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Artículo de investigación

Regulación de la vía AKT/Wnt/β-catenina e inducción de la cuproptosis por curcumina en el glioblastoma

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DOI:

10.3791/69663

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27 de enero de 2026

 , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Yangtze University

En este artículo

Resumen

La curcumina (CUM) inhibe la progresión del glioblastoma (GBM) induciendo la cuproptosis mediante la supresión del eje AKT/Wnt/β-catenina. Este protocolo investiga el mecanismo molecular por el cual el CUM impide la progresión maligna en la GBM y describe métodos para evaluar cómo el CUM induce la cuproptosis modulando esta vía.

Resumen

La curcumina (CUM) puede regular el comportamiento maligno del glioblastoma (GBM). Este estudio investiga si el CUM suprime la progresión del GBM induciendo la cuproptosis a través de la vía de señalización AKT/Wnt/β-catenina. Las concentraciones óptimas de curcumina se determinaron mediante el ensayo MTT. Las células A172 y U251 fueron tratadas con CUM, inhibidor de AKT MK-2206, inhibidor de Wnt LGK974 y Elsm-Cu (Elesclomol +CuCl 2). La proliferación, migración, invasión y apoptosis celular se evaluaron utilizando tinción con aminoésteres de succinimidil de carboxifluoresceína, ensayos scratch, ensayos de Transwell y citometría de flujo, respectivamente. Se utilizaron fluorescencia MitoSOX, análisis metabólico de caballitos de mar, inmunofluorescencia, detección de Cu2+ y Western blot para evaluar el estrés oxidativo mitocondrial y la cuproptosis. El eje AKT/Wnt/β-catenina se analizó utilizando un kit de reportero TCF/LEF1 y western bloting. Se estableció un modelo de xenoinjerto de GBM y se administró CUM por gavage durante cinco semanas. Se evaluaron los efectos del CUM sobre el crecimiento tumoral, la cuproptosis y la expresión de proteínas de la vía AKT/Wnt/β-catenina. Las células fueron tratadas con 10 μM y 20 μM de CUM in vitro. El tratamiento con CUM redujo la proliferación, migración e invasión, al tiempo que promovía el estrés oxidativo y la cuproptosis. El CUM también suprimía la actividad de señalización Wnt/β-catenina. La inhibición de las vías aumentó los niveles de especies reactivas de oxígeno (3,7 veces) y de Cu2+ (3,1 veces), y disminuyó la expresión de la dihidrolipoamida acetiltransferasa, restringiendo así el comportamiento maligno. En ratones desnudos, el CUM redujo significativamente el crecimiento tumoral, promovió la cuproptosis e inhibió la activación del eje AKT/Wnt/β-catenina. Nuestros resultados indican que el CUM suprime la señalización de AKT/Wnt/β-catenina, promueve la cuproptosis e interfiere con la progresión del GBM.

Introducción

El glioma es el tumor maligno intracraneal primario más prevalente en el sistema nervioso central (SNC)1. El glioma de grado 4 suele referirse a glioblastoma (GBM), con unpronóstico 2 deficiente. La GBM es un tumor cerebral altamente invasivo, que representa casi el 50% de las malignidades del SNC, con una supervivencia media inferior a 1año 3. Es conocida por su alta malignidad y alta tasa derecurrencia 4,5. Actualmente, las estrategias de tratamiento de la GBM se basan principalmente en la cirugía, complementada con radioterapia, quimioterapia y otros métodos de tratamientointegrales. Aunque estrategias terapéuticas emergentes como la inmunoterapia, la bioterapia y la nanomedicina han logrado resultados notables en estudiospreclínicos7,8, la tasa global de supervivencia a 5 años sigue siendo solo del 4,3%. El régimen de quimioterapia más utilizado es el conocido régimen Stupp; sin embargo, en pacientes con GBM y MGMT no metilada, la tasa global de supervivencia no se prolongasignificativamente 10. Por lo tanto, explorar nuevas estrategias de tratamiento es clave para prolongar el periodo de supervivencia de los pacientes. Esta investigación plantea la hipótesis de que el mecanismo anticancerígeno de la curcumina (CUM) en el GBM implica la cuproptosis.

El metabolismo anormal del cobre o el daño celular inducido por el cobre pueden provocar una serie de enfermedades11. En condiciones redox convencionales, el Cu+ reducido puede oxidarse a Cu2+. Tsvetkov et al. encontraron un mecanismo previamente desconocido de muerte celular inducida por el cobre, llamado cuproptosis. Los iones Cu2+ se unen a compuestos acilados y, a la continuación, la expresión de proteínas de racimos Fe-S se reduce a la normalidad, causando la muerte celular12,13. Investigaciones extensas han confirmado que la cuproptosis está estrechamente asociada con el proceso fisiopatológico de lostumores 14,15. Los ARNCn y genes relacionados con la cuproptosis representan posibles biomarcadores para el pronóstico y tratamiento de laGBM 16. La BCMD puede liberar Cu2+, inducir cuproptosis y desencadenar la muerte celular inmunogénica para tratar elGBM 17. Por ello, creemos que la cuproptosis puede utilizarse como un nuevo objetivo para la terapia con GBM. Sin embargo, la mayoría de los esquemas existentes dependen de portadores sintéticos como Elesclomol-Cu o la inducción directa de iones de cobre de alta concentración. Aunque esta intervención drástica y exógena puede demostrar el concepto de cuproptosis, sus perspectivas de transformación clínica son limitadas debido a la falta de correlación fisiológica y de objetivo. Por ello, la búsqueda de compuestos naturales o de moléculas pequeñas que puedan regular endógenamente y con precisión la cuproptosis de la GBM y esclarecer su mecanismo de señalización ascendente se ha convertido en un puente clave entre este novedoso mecanismo y el tratamiento clínico.

La medicina china ha sido ampliamente considerada un recurso valioso para la investigación de fármacos antitumorales. El CUM es una sustancia polifenólica extraída de la cúrcuma de la medicina tradicional china. La farmacología moderna ha confirmado que tiene funciones antioxidantes, antiinflamatorias y antitumorales. El CUM tiene muchas actividades antitumorales. Puede reducir la actividad de las células GBM promoviendo la apoptosis, la alteración de las vías multimoleculares y otrosmecanismos 18. Los experimentos in vitro han demostrado que la baja dosis de CUM combinada con irradiación puede potenciar sinérgicamente la proliferación deantiGBM 19. Además, CUM puede regular las vías centrales relacionadas con GBM, incluyendo MAPK20. En comparación con la quimioterapia tradicional de temozolomida (TMZ), el CUM muestra ventajas terapéuticas únicas. La eficacia de la temozolomida suele estar limitada por los potentes mecanismos de reparación del ADN en el GBM, lo que resulta en resistencia a los fármacos; el mecanismo por el cual el CUM induce la cuproptosis al dirigirse al metabolismo mitocondrial21,22 es independiente de la TMZ. La CUM no solo puede regular los procesos metabólicos relacionados con la cuproptosis, sino que también interferir simultáneamente con múltiples vías clave de señalización relacionadas con la progresión de la GBM, proporcionando posibles vías para superar las limitaciones de terapias individuales y desarrollar estrategias de tratamiento combinadas. El rango de concentraciones de CUM utilizado en este estudio (10-20 μM) es consistente con las concentraciones efectivas reportadas en los estudios de tratamientopreclínico 23. Aunque la inherente baja biodisponibilidad oral del CUM y su eficiencia de entrega a través de la barrera hematoencefálica son desafíos clave en aplicaciones prácticas, los sistemas emergentes de nano-administración y las estrategias de modificación dirigida han proporcionado soluciones prometedoras para superar este cuellode botella 24.

Aunque los efectos proapoptóticos, antiproliferativos e inhibidores de la migración del CUM en el GBM han sido reportados por muchosestudios, la mayoría de la investigación existente se ha centrado en sus efectos sobre las vías tradicionales de apoptosis o autofagia. Este estudio pretende aclarar si el CUM inhibe la progresión maligna de la GBM al regular la cuproptosis. Investigamos si el CUM puede inducir la cuproptosis en parte mediante la supresión del eje AKT/Wnt/β-catenina, suprimiendo así la GBM. A partir de esto, este estudio proporciona bases experimentales para que la CUM mejore el tratamiento de la GBM y desarrolle nuevos objetivos en la terapia con GBM.

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Protocolo

Todos los procedimientos animales se realizaron en cumplimiento de los estándares institucionales establecidos para el cuidado y uso humanitario de animales de laboratorio y fueron aprobados formalmente por el Comité de Ética Animal de la institución. Se tomaron medidas para reducir las molestias y el malestar de los animales siempre que fuera posible.

El trabajo que involucraba compuestos químicos, colorantes y muestras biológicas siguió las prácticas establecidas de bioseguridad para mitigar los riesgos potenciales. Las sustancias potencialmente peligrosas —incluyendo paraformaldehído, reactivos a base de cobre y DHE— se manipularon con el equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes, mascarillas y gafas de seguridad. Todos los materiales de desecho, como reactivos usados y artículos desechables contaminados, se segregaron en recipientes designados para riesgos biológicos y posteriormente fueron tratados por servicios autorizados de gestión de residuos peligrosos conforme a las normativas institucionales y de seguridad ambiental. El diseño experimental general se describe en la Figura 1.

Figura 1
Figura 1: El flujo de trabajo de este estudio. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Cultivo celular y agrupación
Los astrocitos cerebrales humanos (NHA) normales y las líneas celulares de glioblastoma A172, U251, LN229 y SHG-44 (véase Tabla de Materiales) se cultivaron en un medio DMEM que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS) y se mantuvieron en incubadora a 3 °C con un 5% de CO₂. El medio se cambiaba día sí y día no, y las células se trasladaban cuando alcanzaban aproximadamente el 80% de confluencia. La dosis adecuada y el tiempo de exposición para CUM se determinaron mediante el ensayo MTT. Las células NHA, A172, U251, LN229 y SHG-44 fueron tratadas con diferentes concentraciones (0, 2,5, 5, 10, 20 y 4 μM) de CUM durante 24, 48 y 7 horas, respectivamente23. Después, se añadieron 2 μL de solución MTT. Después de la h, se añadieron 15 μL de dimetilsulfóxido a cada pozo y se mezclaron suavemente. La densidad óptica (OD) a 45 nm se midió usando un lector de microplacas. Las células no tratadas (grupo de control) se utilizaron como controles negativos en todos los experimentos.

Las células A172 y U251 se sembraron y dividieron en grupos: Control, CUM de baja dosis (1 μM), CUM de dosis alta (2 μM), inhibidor de AKT (MK-2206), inhibidor de AKT + inhibidor de Wnt (MK-2206 + LGK974) y Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl₂), según las condiciones de tratamiento. Las células de los grupos CUM fueron tratadas con 10 o 2 μM de CUM durante 4 horas. Las células del grupo MK-2206 recibieron 1 μM de MK-2206 durante 2 horas. Las células del grupo MK-2206 + LGK974 fueron tratadas con μM LGK974 para h tras la exposición a MK-2206. Las células del grupo Elsm-Cu fueron tratadas con 100 nM de Elesclomol y μM CuCl₂ durante 4horas 14.

Citometría de flujo
Las células cultivadas de A172 y U251 en cada grupo se incubaron con PBS que contenía 1 μg/mL de solución de tinción PI durante 1 minuto. Las células se trataron con tripsina al 0,25% y se recogieron mediante centrifugación (20 × g, mínimo, a temperatura ambiente). Se detectaron células PI-positivas usando un citómetro de flujo con canal PE (excitación a 488 nm), y se calculó la tasa de muerte celularen 27.

Ensayo de aminoéster succinimidil (CFSE) de carboxifluoresceína (CFSE)
Las células A172 y U251 fueron incubadas con el colorante CFSE μmol/L CellTrace a 3 °C durante 1 minuto en la oscuridad. El medio se neutralizaba y las celdas se centrifugaban a 20 × g durante un mínimo a temperatura ambiente. Tras la recolección, las células se cultivaron y trataron según sus agrupaciones. La intensidad de fluorescencia CFSE se analizó utilizando citometría de flujo (excitación a 488 nm)27.

Ensayo de formación de clones celulares
Las células cultivadas de A172 y U251 fueron digeridas, resuspendidas y contadas. Se añadieron dos mililitros de la suspensión de celda preparada. Tras una mezcla suave, las células se incubaron durante aproximadamente 14 días. Luego se fijó las células con paraformaldehído al 4% durante 3 minutos y se descartó el fijador. Después de teñir con un 0,1% de violeta cristalino. Se capturaron imágenes de la colonia y se calculó la tasa de formación de clonesen 14.

Prueba de rayado celular
Las células A172 y U251 (1 × 106 células/pozo) se cultivaron hasta alcanzar una confluencia del 90%. La monocapa celular se rayó una vez usando una punta estéril de 2 μL para crear una herida y luego se trató con diferentes concentraciones de SEMEN para h y 48 h. Las imágenes se capturaron con un microscopio. La tasa de curación por arañazos se evaluó usando el software ImageJ. Las imágenes se convirtieron a formato de 8 bits, se estableció un umbral unificado para distinguir el área de rayado del área de la celda, y las áreas de rayado en 0 h y 48 h se calcularon usando la función Analizar Partículas . Tasa de curación por arañazos (%) = (0 h distancia − 48 h de distancia) / 0 h distancia × 100%23.

Experimento Transwell
Las células A172 y U251 fueron expuestas a los tratamientos especificados, luego se desprendieron enzimáticamente y centrifugaron a 200 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células se resuspendieron en un medio libre de suero. Matrigel se diluyó en una proporción 1:8 en un medio sin suero, se mezcló a fondo, y se aplicó 5 μL en la cámara superior de un inserto Transwell, seguido de una incubación de 4 horas. En total se añadieron 5 × 104 celdas por pozo a la cámara superior, mientras que 60 μL de medio suplementado con un 20% de FBS se colocaron en la cámara inferior. Tras 48 horas de incubación, las células se fijaron usando paraformaldehído y se teñieron con violeta cristalino. Se seleccionaron cinco campos visuales del centro y la periferia de cada pozo. Se observaron y analizaron las células bajo un microscopio. Las células invasoras se calcularon usando ImageJ. Las imágenes se convirtieron a formato de 8 bits, se aplicaron umbrales para distinguir las células teñidas del fondo, y la función Analizar Partículas contó las células que habían migrado a través de lamembrana 23.

Detección de potencial de membrana mitocondrial (MMP)
Las células cultivadas de A172 y U251 de cada grupo fueron incubadas con mL de solución de trabajo de JC-1 durante 30 minutos en la oscuridad. Las células se lavaban suavemente con un tampón JC-1 preenfriado, se observaban y se fotografiaban con un microscopio de fluorescencia. Utilizando excitación de 488 nm, se recogieron señales de polímero y monómero JC-1 utilizando filtros de emisión de 590 nm y 530 nm, respectivamente. La proporción de fluorescencia rojo/verde (agregados JC-1 a monómeros) se analizó utilizando el software ImageJ para evaluar los cambios deMMP 28. Se extrajeron imágenes de los canales rojo y verde por separado, y se cuantificó la intensidad media de fluorescencia en la misma región.

Detección de la tasa de consumo de oxígeno (OCR)
Se siembraron células cultivadas de A172 y U251. La placa se colocó en un analizador precalentado a 3 °C para su adaptación. Una vez adaptado, se añadió el medio de determinación. Tras la calibración automática, la placa se equilibró durante 15-2 minutos a 3 °C sinCO2. Se midió la OCR inicial y el programa de ensayo se configuró para registrar la OCR mitocondrial a intervalos definidos. Los datos se exportaron para análisisposteriores 28.

Detección por sonda fluorescente MitoSOX de especies reactivas de oxígeno (ROS)
Las células A172 y U251 se ajustaron a una densidad de 1 × 104 células/mL, y se sembró 1 mL por pozo en una placa confocal y luego se realizó la intervención farmacológica. Se descartó el sobrenadante de la celda y se añadió 1 mL de sonda MitoSOX diluida (1:1.000). Las células se incubaron en la oscuridad a 3 °C durante 1 minuto. La señal de fluorescencia se capturó utilizando un microscopio de fluorescencia (excitación/emisión: 510/580 nm) para evaluar los niveles de ROSmitocondrial 29.

Inmunofluorescencia
Las cubiertas se lavaron una vez con medio de cultivo DMEM. Luego se colocaban en placas de seis pozos para la siembra celular e intervención farmacológica. Tras 24 horas, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% y posteriormente se bloquearon con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% durante 30 minutos. Se retiró la solución bloqueante y se aplicaron anticuerpos primarios diluidos dirigidos a la dihidrolipoamida acetiltransferasa (DLAT) y β-catenina, seguidos de una incubación nocturna a °C 30. Luego se introdujeron anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia e incubaron a 3 °C durante 30 minutos. Los núcleos celulares se contrateñieron con DAPI y las láminas se montaron usando un reactivo antifade. Las imágenes de fluorescencia se capturaron usando un microscopio de fluorescencia y la intensidad de la señal se cuantificó con el software ImageJ. Las imágenes se convirtieron a formato de 8 bits y se aplicó un umbral consistente para distinguir las señales objetivo del ruido de fondo. Se utilizó la herramienta Rectangle para seleccionar las regiones celulares deseadas, y se midió la intensidad media defluorescencia en 27. Para visualizar las mitocondrias, las células se trataron con MitoTracker Red CMXRos de 20 nM durante 30 minutos y luego se fijaron con paraformaldehído30.

Kit de reportero luciferasa TCF/LEF1
La activación Wnt/β-catenina en células A172 y U251 se evaluó utilizando un kit de reportero de luciferasa TCF/LEF1. El vector reportero TCF/LEF contiene una caja TATA y elementos de respuesta del factor de células T/factor potenciador linfónico (TCF/LEF), lo que permite la detección indirecta de la actividad transcripcional de la β-catenina mediante la expresión de proteínas fluorescentes verdes (GFP). Las células A172 y U251 cultivadas fueron transfectadas inversamente con vector reportero TCF/LEF de 5 ng. Dieciséis horas después de la transfección, la intensidad de fluorescencia se registró utilizando un microlector de placas con ajustes de excitación y emisión de 488 y 51 nm, respectivamente31.

Ratones con tumores
Diez ratones machos BALB/c desnudos (7 semanas, 2 ± 2 g) fueron mantenidos bajo condiciones específicas libres de patógenos (2 °C, 65% de humedad) con acceso sin restricciones a comida y agua estándar. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Revisión Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad del Yangtsé (nº 2023092; fecha de aprobación: 18.10.2023).

Para establecer un modelo de xenoinjerto GBM, se suspendieron células A172 (4 × 106 células/mL) en un medio libre de suero, y se inyectaron 0,1 mL subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón. Los animales fueron asignados aleatoriamente a un grupo de control o a un grupo de tratamiento con CUM (n = 5 por grupo). El grupo CUM recibió 60 mg/kg de curcumina diaria vía gavage oral, mientras que el grupo Control recibió un volumen igual de suero. Los diámetros tumorales se registraron cada 7 días usando un calibrador vernier, y el volumen tumoral se calculó usando la fórmula 1/2 × longitud ×anchura 2 (mm3). Tras 5 semanas, los ratones fueron eutanasiados por luxación cervical y se extrajeron tumores en condiciones estériles para medirel peso 32.

Ensayo TUNEL
Los tejidos tumorales se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 24 horas, deshidratados en etanol, incrustados en parafina y seccionados a μm de espesor. Las secciones se desenceraron y rehidrataron, se enjuagaron con PBS, se trataron con proteinasa K durante 50 minutos para la extracción de antígenos y se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3%. Se aplicó la mezcla de reacción TUNEL durante 1 hora, seguida de montaje con un reactivo antifade. Se adquirieron imágenes de fluorescencia mediante microscopía y las células TUNEL-positivas por campo se cuantificaron usando el software ImageJ.

Inmunohistoquímica
Las secciones tumorales incrustadas en parafina se hornearon a 6 °C, se deceraron en xileno y se rehidrataron mediante una serie graduada de etanol. La recuperación de antígenos se realizó utilizando un tampón EDTA calentado, seguida de la atenuación de la actividad endógena peroxidasa. Las láminas se incubaron con anticuerpo primario anti-Ki-67 durante la noche a °C. Tras la incubación con un anticuerpo secundario durante 20 minutos, se tiñeron secciones con diaminobenzidina (DAB) durante 5 minutos y contra-tinciones con hematoxilina. Tras la deshidratación y el montaje con resina neutra, se tomaron imágenes de las láminas bajo el microscopio. Se identificó tinción positiva mediante precipitado marrón-amarillento, y las células Ki-67-positivas se cuantificaron usando ImageJ27.

Tinción por fluorescencia con dihidroetidio (DHE)
Los niveles de ROS se evaluaron mediante tinción de fluorescencia con DHE. Las secciones congeladas de tejido tumoral se enjuagaron con PBS. Se apagó la fluorescencia de fondo y se añadió μM DHE a cada sección durante 3 minutos. Tras el lavado con PBS, las secciones se sellaron en la oscuridad. Se observó fluorescencia con microscopio (excitación/emisión: 518/605 nm), y se recogieron cinco imágenes aleatorias por grupo. ImageJ se utilizó para cuantificar los niveles de ROS.

Detección de contenido con2+
La concentración de Cu2+ en células GBM y tejidos tumorales se evaluó utilizando un kit de detección colorimétrica. Las células A172 y U251, tras el tratamiento, se extrajeron y centrifugaron a 1.500 × g durante 10 minutos a °C. Los pellets celulares se resuspendieron en 0. mL de agua destilada, sonicada sobre hielo y centrifugada de nuevo. Los tejidos tumorales se homogeneizaron en agua destilada y se centrifugaron de forma similar a 4 °C durante 10 minutos. Los supernadantes (1 μL) se transfirieron a una placa de 96 pozos, mezclados con 23 μL de reactivo cromogénico, sellados e incubados durante 5 minutos. La densidad óptica (OD) se midió en 58 nm usando un lector de microplacas, y se calcularon niveles de Cu2+ en 14.

Western Blot (WB)
Se aislaron proteínas de células cultivadas y tejidos tumorales. Los supernadantes se obtuvieron mediante centrifugación a 12.000 × g durante 15 minutos a 4 °C, y las concentraciones de proteínas se cuantificaron mediante un ensayo BCA. Tras la desnaturalización, las muestras se separaron con SDS-PAGE, se transfirieron a membranas PVDF y se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 1 hora. Las membranas se lavaron en TBST e incubaron durante la noche a °C con anticuerpos primarios contra FDX1, LIAS, DLAT, DLD, AKT, p-AKT, Wnt3a, GSK-3β, p-GSK-3β, β-catenina, p-β-catenina y β-actina (véase la Tabla de Materiales)14,33. Tras lavados adicionales de TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora, desarrolladas usando reactivo ECL y visualizadas mediante quimioluminiscencia. El software ImageJ se utilizó para cuantificar la intensidad de la señal utilizando la herramienta de selección de rectángulos y la función de análisis de geles. La expresión relativa de proteínas se calculó como la relación entre el valor gris de la banda objetivo y el control interno (GAPDH). Se prepararon extractos nucleares de células A172 y U251 utilizando un kit de extracción de proteínas nucleares. Se evaluó la expresión de β-catenina y Lamin B1, con Lamin B1 como control de carganuclear 34.

Análisis estadístico
Los resultados cuantitativos reflejan la media de tres réplicas independientes. Todos los datos se evaluaron para determinar la distribución normal y la homogeneidad de la varianza. Se utilizó ANOVA unidireccional seguida de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones entre varios grupos. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DS). Se consideró estadísticamente significativo un valor P inferior a 0,05. Estos procedimientos se utilizaron para garantizar la robustez de los datos y apoyar la fiabilidad de las conclusiones.

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Resultados

Inhibición de la viabilidad celular GBM y muerte celular inducida
En primer lugar, no hubo un cambio significativo en la viabilidad de las células NHA tras 2 horas, 48 horas y 72 horas de intervención con CUM (Figura 2A), lo que indica que las concentraciones de CUM utilizadas no tuvieron efecto tóxico sobre las células normales. En cambio, la viabilidad de las líneas celulares de GBM (A172, U251, LN229 y SHG-44) se redujo significativamente a concentraciones de CUM ≥ 1 μ...

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Discusión

La tasa de recurrencia de la GBM está asociada con sus características biológicasmalignas 36. El CUM ejerce efectos anti-GBM regulando el estrés oxidativo, la apoptosis, la autofagia, la metástasis, la invasión y los principales objetivosmoleculares 37. En este estudio, experimentos a nivel celular demostraron que el CUM aumentó significativamente la mortalidad celular del GBM e inhibió la proliferación, formación de colonias, migración e i...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de tinción de violeta cristalino al 0,1%ServicebioG1014Celdas de marcado
4% de paraformaldehídoBeyotimeP0099Reparar células o tejidos
Inhibidor de AKT (MK-2206)Selleck.cn, Shanghái, ChinaS1078Inhibidor específico de AKT
Anticuerpos (anticuerpos primarios y secundarios)Tecnología ABclonal, Wuhan, China / abcam, Cambridge, Reino Unido / Servicebio, Wuhan, China / Beyotime, Shanghái, China / Señalización Celular, Danvers, MA, EE.UU.A8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025Detección de los niveles de expresión proteica
Kit de detección de apoptosis celularServicebio, Wuhan, ChinaG1021Detección de apoptosis
Tinte Cell Trace CFSEInvitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.C34570Detección de proliferación celular
Sistema de imagen quimioluminiscenciaBio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.Chemi Doc XRS+Detección de ultra alta sensibilidad de proteínas
Kit de ensayo colorimétrico Cu2+Elabscience, Wuhan, ChinaE-BC-K300-MDetección de contenido de Cu2+ en tejidos tumorales y células GBM
CuCl2Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania751944Inductor de cuproptosis
Curcumina (CUM)Hoja fuente de Shanghái, Shanghái, ChinaS19245Compuesto polifenólico
Kit de detección DHEBeyotime, Shanghái, ChinaS0063Detección de niveles ROS
Dimetilsulfóxido (DMSO)ServicebioG4101-2Disolvente para el ensayo MTT
Desarrollador ECLServicebioG2161Uso para Western blot
ElesclomolSelleck.cnS1052Inductor de cuproptosis
Citometría de flujoBD Biociencias, Nueva Jersey, EE. UU.BD FACSAria IIIUtilizado para ensayos de muerte celular y CFSE
Microscopio de fluorescenciaOLYMPUS, Tokio, JapónIX73Utilizado para ensayos de inmunofluorescencia, ROS, TUNEL, DHE y MMP
Líneas celulares de glioblastoma A172 (RRID: CVCL_0131), U251 (RRID: CVCL_0021), LN229 (RRID: CVCL_0393) y SHG-44 (RRID: CVCL_6902)Punosai Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, ChinaCL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207Líneas celulares de glioblastoma humano
Software GraphPad Prism 9.0GraphPad Software, LLCVersión 9.0Análisis estadístico
Software ImageJ 1.53kInstituto Nacional de Salud MentalVersión 1.53kCálculo estadístico
Solución funcional JC-1Solarbio, Pekín, ChinaM8650Detección de MMP
Ratones machos BALB/c desnudosSlack Kingda Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, ChinaExperimento con ratones
Lector de microplacasBio-Tek, Vermont, EE. UU.ELX-800Para la medición del valor OD450 nm
MicroscopioOLYMPUSBX53Utilizado para pruebas de rayado celular, experimento de Transwell y ensayos de inmunohistoquímica
Sonda MitoSOXThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.M36008Utilizado para la detección de ROS
Mitotracker Red CMXRosThermo Fisher ScientificM7512Marcado específico de mitocondrias en células vivas
Kit de detección de MTTServicebioG4101-1Detección de la viabilidad celular
Células normales de astrocitos cerebrales humanos (RRID:CVCL_B0DK)Huatuo Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, ChinaHTX2408Línea celular para experimentos de control
Kit de extracción de proteínas nuclearesBeyotimeP0027Extracción de proteínas nucleares
Analizador de metabolismo energético de células de caballito de marAgilent,   Pekín, ChinaSeahorse XFUtilizado para la detección de OCR
Kit de reportero luciferasa TCF/LEF1Biolab Technology Co., Ltd, Pekín, ChinaDetección de la actividad de la vía de señalización Wnt/β-catenina
Kit de detección TUNELBeyotimeC1088Detección de apoptosis en tejidos tumorales
Inhibidor de Wnt (LGK974)Selleck.cnS7143Inhibidor específico de Wnt

Referencias

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