Transformación eficiente basada en regeneración mediada por agrobacterias de una especie anfibia asexual de Brassicaceae, Rorippa aquatica

Resumen

Presentamos un protocolo eficiente y optimizado para la transformación mediada por Agrobacterium de una especie anfibia asexual de Brassicaceae, Rorippa aquatica, sin procedimientos intensivos en recursos de cultivo de tejidos estériles. Utilizando un marcador de transformación visual y una tubería de regeneración de brotes se generaron con éxito transformantes casi clonales, avanzando así en los futuros estudios sobre la adaptación de las plantas al entorno submarino.

Resumen

La transformación genética estable de plantas mediada por Agrobacterium tumefaciens ha sido una herramienta poderosa tanto para la investigación fundamental en biología vegetal como para las biotecnologías vegetales que impactan directamente en la mejora de cultivos. Canalizaciones de transformación simples y efectivas, como el método de inmersión floral para Arabidopsis, han avanzado drásticamente los análisis a gran escala de la función génica. Sin embargo, tal oleoducto no puede aplicarse a especies vegetales que no experimentan reproducción sexual. Rorippa aquatica es una especie modelo anfibia emergente de Brassicaceae que presenta heterofilia y cambios drásticos en la forma de las hojas y las plantas en ambientes terrestres o submarinos. R. aquatica se propaga exclusivamente de forma vegetativa. La tubería optimizada presentada aquí proporciona una transformación eficiente y fiable mediada por Agrobacterium de R. aquatica que no requiere cultivo de tejidos estériles. Los esquejes foliares se sumergen brevemente en Agrobacterium suspendidos en un tampón de transformación que contiene un vector binario que expresa un marcador visual, RUBY, bajo el promotor constitutivo. Posteriormente, los inoculantes se cultivan sobre un papel filtrante empapado en agua en una cámara de crecimiento. Luego, las plantas regeneradoras con pigmentación rojo rubí se separan y se macetan en tierra. Esos regenerantes T1 iniciales (R1-T1) expresan sectores rojos. Al eliminar el sector rojo y repetir los pasos de regeneración, se produce un gran número de hermanos transgénicos en la siguiente generación R2-T1, algunos de los cuales son casi uniformemente rojos; indicativo de la expresión RUBY. Esta sencilla tubería de transformación puede adoptarse para R. aquatica y posiblemente otras especies vegetales que se propagan vegetativamente para introducir genes de interés que investiguen sus funciones en la adaptación a la superficie terrestre frente a la ambientes acuáticos.

Introducción

La transformación genética estable, es decir, la introducción y expresión de genes de interés para una especie vegetal determinada, es fundamental para la ciencia y la biotecnología vegetal básica. La transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens es, con diferencia, el medio de ingeniería genética vegetal más utilizado para su generación fiable de transformantes^estables. El desarrollo de un sistema vectorial binario, en el que el vector clonador de T-ADN y el plásmido auxiliar de vir desarmado se separan en dos entidades, revolucionó la transformación mediada por Agrobacterium ^1,2. Para la planta modelo Arabidopsis thaliana, un procedimiento sencillo y rentable de transformación por inmersión floral permitió la generación de transformantes clonales (hemicigotos) de alto rendimiento para genética funcional y genómica ^3,4. Sin embargo, este enfoque no es factible para especies vegetales que se propagan predominantemente o exclusivamente vegetativamente.

Las plantas anfibias muestran una capacidad única para prosperar tanto en entornos terrestres como acuáticos (submarinos^{) 5}. Rorippa aquatica es una especie anfibia de Brassicaceae que presenta heterofilía. En un entorno terrestre, R. aquatica desarrolla hojas redondas con epidermis compuesta por células del pavimento y estomas. En cambio, sus hojas acuáticas presentan morfologías bien adaptadas al entorno submarino: hojas altamente diseccionadas en forma de aguja, con epidermis desprovista de células de pavimento cuticuladas ni estomas ^6,7. Filogenéticamente, R. aquatica está estrechamente relacionada con Arabidopsis thaliana; ambos pertenecen a la misma familia,^{Brassicaceae 6}. Junto con la disponibilidad de datos de secuencias del genoma completo y la alta conservación de secuencias de genes codificantes entre R. aquatica y A. thaliana, R. aquatica sirve como planta modelo anfibia emergente para estudiar la base molecular de la adaptación a tierra y^{agua 8}. De hecho, estudios fisiológicos y de expresión génica recientes sugieren que la reprogramación de las vías de señalización de luz y hormona es fundamental para la heterofilia de R. aquatica ^7,8.

Para probar las funciones moleculares de genes y vías candidatas, la transformación genética es absolutamente esencial. R. aquatica se propaga vegetativamente en^{la naturaleza 8,9}. Por lo tanto, a diferencia de A. thaliana, la transformación por inmersión floral de Agrobacterium no puede aplicarse a R. aquatica. De forma notable, R. aquatica regenera fácilmente plantas enteras a partir de hojas desprendidas sin suplementación exógena de^{fitohormonas 10}. Brevemente, a los pocos días de la separación de segmentos foliares, la proliferación celular se activa en el tejido vascular en el extremo proximal de la superficie cortada. En el plazo de una semana, tanto raíces como brotes se regeneran, produciendo finalmente plantas jóvenes (plantas rosetas). Las plantas individuales pueden separarse y crecer hasta la^{madurez 10}. Este proceso espontáneo de regeneración completa de plantas puede utilizarse fácilmente para una transformación genética de R. aquatica.

La tubería optimizada que aquí se reporta permite una transformación eficiente y fiable mediada por Agrobacterium de R. aquatica aprovechando su capacidad para la regeneración espontánea tras el desprendimiento de la hoja. Para una selección sencilla de transformantes sin necesidad de costosos procesos de cultivo estéril, se adoptó un marcador de selección visual no invasivo, RUBY, un vector sintético con tres genes que conduce a la biosíntesis de^{betalain 11}. Optimizando las condiciones de cultivo bacteriano, los pasos de inoculación y los procesos de incubación de esquejes foliares para su regeneración, se produjeron plantas transgénicas de R. aquatica hasta la madurez. Casi todos los transformantes iniciales en la generación R1-T1 presentan sectores rojos, lo que indica que son mosaicos genéticos heterogéneos. Eliminando los sectores de hojas rojas de RUBY+ y repitiendo los procesos de regeneración, es posible la generación de plantas completamente rojas en roseta, por tanto casi clonales, de R. aquatica transformants en la generación posterior de R2-T1. Esta cadena de transformación puede aplicarse fácilmente para introducir/expresar genes extranjeros de interés en R. aquatica, acelerando así los estudios genéticos moleculares de la heterofilia y la adaptación de las plantas a ambientes extremos.

Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de materiales vegetales

1. Eliminar y cortar hojas sanas completamente lobuladas y sanas en trozos de 1-2 cm de plantas madre maduras de dos meses (Figura 1A).
2. Forra una bandeja de propagación de plantas (bandejas nido permanentes de 20 x 30 cm) con dos capas de toallas de papel dobladas autoclavadas. Empapa las toallas de papel con agua estéril, de modo que quede una fina capa de agua encima.
3. Coloca los esquejes con el lado adaxial hacia arriba con espacio alrededor de cada explantación para evitar solapamientos (Figura 1A).
4. Rocía ligeramente los esquejes y cubre bien la bandeja con film transparente.
5. Colocar las bandejas en la cámara de crecimiento a 25 °C-28 °C con 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad bajo condiciones húmedas y una intensidad luminosa de 50 μmol/^{m 2}/s.
6. Inspecciona y mantén bandejas de propagación limpias y húmedas 2-3 veces por semana.
   1. Añade agua estéril para mantener una capa fina sobre las toallas de papel saturadas.
   2. Sustituye el film transparente que haya perdido adherencia y/o muestre signos de contaminación (por ejemplo, turbidez visible del agua).
7. Utilizando microtijeras o bisturí, extirpe cuidadosamente plantas rosetas sanas y regeneradas que tengan tanto un brote como una raíz entre 14 y 21 días después del establecimiento (Figura 1B).
   NOTA: Se requiere una esciración cuidadosa para obtener una sola planta roseta con brote y raíz intactos. Las plantitas roseta Rorippa proliferan densamente a lo largo de la intersección del explante foliar y la nervadura central, lo que complica la identificación de las plantas rosetas individuales. El brote de una planta roseta crece de forma adaxial, mientras que las raíces crecen bajo la superficie de la hoja, lo que complica la visibilidad de toda la planta roseta (Figura 1B).
8. Trasplante plantitas individuales de roseta en macetas con un medio de tierra húmedo (proporción 2:1:1 de substrato: Vermilculita: Perlita) complementado con un fertilizante de liberación lenta (Figura 1B).
9. Agua con agua del grifo enmendada con 0,25 g/L de un fertilizante NPK granulado y cubrida con una cúpula de humedad o film transparente para mantener las condiciones húmedas.
10. Colocar las bandejas en la cámara de crecimiento bajo condiciones previas (25 °C-28 °C con 16 h de luz y 8 h de oscuridad en condiciones húmedas y una intensidad luminosa de 50 μmol/^{m 2}/s)
    NOTA: Es fundamental preservar las condiciones del suelo húmedo. Mantén una capa fina de agua bajo los trasplantes en maceta.

2. Cultivos de agrobacterias para transformación

1. La cepa GV3101 de Streak A. tumefaciens alberga el plásmido Ti-pMP90 (pTiC58DT-ADN) que contiene el vector RUBY en una placa de 30 mL LB que contiene rifampicina (0,03 mg/mL), gentamicina (0,025 mg/mL) y espectromicina (0,05 mg/mL), y crece a 28° C durante 48-72 horas hasta que se presentan colonias individuales.
2. Selecciona una sola colonia e inocula 5 mL de caldo MG/L enmendado con biotina y antibióticos selectivos previos (Tabla 1) e incuba en un agitador rotatorio a 200 rpm durante 16 horas.
3. Transfiere el inóculo a un matraz cónico con 250 MG/L de caldo e incuba en un agitador rotatorio a 28 °C a 200 rpm durante 16 horas.
4. Asegúrese de que el cultivo líquido tenga un OD_{mínimo de} 1,2 utilizando un espectrofotómetro. Pelleta las bacterias mediante centrifugación a 3396 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C). Modifica el caldo del inóculo con 200 μM de Acetosiringona (AS).
   NOTA: Las alicuotas de AS estéril filtrado se preparan en DMSO a una concentración de trabajo de 100 mM y se almacenan a -20 °C. El caldo de inóculo debe prepararse fresco. El AS se añade directamente antes del paso de centrifugación para minimizar la degradación. Las descripciones y componentes de los medios se enumeran en la Tabla 1.
5. Evitando la alteración directa del pellet bacteriano, descarte el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en el caldo del inóculo.
6. Gira el matraz a mano para que la solución tenga un OD₆₀₀ de aproximadamente 0,8.
7. Incubar el inóculo en un shaker a 90 rpm durante 2,5 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C).
8. Registrar condiciones pertinentes (Cultivo e Inóculo OD₆₀₀, concentración de SA y cantidad de tensioactivo, periodo de inoculación y número de unidades experimentales necesarias para la eficiencia de la transformación).
   NOTA: Las concentraciones óptimas de bacterias y cultivos de resuspensión son esenciales para maximizar la eficiencia de la transformación minimizando el crecimiento bacteriano excesivo. Antes de la centrifugación, asegúrese de que el cultivo bacteriano tenga un OD600 mínimo de 1,2; resuspender a un inóculo OD600 de 0,8. Las enmiendas al caldo de inducción están optimizadas para mejorar la transformación sin comprometer la viabilidad del regenerante. Las concentraciones recomendadas son 150-225 μM para el SA y 0,005% para surfactante.
   PRECAUCIÓN: Elimina todas las bacterias transgénicas y plantas en contenedores designados para residuos biopeligrosos.

3. Transformación de esquejes de hojas de R. aquatica

1. Mientras el cultivo de resuspensión del inóculo se incuba, selecciona varias plantas de 2 meses que presenten hojas sanas con márgenes completos.
2. Prepara una bandeja de propagación de plantas (bandejas de nido permanente de 20 x 30 cm) con 2 capas de toallas de papel autoclavadas. Dobla las toallas de papel. Empapa las toallas de papel con agua estéril, de modo que quede una fina capa de agua encima.
   NOTA: Establecer una bandeja de control negativo en la que los explantes no inoculados sufran condiciones ambientales idénticas.
3. Asegúrese de que el banco de laboratorio esté equipado con 100-500 mL ddH₂O, recipientes estériles adecuados para el volumen previsto de inóculo resuspendido, una micropipeta y puntas.
4. Antes de la finalización de la fase de incubación, se extiende rápidamente diez hojas en la base del pecíolo de las plantas seleccionadas. Coloca los explantados en una placa de Petri con agua estéril.
   NOTA: Es fundamental utilizar tejido recién extirpado para la inoculación foliar y evitar la desecación foliar.
5. Tras 2,5 horas, pipetear 50 μL de tensioactivo en una solución de resuspensión de 1 L (concentración de tensioactivo del 0,005%) y girar suavemente el matraz para mezclar (Figura 2A). Asegurarse de que haya acceso a una bandeja de propagación para colocar los explantaciones tras la inoculación (Figura 2B).
6. Coloca el lado abaxial de la hoja hacia arriba y corta perpendicularmente a lo largo de la nervadura central en piezas de 1 cm de largo con un bisturí (Figura 2C).
7. Coloca inmediatamente hojas recién cortadas en un tubo de 50 mL, adecuado para el mezclador de tubos giratorios, para servir como explantaciones de inoculación.
8. Vierte el inóculo en el tubo explantado a un volumen para saturar todo el material y luego agita en un mezclador rotativo durante 10 minutos a temperatura ambiente para la inoculación (Figura 2D,E).
9. Retira todas las hojas inoculadas de la solución con pinzas y colócalas directamente en la bandeja de propagación preparada.
10. Separa y extiende los explantes empapados para que queden parcialmente, pero no completamente, sumergidos en la fina capa de agua sobre las toallas de papel saturadas (Figura 2F).
    PRECAUCIÓN: Mantenga condiciones asépticas y evite cualquier contacto con superficies o herramientas utilizadas durante los procedimientos de Agrobacterium antes de su desinfección.
11. Sella cada bandeja con film transparente y incuba en la oscuridad a temperatura ambiente (22° C) durante tres días.
12. Al finalizar el periodo de oscuridad, asegúrate de que las bandejas estén selladas con film transparente y enmiéndas las bandejas con ddH_2Opara mantener el nivel de humedad.
13. Trasladar las bandejas de inoculación a una cámara de crecimiento bajo condiciones de propagación vegetativa.
    PRECAUCIÓN: Consolida los residuos del inoculo en un contenedor de residuos, trátalos con una solución de lejía al 10% y deséchalos según las directrices de bioseguridad.

4. Regeneración de las plantuelas rosetas y establecimiento de la generación R1-T1

1. Inspecciona las bandejas de inoculación 2-3 veces por semana para asegurar condiciones limpias y húmedas.
   1. Añade_{ddH 2}O usando una botella de exprimir. Si está disponible, pulveriza los explantos con un pulverizador antes de volver a sellar las bandejas.
   2. Mantén una alta humedad reemplazando el film transparente que haya perdido adherencia o muestre signos de contaminación (por ejemplo, turbidez visible del agua).
2. Inspeccionar visualmente las plantas rosetas regeneradas para detectar características de idoneidad para el trasplante. Los regenerantes ideales mostrarán un brote intacto con múltiples hojas y raíces de al menos 2-3 mm de longitud (Figura 2G).
   NOTA: Las plantas de roseta transgénica suelen regenerarse más lentamente, alcanzando generalmente la idoneidad para el trasplante entre 21 y 28 días después de ser colocadas en la cámara de crecimiento.
3. Eliminar y trasplantar plantas rosetas transgénicas intactas bajo las mismas condiciones que los regenerantes clonales WT.
4. (Opcional) Registrar el número de transformantes regenerados y correlacionarlo con sus condiciones de transformación para evaluar la eficiencia.
   NOTA: Ten especial precaución durante la selección. Los regenerantes transgénicos suelen ser pequeños y fácilmente pasados por alto. Inspecciona cuidadosamente tanto las superficies foliares adaxiales como abaxiales usando pinzas para maximizar el rendimiento y minimizar el daño.
5. Elimina la planta roseta del consumo, evitando tocar cualquier hoja transgénica. Recorta cualquier follaje sobrante que rodea inmediatamente la hoja transgénica. Trasplanta una planta por maceta.
6. Fertiliza, riega y rocía rápidamente cada planta y colócala bajo una cúpula de plástico para retener la humedad (Figura 2G,H).
7. Etiqueta y registra cada plántula transgénica.
8. Devuelve los explantes que contengan transformantes que carezcan de brotes, raíces o que parezcan demasiado pequeños para trasplantarlos a la bandeja de propagación y así continuar el cribado. Trasplante transformantes adicionales cuando el crecimiento sea suficiente.
9. Niebla y agua trasplantes diarios durante la primera semana. Asegúrate de que siempre haya agua en la bandeja.
10. Retirar y deshacerse de cualquier trasplante que haya sido senescente o que ya no muestre expresión de pigmento RUBÍ.
    PRECAUCIÓN: Desechar todos los materiales transgénicos conforme a las normativas institucionales de bioseguridad.

5. Regeneración y establecimiento posterior de la generación casi clonal R2-T1

1. Una vez que las plantitas rosetas se convierten en plantas grandes y sanas (2 meses), se extienden las hojas expandidas que expresan RUBÍ a partir de una sola plántula (Figura 2H).
   NOTA: Aunque las hojas que expresan el rubí pueden parecer uniformemente rojas, suelen ser más comúnmente quiméricas. Ambos fenotipos son adecuados para la propagación. Proceda con los métodos estándar de propagación vegetal en los siguientes pasos.
2. Divide los trozos de hojas transformadas y colócalos en una bandeja de propagación. Etiqueta claramente cada bandeja de propagación con el correspondiente ID de donante de plántulas.
   PRECAUCIÓN: No mezcles hojas de varias plántulas en la misma bandeja. Cada plántula representa un evento transgénico único y debe ser registrada como una generación separada.
3. El trasplante regeneraba plantas R2-T1 (14-28 días después de la propagación). Asignar a cada planta un nuevo identificador que refleje su segundo estado. Continúe con el tratamiento estándar tras el trasplante tal como se describió anteriormente (Figura 2I,J).

Resultados

Los parámetros de la transformación de A. tumefaciens se optimizaron para producir con éxito plantas transgénicas de R. aquatica que expresan RUBY, saltándose las limitaciones basadas en la esterilidad y aprovechando su rápida tasa de regeneración asexual (Figura 1 y Figura 2). Tras la inoculación de los explantes de hojas y la exposición a un tratamiento oscuro de 72 horas, las plantas regeneradas comenzaron a crecer en menos de 2 semanas bajo las condiciones descritas. Se encontraron plantas regeneradas que exhibían sectores quiméricos de rubí lo suficientemente grandes para trasplantar entre 3 y 5 semanas después de la inoculación (Figura 3) y eran algo más pequeñas que aquellas plantas rosetas no expresivas. No se encontraron plantuelitas regeneradas de RUBY en las bandejas de control de tipo salvaje, lo que confirma que este fenómeno era distinto de la fisiología de R. aquatica. El tipo de caldo de cultivo bacteriano, el tipo de caldo de inóculo por resuspensión, el método de infiltración y el periodo de inoculación no difirieron significativamente en su capacidad ni en la tasa de generación de transformantes (Tabla 2 y Tabla 3). Los factores de tratamiento que afectaron positivamente la eficiencia de la transformación incluyeron un aumento de la concentración de AS y el tratamiento por exposición a la auxina antes de la inoculación con explant foliar. Un aumento en la concentración de tensioactivo afectó negativamente el rendimiento y se consideró inadecuado.

La versión 4.4.2 12,13,14,15 se utilizó para realizar el análisis del Modelo Mixto Lineal General de Poisson (Poisson GLMM) de datos de recuento de plantas en rosetas. Sin embargo, en el Experimento D (Tabla 2D), donde se examinaron regenerantes expresados con RUBI para una inoculación de 15 minutos modificada con 150 μM AS o 225 μM AS, el modelo violó las suposiciones debido a la subdispersión y se aplicó un GLMM Binomial Negativo en su lugar.

Se examinaron cuidadosamente los efectos de diferentes condiciones bacterianas de caldo y cultivo sobre la eficiencia de la transformación. Entre los cinco réplicas experimentales, el uso del caldo LB de Miller o caldo MG/L específico para transformaciones resultó en transformantes que expresaran RUBY bajo parámetros casi idénticos y no difirieron significativamente en sus efectos (Tabla 2A). Los medios de RUBY expresaron plantuelas roseta regeneradas a partir de fragmentos individuales de hojas, que consisten en 15-60 explantaciones por tratamiento, variaron entre 1,61 ± 0,71 regenerantes producidos en experimentos que utilizaron caldo de resuspensión de cultivo basado en LB y no MS (Caldo de Inducción de Control, Tabla 1) y 3,23 ± 1,13 regenerantes de esos experimentos con MG/L y el Caldo de Inducción Optimizado. A pesar de la ausencia de una diferencia significativa, debido a observaciones subjetivas, se seleccionaron el cultivo MG/L y el Caldo de Inducción Optimizado (Tabla 1) para futuros experimentos de optimización.

A continuación, probamos factores que afectan la carga bacteriana y la capacidad de acceder al tejido meristemático de la planta. Entre ocho réplicas (Tabla 2B), los explantes inoculados con una concentración aumentada de surfactante del 0,01% mostraron un estrés extremo un mes después, resultando en regenerantes pequeños y en gran medida inviables. No parecía haber transformantes regenerados entre esos réplicas, aunque el fenotipo de regenerante estresado de los explantes era la pigmentación granate, marrón y amarilla, por lo que podría haber habido transformantes potenciales. En cualquier caso, la no viabilidad de los regenerantes validó mantener una concentración de surfactante del 0,005%.

Se compararon dos técnicas mecanicistas, agitación o infiltración por vacío, en su efecto para introducir el ADN deseado en la planta hospedadora. El método de infiltración control, en el que los explantes se sumergían en 50 mL de inóculo resuspendido y se rotaban en un mezclador de tubos, fue exitoso en producir regenerantes expresados por RUBY en los tratamientos listados. La infiltración al vacío aplicada también produjo regenerantes expresados en RUBY, pero no diferían en su eficiencia de transformación en comparación con el método de control (p = 0,478, Tabla 2D). Se observaron aproximadamente entre 2 y 5 regenerantes expresados en RUBI por bandeja de propagación, ya fuera inoculados por infiltración al vacío o agitación física.

La concentración modificada de Acetosiringona (AS) en el inoculo bacteriano difería claramente en su efecto sobre la eficiencia de la transformación. Aumentar la concentración de AS de 150 μM a 225 μM mejoró significativamente la producción de explantes transgénicos que expresan RUBY (p = 0,000309, 0,000458; Tabla 3C, D). Entre los cuatro experimentos, cada tratamiento consistió en una bandeja con 40 explantas inoculadas tratadas de forma idéntica. Los inoculados en la concentración más alta promediaron casi 5 regenerantes expresados por RUBY frente a 1 transformante por bandeja de AS de control (Tabla 3C). Además, el efecto de la EA parecía estar separado de los periodos de duración de la inoculación.

Entre los tres experimentos con duraciones de inoculación de 15 minutos, con explantes modificados con 225 μM AS, se encontró una media de 7,28 ± 4,13 regenerantes expresados en RUBY, claramente superior a los tratamientos de 150 μM, donde 2,03 ± 1,32 tasa de regeneración (Tabla 3D). No apareció un efecto claro en el intervalo de tiempo entre los tratamientos control de 150 μM de AS (p = 0,676), para los cuales la tasa media de inoculación en 10 minutos fue de 1,48 ± 0,954 frente a 1,84 ± 1,230 regenerantes en las vacunas de 15 minutos (Tabla 3B). De manera similar, los inoculantes tratados a 10 minutos y 225 μM regeneraron aproximadamente 5 plantitas rosetas expresadas por rubí por tratamiento, lo que no difería claramente de los tratamientos inoculantes de 15 minutos, donde se indicaban 6-7 regenerantes para la bandeja de tratamiento (Tabla 3A).

Además, se probó la hormona vegetal auxina, que ayuda a la regeneración de plantas en general. La exposición de fragmentos de hoja recién extirpados a un tratamiento con auxina por pulso antes de la inoculación tuvo un efecto positivo claro en el aumento de la regeneración de RUBY en comparación con los de ddH_2O(p = 0,00969, Tabla 2C). Cuando se colocaron en_{ddH 2}0 modificado con ácido indol-3-acético (IAA) de 285 μM, los explantaciones mostraron una tasa media de transformantes de 6,67 ± 1,490 por tratamiento en comparación con el tratamiento libre de auxina, que tuvo una tasa media de regeneración de 2,00 ± 0,816.

La línea transgénica regenerada inmediatamente fue designada como generación R1-T1 (Figura 2), con regenerantes individuales como líneas. Todas las plantas iniciales de roseta R1-T1 mostraron expresión de RUBÍ en forma de hojas quiméricas, con una variedad de patrones quiméricos. Lo más común es que 1-3 hojas de planta expresaran quimeras distintas donde el tejido expresado por RUBI y no expresado divergía en la nervadura central. La mayoría de las plántulas R1-T1 de un mes mantuvieron expresión quimérica (Figura 3A), pero se encontró un pequeño número de plántulas que expresan completamente RUBY.

Los sectores quiméricos pigmentados con RÚBITO propagados asexualmente a partir de fragmentos de hojas de plántulas R1-T1 (Figura 3B) regeneraron plantas de roseta R1-T1 completamente RUBÍ o quiméricas en 2-4 semanas tras la escisión (Figura 3C). Tras un mes, la mayoría de las plántulas R2-T1 mostraban predominantemente hojas de rubí, con algunas con regiones quiméricas menores no expresadas (Figuras 3D,E).

Figura 1: Protocolo y cronología de propagación vegetativa. Imágenes representativas ilustran la cadena de producción utilizada para regenerar plantas rosetas asexuales. (A) Extraer hojas lobadas adultas, sanas y completas de las plantas madre establecidas y cortarlas en 2-3 piezas. (B) Colocar los explantaciones en una bandeja de propagación y mantenerlas bajo condiciones específicas. Tras 3 semanas, las plantas rosetas fueron extirpadas de los explantes y trasplantadas al medio del suelo. A continuación hay una foto real de las rosetas regeneradas que aún están sujetas (flechas rosas) al esqueje de la hoja madre. Estas plantuelitas se encuentran en la fase óptima para el trasplante. Barra de escala: 10 mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Transformación de esquejes de hojas de R. aquatica y regeneración de transformantes que expresan transcritos de RUBY . Visión gráfica del procedimiento de transformación y la producción de regenerantes transformados. (A) Obtención del inóculo bacteriano. (B) Preparar una bandeja de propagación con papel filtrante estéril y agua. (C) Cortar hojas en piezas explantadas. (D) Sumergir explantaciones en el inóculo. (E) Agitar en una batidora rotativa durante 20r/1 min durante 10 min. (F) Esparcir explantaciones saturadas en la bandeja, cubrirlas con una cúpula plástica e incubar en condiciones oscuras durante 72 h. (G,H) Tras 1 mes, extirpar regenerantes transformados intactos de explantes expuestos a Agrobacterium y trasplantar para establecer plantas maduras. (I,J) Repitiendo el paso de propagación (G,H) para producir una generación casi clonal de R2-T1. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Generaciones propagadas asexualmente de una línea transgénica RUBY . (A) plántula madura de R1-T1 que exhibe hojas quiméricas con expresión RUBY . Barra de escamas: 1 cm. (B) Dos de veinte explantas recién colocadas en una bandeja de propagación de la plántula de 3 meses que se muestra en (A). Los explantes presentan un patrón quimérico de RUBY separados en la nervadura central. Barra de escamas: 1 cm. (C) Plantitas de roseta R2-T1 regeneradas con distintos grados de expresión quimérica de RUBY , un mes después de la excisión y antes del trasplante. Raíces RUBY positivas regeneradas (flecha marrón). Barra de escamas: 2 cm. (D) plántula R2-T1 mostrada 1 mes después del trasplante, con expresión RUBY . Barra de escamas: 2 cm (E) plántula madura de R2-T1 3 meses después del trasplante mostrando pequeños sectores (flechas verdes). Barra de escala: 2 cm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Diagrama de flujo de la tubería optimizada. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1: Formulaciones de medios Por favor, haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Efecto de cuatro parámetros de optimización en la eficiencia de transformación de R. aquatica. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Efecto de la concentración de acetosiringona en el inóculo sobre la eficiencia de transformación deR. aquatica. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

En este estudio, establecimos una transformación estable simple y basada en regeneración directa mediada por Agrobacterium de R. aquatica, una planta anfibia de Brassicaceae que se propaga únicamente^{asexualmente 10,16}. No se ha establecido una cadena exhaustiva de transformación de plantas anfibias propagadas vegetativamente, ni se ha utilizado la transformabilidad práctica de R. aquatica con un marcador visual. Cabe destacar que esta tubería no requiere un laborioso y estéril proceso de cultivo de tejidos vegetales ni incubadoras especializadas para crecimiento vegetal. Por ello, este protocolo puede adoptarse ampliamente en diversos entornos experimentales, desde laboratorios de investigación científica hasta el aula.

Entre las diferentes condiciones de inoculación e incubación probadas, algunos factores supusieron una mejora significativa en la eficiencia de la transformación. Cabe destacar que una concentración ligeramente mayor de acetosiringona (AS) así como la concentración de ácido indol-3-acético (IAA) afectaron positivamente a la eficiencia de transformación (Tabla 1 y Tabla 2). El AS es un compuesto fenólico que atrae a Agrobacterium, y se ha demostrado que mejora la eficiencia de transformación de plantas en Arabidopsis¹⁷. La fitohormona auxina es fundamental para la reprogramación celular de las plantas. Se observó un rápido aumento de la expresión génica relacionada con la auxina durante la regeneración inducida^{por la herida 10}. Por esta razón, se podría suponer que la auxina aplicada exógenamente (IAA) durante la inoculación por explantación aumenta la eficiencia de regeneración. Sin embargo, no se observaron diferencias en el número observado de plantas regeneradas en tres ensayos (57, 7,55 vs. 59,67, 5,51 para control vs. tratamiento). Por lo tanto, el tratamiento con auxina probablemente puede ayudar al proceso de transformación en lugar de la regeneración en sí.

Un tensioactivo no iónico, el trisilano alcoxilado (conocido como Silwet L-77), aumenta considerablemente la eficiencia de transformación de Arabidopsis mediante el método de inmersión^{floral 3}, y por ello es ampliamente utilizado entre la comunidad de biología vegetal. Se observó un estrés vegetal mínimo entre los explantes enmendados con Silwet L-77 al 0,005% (la concentración recomendada para el baño floral). Cuando esta dosis se duplicó (0,01%), los esquejes de hoja de R. aquatica resultaron gravemente dañados, lo que resultó en la recuperación de casi ningún transformante (Tabla 2B). Durante el baño floral de Arabidopsis, el uso de tensioactivos reduce la tensión superficial de los inoculantes y mejora el acceso a los brotes florales. En cambio, como especie anfibia, R. aquatica desarrolla hojas lisas, sin tricomas ni cutículas^gruesas. El aumento del tensioactivo causó daño en el tejido foliar, lo que indica que factores distintos al tensioactivo deben priorizarse para la eficiencia de transformación en tejidos foliares no pubescentes. El tensioactivo es más relevante para el fenotipo pubescente, donde facilita la penetración del tejido. Tras integrar todos los parámetros probados, se proporciona una tubería con las condiciones más óptimas como diagrama de flujo (Figura 4).

La utilización de un marcador visual, RUBY, es fundamental para esta cadena de transformación. RUBY es un reportero sintético que codifica tres genes codificantes (CYP76AD1, DODA y Glucosyltransferasa) que sintetizan un pigmento rojo brillante, la betalaína¹¹. Cuando se observó la expresión de RUBY en regenerantes R1-T1, se manifestó como sectores rojos, lo que indica que probablemente sean quiméricos (Figura 2 y Figura 3). Un estudio previo reveló que la regeneración de R. aquatica se origina en un cambio vascular de una hoja^{cortada sección 10}. De manera llamativa, los regenerantes R1-T1 ocasionalmente presentan un límite quimérico a lo largo de la vena media, con la mitad de la hoja roja y la otra mitad verde (Figura 3A,B). La regeneración de sectores RUBY ocasionalmente produjo plantitas completamente rojas con raíces rojas (Figura 3C, flecha granate), que luego crecieron hasta convertirse en plantas uniformemente rojas R2-T1 (Figura 3D). No se observaron efectos adversos de la sobreexpresión de RUBY sobre el crecimiento y desarrollo de R. aquatica (Figura 3). En apoyo, no se observaron diferencias discernibles en el tamaño y la forma de las hojas de roseta R1-T1 con sectores de rubí (por ejemplo, Figura 3B). Es posible que cualquier transgen fuerte y constitutivo impulsado por un promotor pueda interferir con el crecimiento normal de las plantas y la respuesta fisiológica.

En algunas ocasiones, estas plantas RUBY 'casi clonales' desarrollaron sectores verdes (Figura 3E, flechas verdes), que sugieren reversión o silenciamiento de transgenes. Esto indica que tener un marcador visible como RUBY es indispensable para la expresión o silenciamiento ectópico (por ejemplo, ARNi) de un gen de interés para futuros estudios moleculares y mecanicistas. Se puede introducir un transgen de interés en el casete RUBY y observar los fenotipos en los sectores rojo, RUBY . En conclusión, aprovechando la reprogramación directa inducida por el corte de hojas y un marcador visible no invasivo, se optimiza una tubería de transformación sencilla y eficiente para R. aquatica, una Brassicaceae que se propaga vegetativamente. Aunque está fuera del alcance de este protocolo, la comprensión futura del origen exacto de la regeneración de R. aquatica transformada podría aportar información sobre la reprogramación celular en plantas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1000 y micro; Puntas de pipeta LTS con filtro L	Rainin	30389213
Acetosiringona	Sigma-Aldrich	D134406-1G
Extracto de levadura bacto, técnico	Fisher Scientific	DF0886-17-0
BD Bacto Agar	Fisher Scientific	214030
BD Difco LB Broth, Miller	Midland Scientific	DIFCO 244610
BD Bacto Triptona Deshidratada	Fisher Scientific	DF0123-17-3
Polvo liofilizado con biotina	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Cúpulas transparentes para bandejas PermaNest	Solución para el cultivador	GD221
Film transparente	Thomas Scientific	22-305654
Vermiculita gruesa	Bectine
Di-potasio hidrógeno fosfato anhidro anhidro	Sigma-Aldrich	105109
Placas de Petri desechables de 100 x 15 mm	VWR Internacional	25384-342
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Etanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-720
Tubos centrífugos cónicos Falcon 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Toallas de papel dobladas 9,3" x 10,5"	Kimberly-Clark	2920
Espectrofotómetro Visible GENESYS 30	Termo Científica	840-277000
Solución de gentamicina	Sigma-Aldrich	G1272-100ML
Ácido L-glutámico sal monosódica hidratar	Sigma-Aldrich	G1626-100G
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Sulfato de magnesio, heptahidrato	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Agitador incubador MaxQ 6000	Termo Científica	SHKE6000
MES hidrato	Sigma-Aldrich	M8250-100G
Mezcla basal de sal Murashige y Skoog (MS), polvo	Sigma-Aldrich	M5524-50L
MX-RL-pro: Rotador de tubo de gira	Scilogex	824222019999
mio-inositol	Sigma-Aldrich	I7508-100G
Cámara de Crecimiento Percival	Percival	AR36L3
Aditivo para suelo de plantación de perlita	Industrias PVP	PVP105408
Bandejas para plantas Perma-Nest 8''x12''	VWR Internacional	470150-476
Medidor de pH Siete Compacto 5220	Mettler Toledo	30019028
Bisturí protegido	Fisher Scientific	02-688-79
Rifampicina	Sigma-Aldrich	R3501-5G
Fertilizante de liberación inteligente para plantas	Osmocote	B0071CZTBA
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	S271-3
Pentahidrato de dihidrocloruro de spectinomicina	Sigma-Aldrich	S4014-5G
Pulverizadores con vaporizador de bomba	Thomas Scientific	1141V43
Potenciómetros cuadrados de 3,5" GAGE	Growers Nursery Supply Inc.	03GA-0350S
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S0389-5KG
Sunshine #4 Sustrato profesional para cultivo	Horticultura Sun GRO	1341CFL0028P S
Tensioactivo - Silwet L-77	Fisher Scientific	NC1791615
Desecador de vacío	El Depósito de Laboratorios	55207
Alimento vegetal multiusos soluble en agua	Miracle-Gro	160101