Evaluación de la funcionalidad multimodal de las células T receptoras de antígenos quiméricos a resolución de una sola célula mediante análisis optofluídico

Summary

La terapia adoptiva con células T utilizando células CAR-T muestra potencial para tratar los cánceres de la sangre, aunque las respuestas duraderas son inconsistentes. Las células T polifuncionales se correlacionan con la durabilidad en remisión, pero los ensayos estándar ocultan subpoblaciones clave. Presentamos un flujo de trabajo de célula única utilizando una plataforma optofluídica para identificar y aislar células CAR-T altamente funcionales para estudios posteriores.

Abstract

La terapia adoptiva con células T es un paradigma de tratamiento novedoso en el que las células T autólogas son modificadas genéticamente para expresar un receptor quimérico de antígeno (CAR) que apunta al tumor antes de su expansión ex vivo y su reinfusión en el paciente. A pesar de las notables demostraciones de potencia antitumoral en pacientes con malignidades hematológicas avanzadas, las respuestas duraderas no se manifiestan en una fracción sustancial de los casos. Aunque varios factores idiosincráticos pueden contribuir a la variabilidad en los resultados clínicos, hay cada vez más evidencia de que el porcentaje de células T polifuncionales en el producto de células CAR-T pre-infusión se correlaciona fuertemente con la durabilidad de la remisión del cáncer. Desafortunadamente, las evaluaciones estándar de productos de células CAR-T actualmente se basan en mediciones de poblaciones masivas o ensayos terminales, lo que limita la capacidad de aislar y estudiar subpoblaciones con propiedades funcionales elevadas. Aquí demostramos un flujo de trabajo que aprovecha una plataforma optofluídica para evaluar tanto el perfil de secreción de citocinas como la activación mediante expresión de CD137 de células CAR-T individuales, lo que puede combinarse opcionalmente con la evaluación de la actividad citotóxica. Las células que presentan el mayor grado de funcionalidad multimodal pueden aislarse para análisis posteriores que informen el diseño de terapias de próxima generación con células CAR-T.

Introduction

Las células T que expresan el receptor de antígenos quiméricos (CAR) han demostrado una notable potencia antitumoral en pacientes con malignidades hematológicas^{avanzadas 1,2}. Sin embargo, una fracción considerable de los pacientes tratados acaba recayendo, lo que pone de manifiesto la necesidad de desarrollar productos de células CAR-T con mayor persistencia^funcional 3,4,5,6. Aunque muchos factores idiosincráticos pueden contribuir a la variabilidad en los resultados clínicos, hay cada vez más evidencia de que el porcentaje de células T polifuncionales en el producto de células CAR-T pre-infusión se correlaciona fuertemente con la durabilidad de la remisión del cáncer. Así, estrategias para enriquecer o modificar células CAR-T con mayor polifuncionalidad podrían dar lugar a productos terapéuticos con mayor potencial para mediar respuestas clínicas ^{duraderas 6,7,8}. Desafortunadamente, los métodos actuales para caracterizar las funciones de las células CAR-T dependen en gran medida de mediciones de población masiva o ensayos terminales. Estos limitan la capacidad de aislar y estudiar subpoblaciones específicas con propiedades multifuncionales elevadas. Por ejemplo, la secreción de citocinas suele evaluarse ya sea por sobrenadantes masivos o mediante tinción intracelular. Este último requiere fijación celular a cambio de información en el nivel⁹ de una sola célula. De manera similar, el potencial citotóxico se evalúa más comúnmente para poblaciones masivas de células CAR-T cuantificando la pérdida de viabilidad célula-objetivo tras el cocultivo de células T/célula objetivo¹⁰. La capacidad de evaluar la secreción, activación y actividad citolítica de citocinas de células CAR-T viables a resolución unicelular podría impulsar el desarrollo de productos terapéuticos con una eficacia antitumoral más duradera.

Aquí presentamos un método para perfilar simultáneamente células CAR-T individuales para su funcionalidad multimodal mediante una plataforma optofluídica de célula única (Figura 1). El sistema utiliza posicionamiento opto-eléctrico (OEP) para mover perlas de captura de citocinas y células individuales a penas espacialmente segregadas, permitiendo evaluaciones funcionales de células CAR-T individuales (Figura 2A). En este protocolo, demostramos un flujo de trabajo para generar células CAR-T mediante transferencia génica no viral y evaluamos la secreción y activación de citocinas mediante CD137 de células CAR-T individuales durante el cocultivo con células objetivo que expresan antígenos y son negativas a antígenos (Figura 3 y Figura 4)¹¹. El potencial para diferenciar citocinas y perfiles de activación entre productos celulares modificados se ejemplifica comparando las células CAR-T estándar con las células c-Jun que^{sobreexpresan 6}. La actividad citotóxica contra células objetivo único también puede evaluarse utilizando lecturas basadas en caspasa o fluorescencia en la plataforma optofluídica (Figura 2B). Sin embargo, se requiere análisis en lapso de tiempo para determinar la cinética de interacción, que puede variar significativamente para cada construcción y experimento CAR. De manera similar, los ensayos de eliminación repetitiva que imitan la estimulación crónica requieren un flujo de trabajo alternativo. Por ello, en este artículo describimos el procedimiento básico para realizar la evaluación de citotoxicidad, pero no analizamos sus aplicaciones detalladas.

Según la evaluación elegida y las características del objetivo, las células CAR-T vivas que presentan el mayor grado de funcionalidad multimodal pueden descargarse del instrumento y transferirse a pozos individuales en placas de 96 pozos para su estudio posterior (Figura 2C).

Protocol

NOTA: El buffer y la preparación de medios se detallan en la Tabla 1.

1. Aislamiento de células T CD8 de cono(s) del sistema de reducción de leucocitos

NOTA: Realizar todos los pasos con técnica estéril y aséptica en un armario de bioseguridad de cultivo de tejidos. Todos los medios para diluciones, lavados y resuspensiones deben mantenerse a 4 °C durante todo el procedimiento.

1. Añadir 15 mL de medio de separación celular (densidad 1,077 g/mL) a cada uno de dos tubos cónicos de 50 mL (tubo de separación).
2. Sostener un cono del sistema de reducción de leucocitos (LRS) (lado cónico hacia abajo) sobre un tubo cónico de 50 mL sin tapa. Con tijeras esterilizadas, corta el tubo de plástico que se extiende por debajo del cono LRS. Apoya el cono LRS sobre el tubo cónico abierto de 50 mL y corta el tubo de plástico de arriba. Recoge aproximadamente entre 8 y 10 mL de sangre en el tubo cónico de 50 mL.
3. Llena el tubo cónico de 50 mL hasta 50 mL con PBS + EDTA (preparado según se indica en la lista de medios y tampones) y pipete para mezclar la sangre diluida. Divide la sangre diluida por igual entre los dos tubos de separación.
4. Centrifuga los tubos de separación con sangre diluida a 750 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT), con 9 como aceleración y 2 como desaceleración.
5. Utilizando una pipeta serológica de 10 mL, recoge y transfiere cuidadosamente la capa buffy de cada tubo de separación a un tubo cónico nuevo de 50 mL.
6. Llenar cada tubo cónico de 50 mL hasta 40 mL con PBS + EDTA y volver a suspender para obtener suspensiones de célula única. Centrifuga las suspensiones monocelulares a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspira el sobrenadante.
7. Resuspende y combina los pellets celulares en 40 mL de PBS + EDTA. Centrifuga la suspensión monocelular a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspira el sobrenadante.
8. Resuspende el pellet celular en PBS + EDTA y determina la densidad celular viable de la suspensión de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante tinción con Trippan Blue.
   NOTA: El azul de tripán es un tinte impermeable a células vivas que tiñe el ADN. Así, tanto los PBMC vivos como las células no nucleadas (es decir, glóbulos rojos) permanecerán sin manchar. Es importante excluir las células pequeñas (por ejemplo, glóbulos rojos) al determinar la densidad viable de PBMC.
9. Transfiere el número deseado de PBMC a un tubo cónico nuevo de 50 mL para el enriquecimiento magnético de células T CD8⁺ . Estimar 10 veces el número deseado de células T CD8⁺ como la cantidad inicial de PBMC requerida para el enriquecimiento magnético. Mantén los reactivos fríos durante el procedimiento.
10. Centrifuga la suspensión de celdas PBMC a 300 x g durante 10 minutos a 4 °C. Aspira el sobrenadante. Resuspende el pellet de celda en 40 μL de buffer MACS (preparado según lo indicado en la lista de medios y buffers) por 1 x 10⁷ celdas.
11. Añade 10 μL de cóctel de biotina-Ab de células T CD8⁺ por cada 1 x 10⁷ celdas. Mezcla pipeteando e incuba durante 5 minutos a 4 °C.
12. Añadir 30 μL de buffer MACS por cada 1 x 10⁷ celdas. Añade 20 μL de microperlas de células T CD8⁺ por cada 1 x 10⁷ celdas. Mezcla pipeteando e incuba durante 10 minutos a 4 °C.
13. Coloca columnas LS preenfriadas sobre un imán. Coloca un tubo cónico de 15 mL debajo para recoger el flujo de líquido. Equilibrar cada columna LS con 3 mL de búfer MACS.
14. Utilizando el mismo tubo cónico de 15 mL que el tubo de recogida, aplica la suspensión de la celda a la columna de LS equilibrada. Lava la columna 3 veces con 1 mL de MACS Buffer. Deja que cada lavado de 1 mL pase completamente por la columna de LS antes de aplicar el siguiente lavado.
15. Resuspender cuidadosamente las células recogidas y determinar la densidad celular viable de la suspensión enriquecida de células CD8⁺ T mediante tinción con azul de tripán.

2. Activación por perlas de células T CD8⁺

1. Calcula el número de perlas humanas CD3/CD28 necesarias para una proporción 1:1 de células T:perlas. La base de bolas de activación contiene 1 x 10⁶ perlas por 25 μL.
2. Haz un vórtice suave en los perlos de activación durante al menos 30 segundos antes de transferir el volumen calculado de la suspensión de las perlas a un tubo cónico de 15 mL. Añade un volumen igual de medio para lavar las cuentas y el vórtice durante al menos 5 segundos.
3. Coloca el tubo cónico de 15 mL en el imán correspondiente durante 1 minuto para recoger las perlas en los laterales del tubo. Aspira y desecha el sobrenadante.
4. Calcular el volumen del medio necesario para una concentración final de células T de 1 x 10⁶ células T/mL. Retirar el tubo cónico de 15 mL del imán y volver a suspender en el volumen calculado del medio de cultivo. Añadir IL-2 humano recombinante a una concentración final de 50 U/mL.
5. Transfiere el medio completamente suplementado al tubo que contiene las células T y vuelve a suspender. Siembra la suspensión celular en un formato adecuado de cultivo celular (por ejemplo, 1 mL en placas de 48 pozos, 2 mL en placas de 24 pozos) e incuba durante 40 horas.

3. Generación de células CAR-T mediante transferencia génica no viral mediante nucleofección

NOTA: El precalentamiento del medio (37 °C), los reactivos (RT) y la centrífuga (RT) es fundamental para proporcionar una alta eficiencia de transferencia genética.

1. Prepara y etiqueta una placa de 48 pozos con 1 mL de medio de cultivo celular para cada condición de nucleofección. Incuba la placa durante al menos 30 minutos para proporcionar un medio tibio y ajustado a_CO2 con pH fisiológico.
2. Enciende el Nucleofector y selecciona las posiciones a nucleofectar dentro de la franja de 16 pozos. Selecciona el programa adecuado (por ejemplo, FI-115 para favorecer alta eficiencia o EO-115 para mayor viabilidad).
3. Saca la placa de cultivo celular con células T de la incubadora y utiliza un microscopio para comprobar el aspecto visual de las células, para obtener una primera impresión de si la activación ha sido exitosa. Las células T activadas con éxito deberían mostrar agrupamiento uniforme y una forma celular agrandada. Un color medio que difiere del medio fresco a un tono ligeramente anaranjado indica que la activación resultó en un estado metabólico más activo y se considera una buena señal. En este punto, un análisis citométrico de flujo de los marcadores de activación temprana CD25 y CD69 puede validar la activación.
4. Resuspender, extraer y contar células T activadas. Calcular el número de células T necesarias considerando de 1,2 a 2 x 10^{células T de 6} por condición. Transfiere el volumen calculado a un tubo cónico nuevo de 15 mL y centrifuga a 200 x g durante 10 minutos en RT.
5. Aspira y descarta el sobrenadante y lava las células T con 10 mL de PBS tibio. Centrifugar a 200 x g durante 10 minutos en RT. Utilizar el tiempo de centrifugación para descongelar los plásmidos que codifican CAR, que normalmente comprenden una concentración de 1 μg/μL de ADN. Ensamblar un plásmido de codificación transposasa (SB100x) (1,0 μg) o minicírculo (0,5 μg) junto con un plásmido codificante CAR (1,0 μg) o un minicírculo (0,6 μg) en un tubo de microcentrifugación individual de 1,5 mL libre de ADN por condición de nucleofección.
6. Preparar una cantidad suficiente de solución de nucleofector P3 con suplemento añadido (por condición: 16,4 μL de solución nucleofector + 3,6 μL de suplemento).
7. Saca el tubo cónico de 15 mL que contiene las células T de la centrífuga, aspira el sobrenadante y centrífuga durante 1 minuto a 200 x g para recoger el líquido residual en el fondo. Lleva una pipeta de 200 μL para eliminar cuidadosamente la mayor cantidad de tampón posible sin tocar la pastilla de celda.
8. Continúa inmediatamente con la resuspensión del perdigón de células T en 20 μL de tampón P3 (según se indica en la lista de materiales) por condición. Transfiere 20 μL de suspensión celular en el tampón P3 al tubo de microcentrifugación de 1,5 mL que contiene las respectivas construcciones, mezcla suavemente sin introducir aire y transfiere la suspensión celular a la tira nucleofección de 16 pozos. Golpea suavemente para eliminar cualquier aire del fondo del pozo.
9. Coloque la tira de 16 pozos en el Sistema Nucleofector 4D y inicie el procedimiento de nucleofección. Tras una nucleofección exitosa, debe verse una cruz verde en la pantalla para cada pozo elegido.
10. Inmediatamente añade 100 μL de medio precalentado de la placa preparada de 48 pozos antes de incubar la tira de 16 pozos durante 10 minutos en la incubadora.
11. Resuspende cuidadosamente 2 a 3 veces, transfiere la suspensión celular a la placa preparada de 48 pozos y vuelve a colocarla en la incubadora.
12. Tras 4-5 horas, se extraen cuidadosamente 500 μL de cada pozo y se añaden con cuidado 500 μL de medio de cultivo fresco y precalentado, complementado con 50 U/mL de IL-2 humano recombinante.
13. Realiza cambios regulares de medio día sí día no para expandir las células, manteniendo una densidad celular entre 0,5 y 2 x^{10 células T de 6} T/mL.
14. En el día 6, retira las cuentas de activación CD3/CD28. Cosecha células T resuspendiéndolas suavemente 10 veces y transfiriendo la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL. Coloca el tubo cónico de 15 mL en el imán correspondiente durante 1 minuto.
15. Aspira la suspensión celular, transfiere a una placa de cultivo fresca y alimenta las células con medio de cultivo fresco suplementado con IL-2 hasta una concentración final de 50 U/mL. Las cuentas deben permanecer visibles en las paredes laterales del tubo cónico de 15 mL que permanece en el imán.
16. Analizar la eficiencia de transferencia génica en el día 7 mediante análisis citométrico de flujo de la expresión de marcadores sustitutos o CAR respectivos antes de proceder a la clasificación magnética de células CAR T positivas para transgenes en el día 8 (Estrategia de Gating en la Figura Suplementaria 1).

4. Enriquecimiento magnético de células T positivas para transgenes

NOTA: Realizar todos los pasos con técnica estéril y aséptica en un armario de bioseguridad de cultivo de tejidos. Todos los medios para diluciones, lavados y resuspensiones deben mantenerse a 4 °C durante todo el procedimiento.

1. Extraer células T resuspendiéndolas suavemente y transfiriéndolas a tubos cónicos de 15 mL. Cuenta las células T, toma el número de células a enriquecer magnéticamente y centrifuga durante 10 minutos a 300 x g.
2. Aspira y descarta el sobrenadante y lava resuspendiendo 10 mL de buffer MACS. Centrifugar durante 10 minutos a 300 x g. Aspira y descarta el sobrenadante.
3. Calcula la cantidad de anticuerpo biotinilado dirigido contra el marcador sustituto (por ejemplo, tEGFR) necesario. Normalmente, el anticuerpo debe ajustarse a 1 μL por cada 1 x 10⁶ células.
4. Resuspende las células T a una densidad de 1 x 10⁷ células por mL y añade la cantidad calculada de anticuerpo biotinilado. Incuba durante 20 minutos a 4 °C.
5. Lava añadiendo 10 mL de tampón MACS y centrifuga 10 minutos a 300 x g. Aspira y descarta el sobrenadante.
6. Resuspender las células T en 1 x 10⁷ celdas por 80 μL de buffer MACS. Añadir microperlas de antibiotina a un volumen de 20 μL por 1 x 10⁷ células. Mezcla bien y incuba durante 15 minutos a 4 °C.
7. Lava añadiendo 10 mL de tampón MACS y centrifuga 10 minutos a 300 x g. Aspira y descarta el sobrenadante. Resuspende las células en 500 μL de buffer MACS.
8. Coloca columnas LS preenfriadas sobre un imán. Coloca un tubo cónico de 15 mL debajo para recoger el flujo de líquido.
9. Equilibrar cada columna LS con 3 mL de búfer MACS. Utilizando el mismo tubo cónico de 15 mL que el tubo de recogida, aplica la suspensión de la celda a la columna de LS equilibrada.
10. Lava la columna 3 veces con 1 mL de MACS Buffer. Deja que cada lavado de 1 mL pase completamente por la columna de LS antes de aplicar el siguiente lavado.
11. Para recoger células transpositivas para transgen, toma la columna de LS del imán y ponla en un tubo cónico fresco de 15 mL. Añade 5 mL de buffer MACS y empuja suavemente el líquido fuera de la columna.
12. Cuenta las celdas aisladas y centrifuga durante 10 minutos a 300 x g. Resuspender las células positivas para transgenes en un volumen adecuado de medio suplementado con IL-2 e incubar hasta realizar evaluaciones funcionales y/o fenotípicas. Realizar una comprobación de pureza antes de iniciar los flujos de trabajo teñiendo para el CAR o marcador sustituto de transducción (Figura suplementaria 2).

5. Preparación del sistema

1. Enciende el instrumento y abre el software Cell Analysis Suite (CAS). Asegúrate de que el contenedor de recogida de residuos esté vacío. Verifica que haya agua en la columna del humidificador.
2. Navega al panel de flujos de trabajo. Abre el flujo de trabajo Full Clean (precargado durante la instalación del sistema).
   NOTA: Se recomienda ejecutar el flujo de trabajo Full Clean dentro de las 72 horas siguientes al inicio de un experimento con el instrumento.
3. Realiza todas las comprobaciones y continúa haciendo clic en Iniciar. Cuando se lo solicite, cambia los tubos cónicos y los frascos de reactivo en cada una de las ranuras de la bahía por recipientes nuevos con solución limpiadora BLI. Haz clic en el icono de Correr para continuar.
4. Cuando se lo pida, cambia los tubos cónicos y las botellas de reactivo en cada una de las ranuras de la bahía de reactivos por recipientes nuevos con agua estéril. Haz clic en el icono de Correr para continuar.
5. Abre el flujo de trabajo Pre-flight Check (precargado durante la instalación del sistema). Realiza todas las comprobaciones y continúa haciendo clic en Iniciar.
6. Prepara un tubo cónico de 50 mL con 2 mL de solución humectante. Prepara un tubo cónico separado de 50 mL con 39,6 mL de 1x DPBS y 400 μL de aditivo humectante.
7. Cuando se lo solicite, sustituye el chip Flush por uno optofluidics. Haz clic en el icono de Correr para continuar. Limpia cuidadosamente la superficie del chip optofluídico y las férulas del nido con etanol al 70% antes de cerrar los nidos.
8. Cuando se lo solicite, cambia los tubos cónicos y las botellas de reactivo en cada una de las ranuras de la bahía de reactivos por recipientes nuevos con las soluciones adecuadas.

6. Creación de flujos de trabajo de ensayo

1. Navega al panel de flujos de trabajo. Selecciona Crear nuevo flujo de trabajo (+), selecciona Perfilado de células T Opto y luego selecciona MCA y Ensayo de Citotoxicidad en el menú desplegable.
2. Haz doble clic en Multiplex Cytokine Bead Load para ampliar la lista de carga de bead. Si se analizan menos de 3 blancos de citocinas, haz clic en la X para eliminar perlas de citocinas de la lista de carga de las perlas.
3. Actualiza cada campo con el tipo de perla correspondiente, el objetivo de la citocina y la ubicación de importación.
   NOTA: El software CAS cargará automáticamente cada perla de captura de citocinas en orden de disminución del brillo Cy5, independientemente de cómo estén organizadas las entradas de carga de la perla.
4. Haz doble clic en Carga Priorizada de APC con Control para ampliar la lista de carga de celda objetivo. Si se ensajan más de 1 celda objetivo de control y 1 línea celular objetivo de muestra, añade pasos adicionales de carga de celdas.
5. Actualiza cada campo con el nombre deseado de la línea celular objetivo, el campo de vistas deseado (FOVs) al lápiz y los criterios de selección del APC (especificando el archivo plantilla de selección de lápiz objetivo (TPS)).
6. Seleccione Configuración de Carga de Células T y seleccione Múltiples Líneas Celdas. Haz doble clic en Carga Priorizada de Células T para ampliar la lista de carga de células T.
7. Actualiza cada campo con el nombre deseado de la línea de células T, los FOV deseados para el pluma y los criterios de selección de células T (especificando el archivo plantilla TPS).
8. Haz doble clic en el ensayo de citotoxicidad para ampliar la configuración del ensayo de citotoxicidad. Actualiza los campos de Configuración de Imagen específicos del flujo de trabajo con la Duración del Ensayo deseada (h).
9. Haz doble clic en los ensayos de fenotipo y citocinas para ampliar el protocolo de tinción del ensayo de secreción de citocinas.
10. Actualiza los campos de On Chip Staining con la ubicación de importación correspondiente para las tinciones primaria y secundaria.
11. Haz doble clic en Descarga de células T para ampliar la lista de descarga. Actualiza el campo # de Exportaciones por Chip (incluyendo espacios en blanco) al número deseado de exportaciones. Guarda y abre el flujo de trabajo recién creado.

7. Carga de perlas de captura de citocinas

1. Sonica y/o vórtice cada frasco de perlas para volver a suspender completamente las cuentas de captura. Determina la concentración de la perla mediante un contador celular.
2. Ajusta la densidad de las perlas a 4,5 x 10⁶ bolas/mL (perlas tipo A) o 4 x 10^{perlas de 6} bolas/mL (perlas tipo B) en 30 μL de tampón de dilución de perlas.
3. Guarda las suspensiones de las perlas a 4 °C hasta que se les indique que se carguen en la bahía de carga de muestras. Realiza todas las comprobaciones y continúa haciendo clic en Iniciar.
4. Cuando se le solicite, mezclar la suspensión de la perla de citocinas con una pipeta de 20 μL y cargar la suspensión de la perla en el lugar de importación correspondiente. Haz clic en el icono de Correr para continuar.
5. Cuando se le solicite, inspecciona visualmente varios FOV para verificar que las perlas de captura han sido cargadas con una distribución uniforme a través de los canales fluídicos a una densidad adecuada. Si la distribución y/o densidad de carga eran subóptimas, selecciona Flush e Import para intentar de nuevo la carga de cuentas. Si la distribución y densidad de carga eran adecuadas, selecciona Proceder para comenzar a colocar cuentas.
6. Repite el paso 7.3 para cada perla de captura de citocinas.

8. Carga de celda objetivo

1. Determinar la densidad de células vivas de cada línea celular objetivo mediante tinción con Trippan Blue.
   NOTA: Este flujo de trabajo asume que las células objetivo provienen de cultivos activos. Si se van a utilizar células criopreservadas en su lugar, asegúrese de que las células hayan sido cultivadas para al menos un paso posterior al deshielo y sean al menos un 90% viables.
2. Extrae 1 x 10⁶ células objetivo en un tubo de microfuga de 1,7 mL. Centrifuga a 300 x g durante 5 minutos en RT. Aspira el sobrenadante.
3. Resuspende cada pellet de célula objetivo en 100 μL de Solución de Tinción Annexin V. Incubar durante 30 minutos en tiempo de descanso, protegido de la luz.
4. Añade 400 μL de 1x Anexin V Binding Buffer y vuelve a suspender pipeteando. Centrifuga a 300 x g durante 5 minutos en RT. Aspira el sobrenadante.
5. Resuspender cada pellet de celda objetivo en 250 μL de medio de carga +_{CaCl 2}. Almacenar las suspensiones de celda objetivo a 4 °C hasta que se indique que se carguen en la bahía de carga de muestras.
6. Cuando se le solicite, resuspende las celdas objetivo con una pipeta de 200 μL y carga la suspensión de celda objetivo en la ubicación de importación correspondiente. Haz clic en el icono de Correr para continuar.
7. Cuando se le solicite, inspecciona visualmente varios FOV para verificar que las celdas objetivo han sido cargadas con una distribución uniforme a través de los canales fluídicos a una densidad adecuada. Si la distribución y/o densidad de carga eran subóptimas, seleccione Vaciar e Importar para intentar de nuevo la carga de celda objetivo. Si la distribución y densidad de carga eran adecuadas, seleccione Proceder para comenzar la retención TPS.
8. Cuando se lo pida, navega a Operaciones Manuales, luego haz clic en TPS y carga la plantilla de TPS solicitada.
9. Especifica el(los) filtro(s) óptico(s) y los FOV que se van a imaginar para definir las puertas TPS, luego haz clic en Capturar solo para iniciar la adquisición de imagen.
10. Abre el Editor de Configuración de Gates, marca la casilla para Annexin y selecciona el canal correspondiente para la tinción Annexin V para el Parámetro X. En el menú desplegable, selecciona Log (Brillo mediano delta). Selecciona OEP para el parámetro Y. Desde el menú desplegable, selecciona Vecino más cercano.
11. Arrastra las esquinas de la puerta resultante para excluir^{las celdas bajas} de Annexin V y Nearest Neighbor, y luego guarda la plantilla TPS sin cambiar el nombre del archivo.
12. Vuelve a Flujos de trabajo y haz clic en Continuar para continuar con la escritura. Repite los pasos 8.7-8.11 para cada línea celular objetivo.

9. Carga de células T

1. Determina la densidad de células vivas de cada línea de células T mediante tinción con azul de tripán.
   NOTA: Este flujo de trabajo asume que las células T provienen de cultivos activos. Si se van a utilizar células criopreservadas en su lugar, asegúrate de que las células hayan sido cultivadas durante la noche tras el deshielo y sean al menos un 90% viables.
2. Cosechar 1 x 10^{células T de 6} en un tubo de microfuga de 1,7 mL. Centrifuga a 300 x g durante 5 minutos en RT. Aspira el sobrenadante.
3. Resuspende cada pellet de célula objetivo en 100 μL de Solución de Tinción Annexin V. Incubar durante 30 minutos en tiempo de descanso, protegido de la luz.
4. Añade 400 μL de 1x Anexin V Binding Buffer y vuelve a suspender pipeteando. Centrifuga a 300 x g durante 5 minutos en RT. Aspira el sobrenadante.
5. Resuspender cada pellet de células T en 250 μL de medio de carga +_{CaCl 2}. Almacenar las suspensiones de células T a 4 °C hasta que se les indique que se carguen en la bahía de carga de muestras.
6. Cuando se solicite, resuspende las celdas objetivo con una pipeta de 200 μL y carga la suspensión de células T en el lugar de importación correspondiente. Haz clic en el icono de Correr para continuar.
7. Cuando se le solicite, inspecciona visualmente varios FOV para verificar que las células T han sido cargadas con una distribución uniforme a través de los canales fluídicos a una densidad adecuada. Si la distribución y/o densidad de carga eran subóptimas, seleccione Vaciar e Importar para intentar de nuevo la carga de las células T. Si la distribución y densidad de carga eran adecuadas, seleccione Proceder para comenzar la retención TPS.
8. Cuando se lo pida, navega a Operaciones Manuales, luego haz clic en TPS y carga la plantilla de TPS solicitada.
9. Especifica el(los) filtro(s) óptico(s) y los FOV que se van a imaginar para definir las puertas TPS, luego haz clic en Capturar solo para iniciar la adquisición de imagen.
10. Abre el Editor de Configuración de Gates, marca la casilla para Annexin y selecciona el canal correspondiente para la tinción Annexin V para el Parámetro X. En el menú desplegable, selecciona Log (Brillo mediano delta). Selecciona OEP para el parámetro Y. Desde el menú desplegable, selecciona Vecino más cercano.
11. Arrastra las esquinas de la puerta resultante para excluir^{las celdas bajas} de Annexin V y Nearest Neighbor, y luego guarda la plantilla TPS sin cambiar el nombre del archivo.
12. Vuelve a Flujos de trabajo y haz clic en Continuar para continuar con la escritura. Repite los pasos 9.7-9.11 para cada línea de células T.

10. Ensayo de citotoxicidad

1. Prepara medios de perfusión en un tubo cónico de 50 mL añadiendo 100 μL de reactivo NucView 530 Caspasa-3 predescongelado a 20 mL de medios de células T (concentración stock 1 mM, concentración final 5 μM).
2. Cuando se le solicite, intercambiar el tubo cónico adecuado en las ranuras de la bahía de reactivos por el tubo cónico preparado que contiene medios de perfusión. Haz clic en el icono de Correr para continuar.
   NOTA: 20 mL de medio de perfusión son suficientes para perfundir un solo chip optofluido durante 24 horas. Prepara medios de perfusión adicionales si el ensayo de citotoxicidad debe durar más de 24 horas.
3. Si se desea, terminar cualquier paso restante del ensayo de imagen de citotoxicidad en cualquier momento tras haber pasado 14 horas haciendo clic en Saltar el resto de la imagen TPS y continuar con el flujo de trabajo.

11. Ensayo de fenotipos y citocinas

1. Prepara la solución primaria de tinción en un tubo microfuge de 1,7 mL mezclando 76 μL de anticuerpos multiplex de detección en panel humano CD8/NK y 4 μL de anti-CD137_BV421.
2. Mezcla pipeteando y guárdalo a 4 °C hasta que se indique que se carga. Cuando se le solicite, mezcle la solución primaria de tinción con una pipeta de 20 μL y cargue en el lugar de importación correspondiente. Haz clic en el icono de Correr para continuar.
3. Prepara la solución secundaria de tinción en un tubo microfuge separado de 1,7 mL mezclando 72 μL de 1x DPBS con 8 μL del kit multiplex SA-PE.
   NOTA: La solución secundaria de tinción debe prepararse de antemano, de modo que esté lista para cargar tan pronto como se complete la tinción primaria.
4. Mezcla pipeteando y guárdalo a 4 °C hasta que se indique que se carga. Cuando se le solicite, mezcle la solución secundaria de tinción con una pipeta de 20 μL y cargue en el lugar de importación correspondiente. Haz clic en el icono de Correr para continuar.

12. Análisis del ensayo

1. Navega al Escritorio y abre el software Anay Analyzer . Selecciona Analizador de ensayos, selecciona Flujos de trabajo y luego selecciona el tipo de flujo de trabajo a analizar.
2. Utiliza cualquier criterio deseado para definir los bolígrafos de interés para descargar. Genera la lista de descarga según los criterios deseados, luego vuelve al software CAS y selecciona Continuar el flujo de trabajo seleccionado.
3. Verifica esa casilla para la lista de Crear exportación con Anay Analyzer para: [ID del chip optofluidics] está marcada.

13. Descargar

1. Prepara una placa de fondo redondeado de 96 pozos con 50 μL de medios de células T por pozo. Haz clic en Continuar para continuar con la descarga de la celda.
2. Cuando se lo pida, abre la bahía de carga de chips, abre la tapa del nido y quita el chip optofluidics. Coloque el chip en una placa de Petri estéril, con el borde superior del chip optofluídico elevado >1° para evitar que las células salgan de los corrales. Guarda en una incubadora de cultivo de tejidos estéril durante el siguiente paso de lavado del tejido.
3. Coloca una ficha Flush estéril en el nido vacío, cierra la tapa del nido y luego cierra la bahía de patatas para astillas. Haz clic en Terminado y luego en Continuar.
4. Cuando se lo pida, abre la bahía de carga de chips, abre la tapa del nido y retira el chip de Flush. Coloca el chip de optofluídicos en el nido vacío, cierra la tapa del nido y luego cierra la bahía de chips. Haz clic en el icono de correr para continuar.
5. Cuando se le pida, seleccione Abrir para mostrar el menú de Cargar/Descargar la placa del pozo . Haz clic en Descargar para quitar la placa anterior. Actualiza el ID de la placa del pozo y el tipo de placa del pozo, selecciona Carga y luego selecciona Listo.
6. Haz clic en Continuar para continuar con la descarga de la celda. Una vez descargados todos los bolígrafos deseados, navega a Operaciones Manuales y abre la bahía de chips para recuperar la placa que contiene las celdas de interés.

Results

Utilizando el protocolo descrito, desafiamos células T CAR simuladas, CAR y c-Jun con sobreexpresión de células T con células tumorales K562 de Figura 3 negativas o positivas para antígenos, o dejándolas sin estimular (solo células T). Las células objetivo fueron evaluadas por su expresión homogénea del antígeno como requisito previo para resultados reproducibles (Figura suplementaria 3). Debido a su aislamiento en nanopens individuales, pudimos caracterizar los perfiles de expresión de citocinas de estas células como productoras simples, dobles o triples, dependiendo de la condición analizada (Figura 3). Estos resultados se verificaron utilizando ELISA como método establecido para la detección de citocinas (Figura suplementaria 4).

Como era de esperar, la mayoría de las células T simuladas nucleofectas permanecieron negativas para las tres citocinas medidas (TNF-α, IFN-γ e IL-2). Entre las células CAR T estándar, se detectaron productores de citocinas IFN-γ dobles, triples y simples positivas, así como pequeñas fracciones de células secretoras de TNF-α e IL-2, tras el desafío de antígenos, mientras que la exposición a células tumorales negativas no indujo secreción multicelular de citocinas. Curiosamente, la sobreexpresión de c-Jun aumentó la proporción de productores de doble y triple citocina, así como de células secretoras de una sola citoquina, al encontrarse con el objetivo, reduciendo así la fracción total de células negativas a citocinas en comparación con las células T CAR estándar. Estos resultados son consistentes con informes previos que describen la modulación fenotípica de las células CAR T mediante la expresión forzada de este factor^{de transcripción 6}. Cabe destacar que observamos una mayor proporción de células IFN-γ-positivas en el grupo solo de células T que en el grupo de células tumorales negativas a antígenos, lo que podría deberse al menor número de células analizadas en esa condición.

Para investigar más a fondo la activación de las células T, evaluamos la expresión de CD137 en células T CAR simuladas, CAR y c-Jun en sobreexpresión tratadas como se describió anteriormente (Figura 4 y Tabla Suplementaria 1). El desafío de células CAR T con células blanco K562 que expresan antígenos resultó en un aumento de la expresión de CD137 en comparación con células simuladas nucleofectadas. Además, observamos una tendencia hacia una proporción ligeramente mayor de células CD137 positivas entre las células CAR T que sobreexpresan c-Jun en comparación con el producto estándar de CAR.

En conclusión, el protocolo descrito permitió evaluar la secreción y activación de citocinas de células CAR T a nivel de célula única, lo que permitió identificar productores de citocinas unicelulares y multicelulares y recapitular tendencias fenotípicas previamente descritas en el nivel^{masivo 6}.

Figura 1: Flujo de trabajo esquemático para el perfilado multimodal a través de una plataforma optofluidica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Imágenes representativas de diferentes características de la plataforma optofluidica. (A) Importar la secuencia de partículas individuales en bolígrafos individuales mediante OEP. Los bolígrafos en la parte izquierda de las imágenes se han cargado en la secuencia anterior. (B) Eventos de muerte en tres corrales individuales a lo largo del tiempo, mostrando células tumorales que expresan antígenos con GFP. (C) Exportación de una celda individual desde un bolígrafo mediante OEP. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Análisis representativo de los perfiles de secreción de citocinas a nivel de célula única. Se cultivaron células T simuladas o CAR-T individuales en presencia o ausencia de células tumorales K562 negativas o positivas para antígenos dentro de nanopentos que contenían perlas de captura de citocinas para TNF-α, IL-2 e IFN-γ. Los gráficos circulares muestran las proporciones de células CAR-T analizadas individualmente con el perfil de secreción de citocinas indicado tras 24 horas de cocultivo (análisis de punto final). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Análisis representativo de la expresión de CD137 a nivel de célula única. Se tinturaron células T simuladas o CAR-T individuales para expresión superficial de CD137 en el chip optofluídico, 24 horas después del cultivo en presencia o ausencia de células tumorales K562 negativas o positivas para antígenos. Los gráficos de violín muestran la intensidad de fluorescencia de la expresión de CD137 en células T y células CAR-T simuladas nucleofectas tras 24 horas de cultivo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Componentes del medio de células T (Filtrado estéril usando unidades de filtro de vacío de 0,22μM)	Volumen (concentración final)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
β-Mercaptoetanol (50mM)	0,5 mL (45μM)
Suero humano (inactivado por calor)	50 mL (9%)
Suplemento GlutaMAX (100 veces)	5mL (0,9x)
Componentes del medio celular tumoral	Volumen (concentración final)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
Suero fetal para terneros (inactivado por calor)	50 mL (9%)
Componentes del buffer MACS	Volumen (concentración final)
DPBS (Mg2+-libre, Ca2+-libre)	500 mL
Suero fetal para terneros (inactivado por calor)	2,5 mL (0,5 %)
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
Componentes de búfer PBS/EDTA	Volumen (concentración final)
DPBS	500 mL
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
Componentes del medio de carga	Volumen (concentración final)
Medio de células T	18 mL
Reactivo de carga	2 mL
Componentes de Medio de Carga+CaCl2	Volumen (concentración final)
Medios de carga	499 μL
CaCl2	1,25 μL
Medio de perfusión + Sustrato de caspasa	Volumen (concentración final)
Medio de células T	20 mL
Sustrato de Caspasa-3 NucView 530 (1 mM en DMSO)	100 μL
Componentes del buffer de dilución de perlas	Volumen (concentración final)
DPBS	800 μL
BSA (2% en parte/v)	100 μL (0,2% p/v)
Preadolescente-20 (10% en trabajo)	10 μL (0,1% p/v)

Tabla 1: Preparación de medios y de tampón.

Figura suplementaria 1. Estrategia ejemplar de gating para evaluar la eficiencia de transferencia génica antes del enriquecimiento magnético. Diagramas ejemplares de contorno e histogramas muestran la estrategia de gating para identificar las células T CAR que expresan CAR (tEGFR-positivas) tras la transferencia génica. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2. Control de pureza después de la clasificación. Diagramas de contorno ejemplares muestran una fracción de células T CAR que expresan CAR (tEGFR-positivo) tras realizar la clasificación magnética. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 3. Expresión de antígenos en células tumorales objetivo. Los histogramas representativos muestran células tumorales WT K562 o están diseñados para expresar ROR1 teñidos con anticuerpo isotipo o dirigido a ROR1 mediante citometría de flujo. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4. Detección de citocinas usando ELISA estándar. Concentraciones de IL-2 e IFN-γ en el sobrenadante tras 24 horas de co-cultivo con células tumorales^{K562 ROR1} en E:T de 4:1, medida mediante ELISA para células CAR frente a células CAR+cJ T. Significación estadística determinada por la prueba t no apareada con *P≤ 0,05, **P≤ 0,01, ***P≤ 0,001, ****P≤ 0,0001. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Células analizadas. La tabla indica el número de células individuales analizadas por condición. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El flujo de trabajo demostrado permite evaluar el perfil de secreción y activación de citocinas de células CAR-T individuales durante el cocultivo con células objetivo positivas y negativas para antígenos, que pueden combinarse opcionalmente con la evaluación de la actividad citolítica. Aunque la capacidad de capturar datos funcionales multimodales a resolución de una sola célula ofrece una forma de analizar el rendimiento de las células CAR T con una precisión sin precedentes, la cuantificabilidad de las mediciones depende en gran medida de la precisión de la tecnología OEP para cargar el mismo número de perlas de captura de citocinas, células objetivo y células CAR-T en cada pluma. Por tanto, es fundamental asegurarse de que la densidad de carga y los criterios de TPS de cada reactivo o muestra de celda estén optimizados para permitir la carga de perlas individuales y/o celdas únicas en cada pluma. Aunque adaptar la concentración de la perla o la suspensión de celda en los canales de fluidica puede permitir una carga adecuada de la pluma, las opciones de Flush e Import de la plataforma sirven como estrategia adicional para volver a intentar el proceso de carga.

Una característica ventajosa del diseño de chips optofluídicos es la segregación de la disposición del lápiz en 22 FOV distintos. Al cargar células T diseñadas con diferentes constructos CAR en distintos FOV dentro del chip optofluídico, también pudimos evaluar si un constructo alternativo que impusiera la sobreexpresión de c-Jun podría mejorar la generación de células CAR-T con funcionalidad multimodal, en comparación con un constructo estándar de CAR (Figura 3 y Figura 4). De este modo, una plataforma optofluídica proporciona medios para identificar rápidamente constructos candidatos de CAR que puedan tener el potencial de aumentar la resistencia de la remisión del cáncer inducido por células CAR-T. Cabe destacar que el análisis de la interacción entre células objetivo y efectoras a nivel de célula única exige un control crucial de parámetros clave, por ejemplo, la heterogeneidad de la expresión de antígenos objetivo en células tumorales y la pureza de la población de células CAR-T (Figura suplementaria 2 y Figura suplementaria 3).

Aunque nos centramos en evaluar la secreción de IL-2, TNF-α e IFN-γ, la amplia gama de analitos solubles que pueden detectarse con paneles multiplex de captura de citocinas disponibles permite una personalización considerable del flujo de trabajo. Los desarrollos recientes ponen de manifiesto que el campo también avanza en la dirección de la citometría de flujo de alta dimensión, abriendo nuevas posibilidades para sinergias con el perfilado funcional de diferentes tipos de células^{inmunitarias 12,13}. Por ejemplo, futuras aplicaciones pueden incluir campañas de cribado para identificar células T reguladoras (Tregs) que expresan CAR polifuncionales. Estos secretan múltiples citocinas antiinflamatorias como TGF-β e^IL-10-14. Así, la adaptabilidad de un sistema optofluídico podría allanar el camino para conocimientos críticos a medida que las inmunoterapias celulares se expanden hacia nuevas fronteras en el tratamiento de enfermedades no malignas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nucleofector 4-D	Lonza
Microperlas de antibiotina	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD3/CD28 Dynabeads	Thermo Fisher	11131D
Kit de aislamiento CD8+ T cell	Miltenyi Biotec	130-096-495
Tubos cónicos (PP) de 15 ml CELLSTAR	Greiner Bio-One	188271-N
Tubos cónicos CELLSTAR de 50 ml (PP)	Greiner Bio-One	227261
Corning 75 cm y sup2; Matraz de cultivo celular de cuello inclinado en forma de U con tapón de sellado	Corning	430720U
Placas de múltiples pozos Costar Clear 24-Well Treated con TC, envueltas individualmente, estériles	Corning	3526
Placas de múltiples pozos Costar Clear 48-well tratadas con TC, envueltas individualmente, estériles	Corning	3548
DPBS, sin calcio, sin magnesio	Thermo Fisher	14190169
Imán DynaMag-15	Thermo Fisher	12301D
EGFR (Erbitux, Cetuximab)	Eli Lilly	NDC 66733-948-23	para conjugación interna (biotina)
Anticuerpo EGFR (C225 (Cetuximab)) [Alexa Fluor 647]	Novus Biologicals	NBP2-75903AF647
Suero bovino fetal, valor	Thermo Fisher	A5256801
Suplemento GlutaMAX (100 veces)	Thermo Fisher	35050038
IL-2 IS humano, grado premium	Miltenyi Biotec	130-097-748
Suero humano	Deutsches Rotes Kreuz (DRK)/ Cruz Roja Alemana (GRC)	N/A
Columna de separación de celdas MACS, LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Kit de 4Nucleofector X de célula primaria P3	Lonza	V4XP-3032
Humano de Pancoll, Densidad: 1,077 g/ml	PanBiotech	P04-60500
Kit de detección de apoptosis PE Annexin V	BD Biociencias	559763
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)	Thermo Fisher	15140122
Kit de Biotinilación y Aislamiento de la Superficie Celular Pierce	Thermo Fisher	A44390
Kit de salida QuadroMACS (LS)	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI 1640 Medium, suplemento de glutamax, HEPES	Thermo Fisher	72400054
Pipetas serológicas 2, 5, 10, 25 y 50 ml	Greiner Bio-One	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
Tinte azul de tripán (0,4%)	Thermo Fisher	15250-061
UltraPure 0,5  M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher	15575020
β-Mercaptoetanol (50mM)	Thermo Fisher	31350010
Reactivos de baliza
Fondo redondeado de placa de 96 pozos	Corning	3799
Chip Beacon Plastic Flush		500-00030
Solución limpiadora BLI, hipocloito sódico, 0,825%	Bruker	520-08000
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A4161
Anticuerpo antihumano Brilliant Violet 421 CD137 (4-1BB)	Bioleyenda	309820
Cloruro de calcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
LEGENDplex Humano IFN-& gamma; Capturas B3, 13X	Bioleyenda	740545
LEGENDplex Cuenta de captura humana IL-2 A5, 13X	Bioleyenda	740934
Anticuerpos de detección del panel Th humano LEGENDplex V02	Bioleyenda	741041
LEGENDplex Humano TNF-& alfa; Captura Bead B7, 13X	Bioleyenda	740711
LEGENDplex SA-PE	Bioleyenda	740452
Sustrato de Caspasa NucView 530, 1 mM en DMSO	Hö Izel	B-10406
Chip OptoSelect 3500	Bruker	500-12001
Azida de sodio	Sigma-Aldrich	S2002
PREADOLESCENTES 20	Sigma-Aldrich	P1379
Amortiguador de exportación vegana	Bruker	520-00040
Botellas VWR Media, Square, PETG, 125 ml	VWR	216-2265
Botellas VWR Media, Square, PETG, 500 ml	VWR	216-2267
Aditivo de humectación	Bruker	520-08016
Solución de humectación	Bruker	520-00009