las perlas activadas en 55 μL (11 μL por muestra) de tampón de activación de perlas helado.
      6. Adicción, 10 μL de las cuentas suspenden en cada tubo de un conjunto de tubos de 8 tiras y mantienen los tubos en hielo.
   3. Cosecha células y une células a las perlas activadas
      NOTA: La viabilidad celular es importante para la relación señal/fondo. Sin embargo, la viabilidad de las líneas celulares NE de SCLC puede variar (70%-90%) debido a la alta tasa inherentemente alta de renovación celular y a la preferencia por crecer como agregados medianos o grandes en suspensión.
      1. Retira las células del incubador de 37 °C y explícalas al microscopio para garantizar la calidad.
      2. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo cónico de 50 mL y centrifuga a 1.000-1.200 × g durante 5 minutos en RT.
      3. Aspira el medio del tubo cónico y enjuaga el pellet celular con 20 mL de 1× PBS.
      4. Centrifuga de nuevo, aspira el PBS y digire el pellet con Accutasa durante 3-5 minutos a 37°C, según el tamaño del pellet.
      5. Termina la digestión añadiendo 5 mL de PBS + 10% de FBS. Obtén la suspensión unicelular pipeteando suavemente arriba y abajo con una pipeta serológica.
      6. Centrifuga las celdas a 1.000-1.200 × g durante 5 minutos, descarta el sobrenadante y vuelve a suspender la pastilla de células en 5 mL de PBS.
      7. Cuenta las células iniciales, confirma la viabilidad e integridad celular.
      8. Calcular el número total de celdas necesarias multiplicando el número de reacciones por el número de células por reacción (5×10⁵). Añade un 20% de exceso para compensar errores de pipeteo (por ejemplo, 1,2 × 6 × 5 × 10⁵ para 6 reacciones). Transfiere las suspensiones de celda calculadas a tubos de 1,5 mL. Centrifugación a 600 x g, 3 minutos en RT.
         NOTA: Prepara al menos una reacción adicional como respaldo.
      9. Resuspender las células en el tampón de lavado RT a una densidad de 5×10⁵ celdas por reacción (seis reacciones en total), usando 100 μL por reacción, pipeteando suavemente pero a fondo para asegurar una suspensión uniforme. Centrifugar a 600 x g durante 3 minutos en RT. Pipeta para eliminar el sobrenadante.
      10. Repite el paso de lavado (Paso 9) una vez más.
      11. Alicuota 100 μL de pilas lavadas a cada tubo del conjunto de 8 tiras que contiene 10 μL de perlas de CoA activadas. Pipetea suavemente para mezclar y centrifuga rápidamente en una mini centrífuga para recoger la suspensión (las cuentas no deben asentarse).
      12. Incubar la suspensión de células de perlas durante 10 minutos en RT para permitir que las células se unan a las perlas.
      13. Coloca los tubos en una rejilla de imanes de 0,2 mL, deja que la suspensión se disipe y haz una pipeta para eliminar el sobrenadante. Ahorra 10 μL de sobrenadante para confirmar que las células están unidas a las perlas. Descarta el sobrenadante restante y pasa rápidamente al siguiente paso.
      14. Quita los tubos del imán. Añade inmediatamente 50 μL de buffer de anticuerpos helado a cada reacción y pipetea suavemente para volver a suspender las perlas.
      15. Mezcla 10 μL tanto del sobrenadante como 10 μL de la suspensión de célula/perla (resuspendida en buffer de anticuerpos) con 10 μL de azul tripánico y carga la mezcla sobre la lámina de contracarga celular.
      16. Analiza con un contador de células. Confirma que el sobrenadante contiene casi ninguna perla ni célula, y que la mezcla de perlas/celdas contiene células permeabilizadas rodeadas de perlas.
          NOTA: Es importante comprobar la compatibilidad de unión de las perlas de CoA de Cell.
   4. Permeabilización y unión a anticuerpos
      NOTA: El éxito de CUT&RUN depende críticamente de la afinidad del anticuerpo por su objetivo y de su especificidad bajo condiciones experimentales específicas. Recomendamos lo siguiente: 1. Utilizar anticuerpos comerciales validados para CUT y RUN cuando estén disponibles. 2. Para objetivos sin anticuerpos validados por CUT&RUN, considérense aquellos validados para inmunofluorescencia (FI), ya que los anticuerpos IF reconocen epítopos en su contexto celular nativo, similar a la unión in situ del anticuerpo al objetivo dentro de células permeabilizadas en CUT&RUN. 3. Analizar 3-5 anticuerpos en paralelo para identificar el más eficaz para tu aplicación específica.
      1. Gira rápidamente el panel de K-MetStat y la pipeta para volver a suspender. Añadir 2 μL de panel K-MetStat a las reacciones designadas para anticuerpos de control H3K4me3 positivo e IgG negativo. Pipeta para mezclar y tubos de centrifugación rápida (opcional).
      2. Añadir 0,5 μg de anticuerpos H3K4me3, H3K4me1 e IgG, y 0,6 μg de anticuerpos policlonales E2F7 de diferentes fuentes a cada reacción (Tabla 4). Etiqueta los tubos de 8 tiras.
      3. Pipetea suavemente para mezclar correctamente cada tubo de reacción. Incuba durante la noche a 4 °C en un nutator con las tapas de los tubos elevadas. No gires ni inviertas los ^tubos.
2. Día 2
   1. Unión de pAG-MNasa a un anticuerpo
      NOTA: Las cuentas que se asienten durante la noche es normal y no afecta a los resultados. Si las cuentas se vuelven grumosas o pegajosas tras una incubación nocturna, vuelve a suspenderlas con un pipeteo suave. Para mejorar la consistencia y el rendimiento, se recomienda el pipeteo multicanal. Al usar tubos de 8 tiras, retira y vuelve a colocar los buffers una tira a la vez para evitar que las cuentas de ConA se sequen.
      1. Pon el soporte magnético sobre hielo.
      2. Retira los tubos de 8 tiras de la incubación a 4 °C y haz un giro rápido para recoger líquido.
      3. Coloca tubos en el soporte magnético hasta que la suspensión se disipe. Pipetea con cuidado y quita el sobrenadante.
      4. Mantén los tubos en el soporte del imán. Lava los tubos dos veces con 200 μL de tampón de permeabilización celular en frío. Pipeta para eliminar el sobrenadante.
      5. Retira los tubos del soporte de imán y añade inmediatamente 50 μL de Buffer de Permeabilización Celular en frío a cada reacción. Pipetar suavemente para resuspender las células/perlas.
      6. Añade 2,5 μL de pAG-MNasa a cada reacción y mezcla bien pipeteando suavemente.
      7. Incuba reacciones durante 10 minutos en tiempo de descanso.
      8. Gira rápido los tubos, colócalos de nuevo en el soporte magnético hasta que la suspensión se disipe. Pipeta para eliminar el sobrenadante.
      9. Manteniendo los tubos en el soporte del imán, lava los tubos dos veces con 200 μL de tampón de permeabilización celular en frío. Pipeta para eliminar el sobrenadante.
      10. Retirar los tubos del soporte magnético y resuspender suavemente en 50 μL de Buffer de Permeabilización Celular en frío. Coloca los tubos sobre hielo.
   2. Digestión y liberación dirigidas de cromatina
      NOTA: Realizar una digestión dependiente de Ca²⁺ a 0 °C para minimizar la cindidura no intencionada de la MNasa del^{ADN 12} accesible. Incluye ADN de spik-in, como Escherichia coli (E. coli), de modo que represente aproximadamente el 0,5-5% (idealmente ~1%) del total de la secuenciación^{que se indica 13}. El ADN spike-in se utiliza para normalizar la profundidad de secuenciación y es especialmente importante al comparar muestras en una serie, por ejemplo, al evaluar los cambios globales de modificación de las histonas tras la inhibición o la deleción genética de enzimas modificadoras de las histonas.
      1. Añadir 1 μL de 100 mM de cloruro de calcio a cada reacción en la tira de 8 tubos (del paso 3.2.1.10) mientras se está sobre hielo. Pipetea suavemente para resuspender completamente las cuentas y asegurar una digestión eficiente.
      2. Incubar los tubos en un nutator a 4 °C durante 2 horas, con los extremos tapados elevados.
      3. En un tubo nuevo de 1,5 mL, prepare la mezcla de amortiguador de parada. Para cada reacción, combina 33 μL de Stop Buffer con 1 μL de ADN spike-in de E. coli (0,5 ng). Suavemente en vórtice para mezclar.
      4. Añade 33 μL de buffer de parada a cada reacción al final de la incubación de 2 horas. Mezcla pipeteando suavemente.
      5. Incuba las reacciones en un termociclador a 37 °C durante 10 minutos.
      6. Haz girar tubos rápidos para recoger el contenido en la parte inferior y luego colócalos en una rejilla magnética hasta que la solución se despeje.
      7. Transfiere cuidadosamente aproximadamente 84 μL de sobrenadante que contiene el ADN liberado por CUT y RUN a tubos frescos de 1,5 mL.
   3. Purificación del ADN usando el Kit de Purificación de ADN (véase Tabla de Materiales)
      NOTA: Antes de su primer uso, añade 6,9 mL de isopropanol al Buffer de Unión al ADN y añade 20 mL ≥ etanol al 95% al Buffer de Lavado de ADN.
      1. Añade 420 μL de buffer de unión al ADN a cada supernadante recogido. Vórtice brevemente para mezclar a fondo.
      2. Coloca una columna de limpieza de ADN en sus tubos de recogida.
      3. Carga cada muestra en la columna correspondiente.
      4. Centrifugar a 16.000 × g durante 30 s en RT. Descartar el flujo y devolver la columna al tubo de recogida.
      5. Añade 200 μL de buffer de lavado de ADN a cada columna y centrifuga a 16.000 x g durante 30 s en RT. Descarta el flujo y vuelve a colocar la columna en el tubo de recogida.
      6. Repite el paso de lavado una vez.
      7. Centrifugar de nuevo a 16.000 x g durante 30 s en RT para eliminar completamente el tampón residual de lavado.
      8. Transferir columnas a tubos etiquetados de 1,5 mL.
      9. Aplica 12 μL de Elution Buffer directamente sobre la membrana situada en el centro de la columna.
      10. Incubar durante 5 minutos en RT y luego centrifugar a 16.000 × g durante 1 minuto en RT para eluir el ADN.
          NOTA: Este es un punto de parada seguro. Almacenar ADN eluído a -20 °C para su procesamiento futuro.
   4. Cuantificación del ADN y análisis de distribución del tamaño de fragmentos de corte y run
      NOTA: Cuantifique el ADN usando un fluorómetro con el kit de ensayo de alta sensibilidad dsDNA, que proporciona mediciones más precisas del ADN de doble cadena que los métodos basados en absorbancia.
      1. Utilice 1 μL de cada muestra para determinar la concentración de ADN de CUT & RUN utilizando el kit de ensayo de alta sensibilidad dsDNA (véase la Tabla de Materiales).
      2. Utiliza 1 μL adicional de ADN para evaluar la presencia y distribución de tamaño de los fragmentos escindidos. Realizar análisis de fragmentos utilizando el Kit de ADN de Alta Sensibilidad (véase Tabla de Materiales) siguiendo las directrices del fabricante (opcional).
         NOTA: Proteínas de unión altamente abundantes, como las modificaciones posttraduccionales de histonas (PTMs), pueden detectarse fácilmente en este paso. Sin embargo, los factores de transcripción de baja abundancia pueden ser más difíciles de detectar.
   5. Construcción de bibliotecas, análisis de fragmentos y secuenciación
      NOTA: Se utilizó ADN total de ≤5 ng CUT&RUN, determinado por la cuantificación del kit de ensayo de alta sensibilidad dsDNA, para la construcción de las bibliotecas de secuenciación de próxima generación (NGS) de CUT&RUN. Para minimizar los dímeros del adaptador, reduce el adaptador de Illumina a 1 μL para la ligación del adaptador. El número de ciclos de PCR durante la construcción de la biblioteca puede ajustarse en función de la cantidad de entrada, el rendimiento de la biblioteca y la tasa de duplicación. Diferentes estrategias de selección de tamaño de las perlas magnéticas (véase Tabla de Materiales) pueden emplearse según las PTMs o factores de transcripción de las histonas objetivo.
      1. La construcción de la biblioteca se realizó utilizando el kit de preparación de la biblioteca CUT&RUN (véase Tabla de Materiales) según las instrucciones del fabricante del kit, con pequeñas modificaciones. En resumen, se utilizaron 5 ng de ADN CUT&RUN como inso recomendado para la preparación de la biblioteca. Para ADN inferior a 5 ng, úsalo todo lo posible para la preparación de la biblioteca. Se usaban cebadores dobles de índice i5 e i7 para cada muestra para asegurar un éxito en la secuenciación multiplexada.
         NOTA: Este es un punto de parada seguro. El ADN puede almacenarse a -20°C para su procesamiento posterior.
      2. Mide la concentración de la biblioteca CUT&RUN con un fluorómetro y el kit de ensayo de alta sensibilidad dsDNA. La distribución de tamaño de las bibliotecas NGS CUT&RUN se determinó utilizando el Kit de ADN de Alta Sensibilidad (véase Tabla de Materiales) basado en la Guía del Kit de ADN de Alta Sensibilidad o un instrumento de electroforesis capilar comparable, TapeStation (véase Tabla de Materiales).
         NOTA: Diluir la biblioteca CUT&RUN para situar la concentración dentro del rango de detección del Kit de Ensayo de Alta Sensibilidad dsDNA y del Kit de Alta Sensibilidad de ADN.
      3. Bibliotecas de pool (40-46) basadas en índices moleculares y únicos iguales. Tras la purificación del ADN, la selección del tamaño de las perlas magnéticas, se realizó la secuenciación de extremos emparejados (longitud de lectura de 100 pb) para las bibliotecas agrupadas en un sistema Illumina NovaSeq 6000 para medio S-Prime (SP) a una profundidad de lectura estimada de 10 millones de lecturas por biblioteca.
   6. Análisis de datos CUT&RUN
      1. Analizar datos de CUT&RUN utilizando una tubería personalizada (Figura 5A). Evalúa la calidad de lectura con FastQC. Elimina las secuencias de adaptadores al inicio de las lecturas usando Cutadapt. Alinear las lecturas de extremos pares con el genoma humano (hg38) y el genoma de referencia de E. coli con Bowtie2. Usa Samtools para eliminar lecturas no mapeadas. Elimina lecturas duplicadas con Picard y genera archivos bedGraph usando Bedtools. Crea archivos bigWig (bw) con DeepTools. Visualiza los datos usando IGV y DeepTools. Normalizar el total de lecturas a los conteos de lecturas de E. coli en pico. Realizar llamadas de picos usando SEACR (Análisis de Enriquecimiento Disperso para CUT&RUN⁾¹⁹.

Resultados

Las líneas celulares NE típicas o "clásicas" del SCLC se caracterizan por núcleos grandes, escaso citoplasma y crecimiento como agregados no adherentes o esferoides compactos en suspensión. Las líneas celulares de alto nivel ASCL1, como NCI-H146 y DMS79, y las líneas celulares de NEUROD1 alto, como NCI-H82 y H446, presentan este fenotipo clásico de SCLC: células de tamaño pequeño a mediano con citoplasma escaso, cromatina finamente granular y una tendencia a crecer predominantemente como...

Discusión

La desregulación epigenética y los LDTF son factores clave que impulsan la biología tumoral^{de los SCLC 6}. Determinar la distribución genómica de modificaciones específicas de histonas y proteínas que se unen al ADN en SCLC puede revelar posibles mecanismos de resistencia terapéutica adquirida y plasticidad fenotípica. CUT&RUN-seq es un método potente para mapear las interacciones entre histonas y proteínas-ADN no histonas a alta^{resolución 14}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
reactivo
RPMI-1640 media	Gibco ThermoFisher Scientific	11875093	Medio de cultivo celular
Suero fetal bovino (FBS)	Neurómica	FBS002-HI	Componente del medio de cultivo celular
1% Penicilina-Estreptomicina	Gibco ThermoFisher Scientific	15140122	Antibióticos, para prevenir la contaminación bacteriana de cultivos celulares
Solución azul de tripán, 0,4%	Gibco ThermoFisher Scientific	15250061	Se utilizó la tinción de azul de tripán para evaluar la permeabilidad con un contador celular automatizado.
Roche cOmplete, cóctel inhibidor de Proease sin EDTA	Roche	11873580001	Inhibidor de proteasa. Componentes del tampón de lavado
5% Digitonina y nbsp;	EpiCypher	21-1004	Componentes de búfer   y la receta de Buffer se puede encontrar en la hoja de Buffer
Buffer de activación de cuentas	EpiCypher	21-1001	Componentes de búfer   y la receta de Buffer se puede encontrar en la hoja de Buffer
Cuentas de concanavalina A (ConA)	EpiCypher	21-1401	Las microesferas paramagnéticas conjugadas con ConA son perlas magnéticas recubiertas de lectinas que permiten la unión a la membrana lipídica
CORTAR & RUN Kit	EpiCifrado del ChIC de CUTANA	14-1048	Reactivos para CUT y CUT Generación de ADN en RUN
Kit de purificación de ADN	CUTANA  EpiCypher	14-0050	Extraer ADN de los fragmentos de ADN objetivo liberados en el supernante del reactor
CORTAR & Kit de preparación para la biblioteca RUN	EpiCifrado de CUTANA	14-001	Generar el CUT& EJECUTA las bibliotecas de secuenciación de próxima generación (NGS)
Purificación de ADN Perlas magnéticas	Agencourt AMPure XP Beckman Coulter	A63880	Limpieza de productos PCR y selección de tamaño (es decir, retirada del adaptador dimer y cebador)
ADN de espina de E. coli	EpiCypher	18-1401	Usado como un spik-in exógeno para calibrar lecturas de secuenciación a través de una serie de muestras— por ejemplo, condiciones tratadas frente a condiciones no tratadas
pAG-MNasa	EpiCypher	15-1016	Al unirse al anticuerpo primario, la enzima parte el fragmento de ADN objetivo a ambos lados de la proteína unida cuando se activa con calcio
PBS PH7.4 1x	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10010-049	Lavado de celdas
Amortiguador de prelavado	EpiCypher	21-1002	Componentes de búfer   y la receta de Buffer se puede encontrar en la hoja de Buffer
dsDNA Alta Sensibilidad   Kit de ensayo	QubitTM Thermo Fisher Scientific	P32854	CORTAR & Cuantificación del ADN RUN
Amortiguador de parada	EpiCypher	21-1003	Componentes de búfer   y la receta de Buffer se puede encontrar en la hoja de Buffer
Kit de ADN de Alta Sensibilidad	Tecnoligías Agilent	5067-4626	CORTAR & Cuantificación de bibliotecas de ADN y NGS de RUN y análisis de distribución de tamaño de fragmentos
Material
Tubos PCR de 8 tiras de 0,2 mL	EpiCypher	10-0009k	Tubos para CUT & RUN Reaction compatibles con el Magnetic Separation Rack de tubos de 0,2 ml
Diapositivas LUNA de 8 canales	Logos BioSystems INC	L72001	Diapositivas para contar celdas,   Comprobación de viabilidad e integridad de las células
Reservorio de reactivos multicanal	Fisher Scientific	14-387-072	Contenedor de tampón de lavado
DynaMagTM-2 (Rack de separación magnética), tubos de 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	12321D	Las perlas de ConA se aislaban de su buffer de almacenamiento mediante una barra de separación magnética y posteriormente se activaban mediante resuspensión en buffer de activación en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
Bastidor de separación magnética, tubos de 0,2 mL	EpiCypher	10-0008	Ponerse a separar  células que se unen a las perlas, anticuerpos, pAG/MNasa de la reacción y de los tampones de lavado
Eppendor Research más la pipeta de 8 canales, 0,5-10 uL	Eppendorf	3125000010	Muestras de tubos de aspiración de 8 tiras   Para acelerar el flujo de trabajo, pipettor multicanal comparable
Pipeta Eppendorf Refrence 2 de 8 canales, 30-300 uL	Eppendorf	4926000050	Pasos de aspiración y lavado para acelerar el flujo de trabajo, pipetador multicanal comparable
Equipo
Mezclador Vortex-Genie 2 de Scientific Industries, velocidad variable, 120V	Fisher Scientific	50-728-002	Min-centrífuga y spin
Contador automático de celdas LUNA FX7	Logos BioSystems INC	L70001	Contador de celdas
Mezclador de nutación	VWR	82007-202	Pasos de incubación de las perlas (incubación nocturna de anticuerpos, reacción de digestión de pAG-MNasa).
Eppendorf 6331 Nexus Gradient MasterCycler Thermal Cycler	Eppendorf	6331	CORTAR & Construcción de bibliotecas de próxima generación de RUN
Fluorómetro Qubit 4	Thermo Fisher Scientific	P33226	Cuantificación del ADN.
Bioanalizador Agilent 2100	Agilent Technologies	G2939A	Tamaño de fragmento, análisis de concentración para CUT y EJECUTA ADN Y CORTES & RUN, BIBLIOTECAS,   instrumento de electroforesis capilar comparable (por ejemplo, Agilent TapeStation)
Agilent TapeStation	Agilent Technologies	G2992AA	Tamaño de fragmento, análisis de concentración para CUT y EJECUTA ADN Y CORTES & Bibliotecas RUN
Sistema Illumina NovaSeq 6000	Illumina, San Diego, CA, EE. UU.		Secuenciación del CUT y CUT agrupado RUN LIBRARIES