Separación HPLC automatizada usando LC-mate: un automuestreador repetitivo integrado y colector de fracciones para la purificación a microescala

Resumen

Se desarrolló un automuestreador integrado y un colector de fracciones (LC-mate) para automatizar separaciones repetitivas de HPLC. Compatible con detectores HPLC que emiten señales analógicas, LC-mate mejora el rendimiento de sistemas operados manualmente y acelera los flujos de trabajo de investigación que dependen de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HLC).

Resumen

La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) desempeña un papel crucial en la purificación de compuestos de alto valor, satisfaciendo las crecientes demandas de las disciplinas de química y biología tanto en entornos académicos como industriales. Sin embargo, la inyección manual repetida y la recogida de fracciones durante la purificación a microescala limitan significativamente la eficiencia y la reproducibilidad. Para superar este cuello de botella, hemos desarrollado un sistema integrado de automuestreador y colector de fracciones, temporalmente llamado LC-mate, que automatiza separaciones repetitivas respondiendo directamente a señales analógicas del detector HPLC. El instrumento está construido en torno a una válvula de conmutación de seis puertos de alta presión para la inyección de muestras y una válvula selectora para la recogida de fracciones, con parámetros operativos controlados mediante una interfaz táctil intuitiva. LC-mate es compatible con detectores HPLC comerciales capaces de salida analógica y también puede lograr la separación repetitiva del modo de elución por gradiente mediante disparo sincrónico de señales. Los experimentos demostrativos confirmaron un funcionamiento estable y separaciones reproducibles para la purificación de productos naturales, mostrando una clara reducción en el tiempo de manipulación manual. El sistema ofrece una solución práctica y accesible para mejorar la automatización en los flujos de trabajo convencionales de HPLC, acortando la brecha entre los sistemas de purificación manuales y totalmente automatizados.

Introducción

La cromatografía, pionera por M.S. Tswett a principios del siglo XX, evolucionó hacia la moderna cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en los años 60 con avances en la^{instrumentación 1,2,3}.

Hoy en día, el HPLC desempeña un papel fundamental en la purificación de compuestos de alto valor, satisfaciendo las crecientes demandas de las disciplinas de biomedicina, química y biología tanto en el ámbito académico como industrial. En la investigación académica, la purificación a microescala de productos naturales y la resolución de moléculas quirales dependen críticamente de técnicas HPLC^{semi-preparativas} 4,5,6,7,8. En la mayoría de los casos prácticos, los investigadores inyectan una parte de la solución de la muestra en una columna de HPLC a la vez, en lugar de en su totalidad, para evitar pérdidas imprevisibles de la muestra o debido a la limitación del tamaño de la columna, lo que hace inevitable la inyección repetida de muestras y la recogida de fracciones. A pesar de su excepcional capacidad de separación, el uso de HPLC para la purificación de muestras sigue limitado por las limitaciones inherentes en la instrumentación y los flujos de trabajo actuales. Un importante cuello de botella radica en la fuerte dependencia de la intervención manual, especialmente en la inyección de muestras y la recogida de fracciones. Estos procesos no solo consumen mucho tiempo y mano de obra, sino que también son susceptibles a errores humanos, comprometiendo así el rendimiento, la reproducibilidad y la eficiencia operativa^{general 9,10}.

Los automuestreadores comerciales y los colectores de fracciones de los principales fabricantes de HPLC, como Agilent, Shimadzu y Waters, proporcionan automatización fiable y precisa, pero suelen estar limitados a ecosistemas propietarios de hardware y software. Por ejemplo, el autosampler Agilent 1260 Infinity II y el colector de fracciones G1364F están integrados perfectamente en los sistemas HPLC de Agilent, proporcionando una excelente reproducibilidad pero una compatibilidad limitada entre plataformas. De manera similar, los automuestreadores SIL-20A/40C de Shimadzu y los colectores de fracciones FRC-40/FRC-10A ofrecen alto rendimiento y excelente precisión mecánica, aunque dependen de las arquitecturas de control LC-20 y Nexera de Shimadzu. Los módulos autosampler HPLC y colector de fracciones III de Waters Alliance también ofrecen un rendimiento robusto y formatos de recogida flexibles (hasta 300 mL/min), pero siguen adaptados a los entornos propietarios UHPLC y LC-MS de Waters. Además, los automuestreadores tradicionales que dependen de agujas de inyección pueden reducir la recuperación de muestras, y los colectores de fracciones basados en tubos pueden ser incómodos para manejar grandes volúmenes eluentes. Para la mayoría de los demás instrumentos HPLC, la separación semi-preparativa sigue dependiendo de un funcionamiento manual repetitivo y tedioso.

Estos desafíos ponen de manifiesto la necesidad de un enfoque innovador para automatizar la purificación de muestras en los flujos de trabajo HPLC. Para responder a esta necesidad, hemos desarrollado LC-mate, un instrumento compacto y versátil que integra módulos de automuestreo y recogida de fracciones en una única plataforma. El núcleo fluídico de LC-mate consta de dos componentes clave: una válvula de conmutación de seis puertos de alta presión (SKVA-3130-S) construida en acero inoxidable SUS 316 con un flujo de 0,4 mm y que soporta presión de funcionamiento de hasta 45 MPa, con capacidad para un control preciso de inyección de muestras, y una válvula selectora multiposición de 10 canales con volumen muerto mínimo (27,5 μL puerto a puerto, 5 μL de ranura del rotor) con un diámetro de canal de flujo de 1,2 mm para una recogida eficiente de fracciones. Esta configuración minimiza el volumen muerto y reduce el riesgo de contaminación cruzada. Para especificaciones detalladas del instrumento, consulte la Tabla 1. LC-mate puede recibir salida analógica de los detectores HPLC y activar el instrumento HPLC mediante señal síncrona, permitiendo el control independiente tanto de la inyección de muestras como de la recogida de fracciones.

Tabla 1: Parámetros del instrumento relacionados con LC-mate. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

El instrumento está equipado con un software de control fácil de usar y una interfaz táctil intuitiva que permite la visualización en tiempo real de señales cromatográficas analógicas. LC-mate soporta tanto modos de separación isocrática como de gradiente, permitiendo a los usuarios configurar parámetros clave, incluyendo volumen de inyección, número de tiempos de repetición, tiempo de intervalo de cada inyección y modo de recogida [basado en umbrales, basado en tiempo o Collect All (recoger fracciones tanto por encima como por debajo del umbral)], y ejecutar una operación totalmente automatizada con un solo comando. Esto elimina la necesidad de intervenciones manuales repetitivas y mejora significativamente la eficiencia de la purificación de HPLC.

La Figura 1 ilustra la apariencia general, el principio de funcionamiento y la configuración del LC-mate integrado con un sistema HPLC.

Figura 1: Diseño y configuración del sistema LC-mate. (A) Diseño esquemático. (B) Diagrama de instrumentos. (C) Foto práctica de preparación. (D) Conexión de la línea de transmisión de señal entre el detector UV y el LC-mate. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Protocolo

1. Comprobar la conexión

1. Verifique las conexiones de fontanería del disolvente entre el HPLC, LC-mate y la columna cromatográfica para asegurar los caminos de flujo adecuados (Figura 1A).
2. Comprueba la conexión de la línea de transmisión de señal entre el detector UV y el LC-mate, como se muestra en la Figura 1D.
   1. Conecta el cable negro al terminal rojo y el cable blanco al terminal negro para que coincida con la polaridad de la señal analógica de salida.
   2. Observa la pantalla LC-mate. Si aparece la forma de onda de la señal analógica, la conexión es correcta.
      NOTA: Si no se ve ninguna forma de onda, invierte las conexiones: conecta el cable negro al terminal negro y el cable blanco al terminal rojo.
3. Comprueba la conexión de disparo entre el detector UV y LC-mate.
   1. Conecta el extremo único del cable de datos al puerto de salida del detector UV.
   2. Conecta los cables negro y blanco del otro extremo a los terminales de disparo azul y negro del LC-mate, respectivamente.
   3. Aprieta el terminal y el disparador para asegurar una conexión firme.

2. Arranque del sistema de separación integrado

1. Asegura el arranque adecuado del HPLC.
2. Asegúrate de un buen arranque del LC-mate.
   1. Al iniciar el sistema LC-mate, haz clic en el icono LC-mate en la interfaz para ejecutar automáticamente el programa de autoprueba del sistema e inicializar los módulos clave de hardware.
   2. Espera el breve tono de la señal Di (aproximadamente 0,5 s) y la desaparición del prompt de "Autoprueba" en la pantalla tras finalizar la autoprueba, ya que indican que la inicialización ha finalizado.

3. Optimización de condiciones

1. Configura la condición de separación del HPLC y comienza la elución para lograr el equilibrio de la columna.
2. Haz clic en el icono de Test en el lado izquierdo de la pantalla de LC-mate y la siguiente interfaz se mostrará en la pantalla (Figura 2A). Parámetros de volumen de inyección de entrada, tiempo de elución y tiempos de repetición , y pulsa el icono de inicio ; se iniciará el funcionamiento del automuestreador, el colector de fracciones y el HPLC. En este caso, el eluente solo fluye por el puerto 10 de la válvula selectora y puede recogerse manualmente o descartarse.
3. Identificar las condiciones de separación factibles, incluyendo resolución, tiempo de ejecución, tiempo de retención, volumen de inyección y longitud de onda UV, etc., para facilitar la separación posterior y la recogida de fracciones bajo modos adecuados.

4. Funcionamiento automático

NOTA: Según el cromatograma de condiciones de separación factibles, se podría seleccionar una forma adecuada de recolección de fracciones de las opciones Umbral, Recogida de Temporización y Recoger Todo en el lado izquierdo de la interfaz.

1. Recogida de fracciones basada en el valor umbral
   1. Selecciona el módulo de función Umbral en el lado izquierdo de la interfaz, y el sistema mostrará la interfaz de configuración de parámetros tal como se muestra en la Figura 2B.
   2. Introduce el volumen de inyección, tiempos de repetición, umbral y tiempo de elución, y pulsa Start; el HPLC y el LC-mate funcionarán automáticamente. Las fracciones con picos cromatográficos que superen el umbral se recogerán en diferentes botellas de recogida.
   3. Monitoriza los indicadores de estado dispuestos verticalmente en la pantalla: Observa la inyección en curso para confirmar que se ha iniciado la introducción de la muestra. Comprueba la separación en curso para comprobar que la separación cromatográfica está en marcha. Nota "Vaciado de la jeringuilla" para identificar cuándo la jeringuilla purga líquido residual. Observa el resaltado azul del texto correspondiente para confirmar qué estado operativo está activo actualmente.
      NOTA: Durante el proceso de separación, pulsar el icono "Cromatograma" mostrará el cromatograma y la línea umbral en una nueva interfaz, y el cromatograma es idéntico al que aparece en la pantalla del ordenador que controla el HPLC.
2. Recogida de fracciones según el periodo de tiempo
   1. Selecciona el módulo Recogida de Tiempos desde el lado izquierdo de la interfaz para abrir el menú de configuración de parámetros (Figura 2C).
   2. Introduce los parámetros requeridos: Volumen de Inyección, Tiempos de Repetición, Tiempo de Elución y una serie de Tiempos de Recogida necesarios.
   3. Pulsa el botón Start para iniciar la secuencia automatizada, luego el sistema HPLC y LC-mate se ejecutarán repetidamente según los parámetros establecidos.
3. Recogida de fracciones con el modo "Collect All"
   1. Selecciona el módulo de función Collect All en el lado izquierdo de la interfaz, el sistema mostrará la interfaz de configuración de parámetros como se muestra en la Figura 2D.
   2. Establece un valor umbral de recogida, y los picos cromatográficos que estén por encima o por debajo del umbral se recogerán por separado, lo que puede garantizar que no se pierda ningún compuesto en una mezcla.
      NOTA: El acetonitrilo es un disolvente inflamable y tóxico. Todos los procedimientos que involucren acetonitrilo u otros disolventes orgánicos deben realizarse en un espacio de laboratorio bien ventilado. El personal debe llevar siempre el equipo de protección individual (EPP) adecuado, incluyendo gafas antisalpicaduras químicas y guantes resistentes a disolventes. Los residuos acetonitrilo y otros disolventes orgánicos deben recogerse en recipientes designados y debidamente etiquetados para residuos químicos peligrosos. Estos flujos de residuos se gestionaron según el protocolo de salud y seguridad ambiental de nuestra institución por un servicio autorizado de eliminación.

5. Limpieza de tuberías

NOTA: Limpiar la tubería garantiza que no quede ninguna muestra en la tubería cuando se utilice el autosampler la próxima vez.

1. Prepara una pequeña botella de disolvente limpio e inserta la tubería de inyección del automuestreador en el disolvente.
2. Selecciona el módulo de Purificación desde la interfaz del lado izquierdo para abrir el menú de configuración de parámetros (Figura 2E).
3. Limpieza de la tubería del inyector
   1. Ajusta el volumen de inyección entre 0 y 1000 y establece los tiempos de repetición (sin límites).
   2. Haz clic en la Limpieza debajo de "Limpieza completada" para comenzar la limpieza de la tubería del inyector.
   3. Controla el recuento de "Ciclos" para registrar el número de ciclos de lavado completados.
4. Limpieza de la tubería de recolección
   1. Establece el tiempo de purificación (sin límites).
   2. Haz clic en la Limpieza debajo de la "Tubería Actual" para iniciar la limpieza de la cadena de recogida.
   3. Monitoriza la pantalla actual de la tubería para confirmar qué tubería se está limpiando, mientras el sistema procesa secuencialmente desde la tubería 0 hasta la 10.

Figura 2: Interfaz táctil LC-mate para el funcionamiento del método. (A) Pantalla de optimización. (B) Modo umbral. (C) Modo de tiempo. (D) Modo de recoger todos. (E) Limpieza de tuberías. (F) Ajustes. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

6. Instrucciones para guardar datos

1. Activa el guardado automático. El sistema guarda automáticamente el cromatograma tras completar cada ciclo de elución.
2. Realiza el guardado manual. Haz clic en el botón Guardar después de que termine la elución. Introduce los metadatos necesarios en el cuadro de diálogo para guardar el archivo.
3. Selecciona la ubicación de almacenamiento. Elige guardar archivos en el almacenamiento local del dispositivo, una tarjeta SD o un disco USB externo.
   NOTA: Utiliza un disco USB externo para todo el almacenamiento de datos para evitar limitaciones de capacidad y asegurar un acceso fácil a los datos.

Resultados

Purificación del hiperósido 2"-O-galloyl-hiperósido
El 2"-O-Galloyl-hiperósido (2-GH) es un componente soluble en agua principal de Euphorbia helioscopia L., una medicina tradicional china con una larga historia de uso para resolver flema y humedad¹¹. Su estructura química se muestra en la Figura 3. Recientemente se ha encontrado que el 2-GH posee un efec...

Discusión

Estos resultados demuestran que el sistema LC-mate puede realizar de forma autónoma la inyección continua de muestras y la recogida de fracciones siguiendo los parámetros establecidos, minimizando así significativamente la intervención manual y mejorando la eficiencia de la separación. El sistema cuenta con una interfaz fácil de usar, que requiere solo una configuración inicial del hardware seguida de un funcionamiento intuitivo en pantalla táctil.

Para asegur...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cromatógrafo líquido de alto rendimiento - EasySep-1050	Shanghai Tongwei Analysis Technology Co., Ltd. Página web del instrumento EasySep®-1050 https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100522/C140238.htm	1009992	Un sistema HPLC modular preparativo utilizado en el protocolo. Incluye una bomba de entrega de disolventes, un detector UV/VIS y una válvula de inyección manual. Este sistema forma la unidad central de separación que automatiza el LC-mate.
(Columna cromatográfica líquida) Sharpsil-U C18 150 mm (L) y épocas; 30 mm (I.D.) S-10 y micro; m, 100A	Shanghai Xuanmei Industrial Development Co., Ltd.	U180110-300150	Columna cromatográfica C18 en fase invertida con un tamaño de partícula de 10 y mu; m y un tamaño de poro de 100 Å. Está diseñado para la separación de pequeñas moléculas (como fármacos, compuestos orgánicos) y tiene buena reproducibilidad y estabilidad. Las dimensiones de la columna (150 mm de longitud, 30 mm de diámetro interior) la hacen adecuada para cromatografía preparativa o semi-preparativa.
LC-mate	Shanghai Betterren Medical Technology Co., Ltd.. Para cualquier consulta sobre   el instrumento LC-mate, por favor contacte con el autor correspondiente por correo electrónico: wmzhao@simm.ac.cn	GD202200337	Equipos auxiliares para sistemas de cromatografía líquida, probablemente utilizados para la inyección de muestras, gestión de fases móviles o adquisición de datos. Puede integrarse con sistemas HPLC para mejorar la automatización y eficiencia de los procesos experimentales