Validación del sistema de presión hiperbárica con anestesia de xenón para Drosophila melanogaster

Resumen

Los gases que parecen inofensivos a presión atmosférica pueden inducir comportamientos como la narcosis en condiciones hiperbáricas. Las cámaras de presión hiperbáricas convencionales son costosas y requieren mucho trabajo. Este estudio presenta un método sencillo y de bajo coste para examinar los efectos del xenón sobre Drosophila melanogaster a presiones moderadas por debajo de 4 atm.

Resumen

En condiciones hiperbáricas, las concentraciones elevadas de los gases ambientales pueden provocar una variedad de respuestas conductuales en varios animales. Una parte sustancial de estos comportamientos representa cambios en estados cognitivos que aún se entienden poco. Un ejemplo notable es la anestesia general. El efecto conductual de varios gases bajo condiciones hiperbáricas en anestesia general, o narcosis, ha sido una investigación científica de larga duración, a pesar del uso abrumadoramente frecuente de estos fármacos en medicina. El xenón, clasificado como gas noble y agente anestésico, se considera una de las opciones más seguras para la anestesia general en humanos. Sin embargo, no anestesia las moscas en condiciones normobáricas. Aquí establecimos un montaje experimental sencillo que aumenta la presión ambiente hasta ~3 atm, y permite el estudio de la anestesia con xenón en uno de los organismos modelo más populares, Drosophila melanogaster. Este montaje experimental facilita además el estudio de otros gases y su efecto en condiciones hiperbáricas.

Introducción

Los dos extremos extremos de los efectos conductuales que se han observado en animales bajo condiciones hiperbáricas son la convulsión por oxígeno y la narcosis por nitrógeno ^1,2. Curiosamente, se han reportado deterioros cognitivos como alucinaciones y deterioros de la memoria con valores de presión de nitrógeno e hidrógeno antes del nivel de^{inconsciencia 3,4}. Se ha reportado anestesia inducida por xenón, kriptón y óxido nitroso en condiciones hiperbáricas antes^{de 5,6}.

La anestesia general es tanto una piedra angular de la medicina como un fenómeno de considerable interés científico. A pesar de su uso prolongado y generalizado, nuestro conocimiento sigue siendo limitado sobre cómo exactamente algunos químicos inducen la ausencia temporal de movimiento, memoria, dolor y^{conciencia 7}. El xenón, siendo un gas noble, podía ser designado como el miembro más peculiar entre los agentes anestésicos. Se considera una opción segura para la anestesia, ya que ofrece inducción y recuperación rápidas, mínima alteración fisiológica y solo efectos secundarios leves como náuseas^{postoperatorias 8,9}.

Dada la importancia médica de la anestesia y las propiedades químicas inusuales del xenón, este estudio tiene como objetivo investigar la anestesia inducida por xenón utilizando el modelo animal simple Drosophila melanogaster. Se han realizado diversos estudios de investigación utilizando moscas de la fruta para estudiar la anestesia general, con muchas propuestas de sistemas y el uso de diversos anestésicos^volátiles 10,11,12,13. Sin embargo, no se ha reportado anestesia con xenón en Drosophila. En condiciones normobarias, el xenón no induce anestesia en Drosophila melanogaster, comúnmente conocida como moscas de la fruta. Para abordar esta limitación, este estudio ofrece un sistema hiperbárico que permite la manipulación controlada de la presión ambiente entre 1 atm y aproximadamente 4 atm. Se han realizado varios estudios que utilizan cámaras hiperbáricas para responder a curiosidades similares^14,15. Sin embargo, la mayoría de las cámaras hiperbáricas comerciales se benefician de materiales resistentes y a prueba de fugas, pero tienen un alto volumen (~3 L) y son sistemáticamente complicadas de operar y caras. En cambio, el método descrito en este artículo es sencillo y económico, permitiendo explorar los efectos de diversos gases y sus combinaciones. Proporciona un entorno adecuado para modelos animales pequeños como D. melanogaster y C. elegans.

Protocolo

1. Preparación de Drosophila melanogaster

1. Recoge 20 moscas hembras y 20 machos de edad 1-3 días para cada experimento usando CO₂.
2. Reposar las moscas seleccionadas en un vial con comida durante al menos 24 horas antes del experimento a una temperatura de ~22 °C.

2. Administración de anestesia

1. Transfiere los gases de sus cilindros de contenedor a las bolsas de gas a prueba de fugas para uso experimental. Para la transferencia directa de gas del recipiente a las bolsas, utiliza tubos de silicona.
2. Acopla un tubo de silicona de 25 mm (3,4 mm de diámetro) a la jeringuilla de polipropileno. Luego conecta la jeringuilla de polipropileno a las bolsas de gas y al grifo de tres vías. Para mayor claridad, la jeringuilla de polipropileno se denominará jeringuilla #1 en el resto del texto.

3. Montaje del montaje hiperbárico (Figura 1)

1. Coloca la mesa de luces LED en orientación horizontal sobre la mesa (borde largo horizontal respecto a la superficie de la mesa).
2. Coloca la bomba de inyección junto a uno de los lados cortos de la mesa de luces LED, asegurando que la orientación de la bomba permita que la jeringuilla experimental sobresalga por encima de la retroiluminación.
3. Localiza la cámara por encima del montaje para cubrir la zona donde se encuentra la jeringuilla experimental.
4. Corta un tubo de silicio de 75 mm de largo (3,4 mm de diámetro). Conecta la toma de tres vías al manómetro usando el tubo de silicona de la boquilla central.
5. Utiliza abrazaderas de muelle de manguera en la boquilla desde el lateral del manómetro y el grifo de tres vías para asegurarte de que el tubo esté bien ajustado.
6. Utilizando el botón marcado por una flecha doble en la unidad de control de la bomba de inyección, se ajusta la velocidad a 80 mm/m y la duración a 38 s para la compresión o descompresión automática del émbolo.

4. Procedimiento para anestesia con xenón

1. Limita la luz ambiental en la sala de experimentos, enciende la mesa de luces LED y pon el brillo en nivel 3. Esto ayuda a aumentar el contraste en el vídeo.
2. Quita el émbolo de la jeringuilla de policarbonato. Inserta una pequeña cantidad de algodón en la tetina de la jeringuilla para evitar que las moscas se escapen. Para mayor claridad, la jeringuilla de policarbonato se referirá como jeringuilla #2 en el resto del texto.
3. Para transferir 40 moscas de su vial a la jeringuilla #2, primero saca la tapa del frasco y coloca el barril de la jeringuilla verticalmente sobre el frasco. La brida del barril debe fusionarse con la parte superior del vial para permitir que las moscas entren en el cañón de la jeringa. Gira la estructura 180° y golpea. Esto colocará las moscas en el fondo del cañón de la jeringuilla. Vuelve a colocar el émbolo. Coloca la jeringuilla con las moscas dentro de la bomba de inyección.
4. Orienta las marcas del cañón de la jeringuilla en el lateral para tener una mejor vista de las moscas desde el punto de vista de la cámara.
5. Asegura la jeringuilla del cañón y la cabeza del émbolo a la bomba de inyección usando los tornillos ajustables.
6. Quita el algodón de la punta de la jeringuilla #2 y conéctalo con la toma de 3 vías.
7. Inicia la grabación de vídeo. Enciende el manómetro. Gira la llave de paso para conectar el manómetro con la jeringuilla #2 y confirma la presión de 0 kPa en la jeringuilla usando el manómetro.
8. Gira la toma de 3 vías hacia la posición lateral para permitir el intercambio de aire con la jeringuilla antes del experimento.
9. Mueve el émbolo de los 20 a 2 mL mediante la opción de control manual de la bomba de inyección, diseñada para facilitar la opción más rápida.
10. Aspira 18 mL del gas anestésico de la bolsa de gas a la jeringuilla #1. Conecta la jeringuilla #1 con el tap de tres vías desde el puerto lateral de bloqueo del luer. Para evaluar el volumen correcto, 18 mL de gas anestésico en una mezcla total de 20 mL darían el 90% del porcentaje de gas. Esto puede cambiarse según el porcentaje final de gas deseado.
11. Mueve el émbolo de nuevo a la línea de 20 mL mediante la opción manual de la bomba de inyección.
12. Gira la llave de paso para conectar el manómetro con la jeringuilla #2. Normalmente, el manómetro muestra una presión de ~-3 kPa tras el llenado del anestésico.
13. Mueve el émbolo automáticamente, con ajustes de velocidad y tiempo a 80 mm/s y 38 s. Se espera que la bomba alcance los 5 mL de barra del cañón en 38 s. Cuando el émbolo se detiene, la presión máxima debe ser de ~200 kPa.
14. Deja el émbolo en la posición de 5 mL durante 20 segundos. Fíjate en la presión máxima.
15. Golpea la jeringuilla para desalojar cualquier mosca que se aferre al émbolo, haciendo que se queden inmóviles en el fondo.
16. Empieza la descompresión automática al final de los 20 segundos. Termina el experimento cuando el émbolo esté de nuevo en la barra de 20 mL. Fíjate en la presión final para el control de fugas.

5. Análisis de datos

NOTA: En este experimento, se utilizó la emergencia anestésica como punto final. Los movimientos de la mosca se cuantificaban desde el momento inicial de la descompresión del émbolo. Se desarrollaron dos métodos de análisis diferentes: análisis de píxeles y seguimiento de moscas. Cada método de análisis tenía sus inconvenientes, que se comunican en la discusión.

1. Análisis de píxeles
   1. Usa ScreenFlow para editar los vídeos. Recorta cada vídeo a la región de interés (ROI), es decir, los primeros 5 mL del cañón de la jeringuilla.
   2. Reduce el vídeo a los primeros 20 segundos después de la descompresión con la jeringuilla. Exporta los vídeos editados como GIFs. Duplica el GIF.
   3. Usando Fiji, elimina el primer fotograma de un duplicado y elimina el último fotograma del otro duplicado. Para lograrlo, selecciona Edición de Imagen > Vídeo > Eliminar fotogramas.
   4. Haz que cada binario GIF en Fiji para que las moscas aparezcan blancas sobre un fondo negro. Para lograrlo, selecciona Proceso > Binario > Hacer binario.
   5. Abre ambos GIFs en Fiyi. Calcula la diferencia de píxeles entre los GIFs. Para lograrlo, selecciona Proces > Calculadora de Imagen. Esta operación creará un GIF con diferencia de píxeles.
   6. Guarda el GIF de diferencia de píxeles. Analiza la partícula en los diferentes GIFs. Para ello, selecciona Analizar > Analizar partículas en Fiyi. Ajusta los umbrales de tamaño de píxel para aumentar la relación señal-ruido.
   7. Tras analizar partículas, Fiji genera un CSV con diferencias de píxeles por fotograma. Guarda el CSV. Los datos CSV pueden usarse para graficar el movimiento por fotograma. Utiliza el movimiento acumulado a través de fotogramas para asignar diferencias estadísticas entre los experimentos.
2. Seguimiento de moscas
   NOTA: Para el método de seguimiento de moscas, se utilizó tecnología de IA para detectar y rastrear el centro de masa de cada mosca en los vídeos del experimento. Se combinaron dos modelos para esto: YOLO (You Only Look Once) para la detección y MASA (Matching Anything by Segmenting Anything) para el seguimiento. Los modelos se ejecutaron en Google Colab usando una GPU Tesla T4.
   1. Instala la biblioteca YOLO de Ultralytics en Colab y luego carga el modelo yolo11n.pt. Utiliza CVAT (Computer Vision Annotation Tool) para anotar moscas en fotogramas extraídos de los vídeos, y luego exporta el conjunto de datos en formato YOLO para entrenamiento. Los procedimientos detallados de instalación y formación se describen en el repositorio en línea.
   2. Instala el repositorio MASA en Google Colab e incorpora un filtro de Kalman para realizar el seguimiento de objetos a través de tramas consecutivas. Integra el modelo de detección YOLO entrenado con el marco de seguimiento MASA.
   3. Utiliza FixTrack para revisar manualmente los tracklets generados por la tubería combinada MASA+YOLO. Identificar y fusionar rastros fragmentados incorrectamente o corregir las discrepancias de identidad para obtener trayectorias continuas para moscas individuales. Los procedimientos detallados de instalación y formación se describen en el repositorio FixTrack.

Resultados

El método descrito en este artículo permite monitorizar tanto el momento como el alcance de la actividad locomotora en moscas bajo condiciones hiperbáricas. Esta configuración permite que gases como el xenón y el óxido nitroso, que no tienen propiedades anestésicas en condiciones normales, produzcan anestesia en Drosophila melanogaster. Para demostrarlo, experimentamos con diferentes concentraciones de xenón y aire. Empezamos a establecer el proceso con 90% xenón y 10% aire. Lue...

Discusión

Esta configuración sencilla y de bajo coste hace que los ensayos conductuales hiperbáricos en Drosophila sean ampliamente accesibles, permitiendo experimentos rápidos y reproducibles sin vasos de presión especializados. Sin embargo, presenta algunas limitaciones. Uno de sus compromisos importantes es la menor presión máxima en relación con los sistemas existentes. La presión máxima que podemos inducir con este sistema es de ~4 atm, mientras que se informa que los recipientes a p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bolsas herméticas de gas (0,5 L)	Techinstro	7440440
Cámara	Manzana	iPhone 15
Abrazaderas de manguera de muelle de doble hilo	Mapa de fuentes	a24120200ux2109
Mezcla de comida para Drosophila	Manejo avanzado	DM900
Drosophila melanogaster	Darwin Biological	LZ-210
Tubería de inyección	Aitoserlea	B09M8G5BQ8
Mesa de luces LED	Lairi	M1-3878368
Manómetro	Dwyeromega	477AV-8
Grifo de cierre de tuerca de compresión metálica de tres vías;	Sigma Aldrich y Sigma Aldrich;	Z182184
Jeringa de policarbonato (20 mL)	DMC Medical	FD-1031NS
Jeringuilla de polipropileno (20 mL)	BD	301031
Tubería de silicona
Gas de xenón	Gases industriales Chengdu Taiyu