Análisis de ADN microbiano en el campo utilizando un kit de extracción biológica de campo y una unidad qPCR de campo

Summary

Formas fiables y precisas de análisis de ADN desplegable en el campo son cruciales para muchas industrias. Este artículo ofrece dos métodos para el análisis microbiano ambiental en campo: 1) el aislamiento de ADN microbiano de muestras ambientales utilizando un kit de extracción biológica de campo, y 2) el análisis del ADN mediante la unidad qPCR de campo.

Abstract

A medida que la PCR cuantitativa (qPCR) se adopta más ampliamente en diferentes sectores, la capacidad para extraer y analizar ADN en entornos remotos sin obstáculos logísticos se está volviendo esencial. Un ejemplo claro es la necesidad de herramientas sencillas para cuantificar bacterias degradadoras de contaminantes en lugares remotos afectados por descarrilamientos de trenes o vertidos de petróleo, lo que permita una evaluación oportuna del riesgo y el impacto ambiental. Para lograr esto de forma fiable, los procesos deben ser portátiles y ligeros, fáciles de usar para no científicos, resistentes a la contaminación y capaces de ofrecer resultados rápidos manteniendo un riguroso control de calidad. Aunque existen opciones tanto para la extracción de ácidos nucleicos como para el análisis qPCR fuera del laboratorio desde hace años, solo recientemente los avances tecnológicos han permitido desarrollar sistemas desplegables en campo capaces de un rendimiento fiable y preciso. En este estudio, demostramos el uso de un kit de extracción de ADN de campo junto con instrumentos qPCR portátiles bajo condiciones ambientales realistas. Los ensayos de campo realizados a temperaturas exteriores ambientales de aproximadamente 30 °C demostraron rendimientos de ADN y eficiencias de amplificación comparables a los obtenidos en entornos de laboratorio controlados. Es importante destacar que los resultados obtenidos en el campo demostraron una sensibilidad y reproducibilidad equivalentes, confirmando que los flujos de trabajo portátiles pueden proporcionar datos de alta calidad sin necesidad de infraestructura convencional de laboratorio. Estos hallazgos ponen de manifiesto el potencial de análisis moleculares descentralizados que amplíen el alcance de la qPCR a entornos remotos y con recursos limitados, manteniendo al mismo tiempo la precisión y fiabilidad necesarias para la toma de decisiones.

Introduction

Al considerar análisis de biología molecular, como la qPCR, existen varias limitaciones en la gestión de muestras. Un ejemplo claro es la demanda de herramientas simples y fiables para cuantificar bacterias degradadoras de contaminantes en lugares remotos afectados por descarrilamientos de trenes o liberaciones de petróleo, apoyando la evaluación oportuna del riesgo e impacto^ambiental 1,2,3,4,5. La principal limitación es que, por mucho frío que mantengas la muestra, las comunidades microbianas pueden (y van a) cambiar con el^{tiempo 6,7}. Para garantizar que los datos reflejen con precisión el entorno original del que se recogieron las muestras, se recomienda extraer el ADN de esas muestras en un plazo de 24 horas⁸. Para un ingeniero que recoge muestras microbianas en una plataforma petrolífera marina, o para un científico en el interior de una selva tropical, esta línea temporal no es factible. Llevar una muestra de agua o suelo de uno de estos lugares remotos a una empresa naviera el mismo día y luego enviarla de noche a un laboratorio (todo ello manteniendo la refrigeración), donde el ADN puede extraerse antes del análisis, es simplemente imposible.

Una vez extraído el ADN, el reloj se detiene y toda la información genética de la muestra se conserva indefinidamente con técnicas adecuadas^{de almacenamiento.} Esto hace que el ADN extraído sea increíblemente único en comparación con la gran mayoría de las muestras químicas, metalúrgicas y biológicas, la mayoría de las cuales tienen una vida útil limitada. El ADN archivado puede recuperarse años o décadas después y analizarse en busca de nuevos objetivos en nuevas plataformas. Por esta razón, es crucial que el ADN extraído represente realmente la comunidad microbiana original, y no la alterada por el tránsito retrasado.

Además, la necesidad de que un laboratorio extraiga y analice las muestras limita enormemente tanto la flexibilidad como la consistencia en los programas de muestreo. El coste de la logística por sí solo puede ser prohibitivo para ciertos^{proyectos 10}. La capacidad de analizar muestras, cuantificando con precisión objetivos genéticos de interés en cuestión de horas o incluso minutos tras la muestra, abre muchas puertas para proyectos medioambientales en todo el mundo.

Protocol

NOTA: El siguiente protocolo se realizó utilizando un Bio-Extract Kit (kit de extracción biológica de campo) y la qPCR FieldQuant (qPCR basada en campo).

1. Muestreo de biomasa de aguas subterráneas y un protocolo de aislamiento de ADN utilizando un filtro encapsulado y un kit de extracción biológica de campo

1. Lleva guantes y gafas de seguridad en todos los pasos del paso 1.
2. Preparar la bomba peristáltica y la tubería y purgar el pozo utilizando una purga de volumen estándar, siguiendo la guía¹¹ de muestreo de aguas subterráneas de la Agencia de Protección Ambiental (EPA).
3. Retira el filtro encapsulado, el adaptador, la pinza y los tapones del tubo de centrífuga proporcionado (Figura 1).
4. Pasa la tubería (1/4-5/16 de diámetro interior [I.D.]) a través de la abrazadera proporcionada y aprieta la abrazadera para asegurar la manguera al adaptador de luer de bloqueo (Figura 2).
5. Conecta la entrada del filtro al adaptador Luer-Lock instalado en el paso anterior.
6. Coloca el filtro dentro de un recipiente receptor para que la cantidad de agua filtrada pueda medirse con precisión.
7. Filtra hasta 1 L de agua usando caudales bajos (<0,5 L/min). La cantidad de agua filtrada variará según la turbidez del agua.
   1. Si el filtro se atasca antes de filtrar 1 L, para y continúa con el siguiente paso.
      NOTA: El análisis de ADN es sensible y puede realizarse con tan solo 10 mL, dependiendo de la biomasa del sistema.
8. Anota manualmente el volumen que ha pasado por el filtro en mililitros (mL). Descarta el agua filtrada.
9. Tapa el filtro en ambos extremos. Asegúrate de que el extremo más fino esté cerrado con la tapa roja y el extremo grueso con el tapón blanco Luer-Lock.
10. Coloca el filtro de nuevo en el tubo de plástico que se proporciona.
11. Coloca la etiqueta en el tubo de la centrífuga y anota la cantidad de agua que ha pasado por el filtro, la ubicación, la fecha de muestreo y los análisis solicitados. Guárdalos a 1-4 °C hasta que se extraigan.
    NOTA: Los filtros deben extraerse en un plazo de 24 horas tras el muestreo.
12. Usando las toallitas preparadoras de alcohol incluidas, limpia una superficie plana que pueda usarse para preparar la extracción (por ejemplo, una tabla de madera, portón trasero de camión, etc.)
13. Para extraer el ADN, coloca todos los componentes del campo de extracción biológica Kit sobre la superficie plana y limpia (Figura 3).
    1. Quita los dos extremos del filtro y deja los tapones a un lado para usarlos más tarde. Encuentra y abre una de las jeringuillas de 3 mL incluidas en el kit. Toma aire en la jeringuilla de 3 mL y conéctala al filtro mediante la conexión de bloqueo de la luer.
    2. Expulsa el aire de la jeringuilla para expulsar cualquier agua restante del filtro. Desconecta la jeringuilla y aspira más aire antes de repetir.
    3. Repite varias veces, asegurándote de que se expulse la mayor cantidad de agua posible del filtro. Recubre la tapa roja de salida.
14. Invierte la jeringuilla de la Solución A cerrada varias veces para asegurarte de que está bien mezclada. Quita la tapa de la jeringuilla que bloquea el luer.
15. Conecta la jeringuilla de la Solución A a la entrada del filtro encapsulado de 0,2 μm mediante la punta de bloqueo del luer y añade lentamente toda la Solución A presionando el émbolo. Empujar demasiado rápido puede provocar la formación de contrapresión, así que asegúrate de bajar el émbolo lentamente. Si el atasco del filtro impide añadir la Solución A, quita la tapa roja de salida del filtro y vuelve a intentarlo. Recubre el filtro.
16. Sacude vigorosamente el filtro cerrado durante 5 minutos.
    NOTA: Para evitar la fatiga, se pueden preparar varias muestras hasta este paso y todas pueden apretarse a la mano al mismo tiempo. Si está disponible, se puede usar un mezclador de vórtice recargable para realizar este paso en lugar de hacer el movimiento de mano.
17. Invierte la jeringuilla de solución B cerrada varias veces para asegurarte de que está bien mezclada. Quita el tapón de bloqueo de la jeringuilla.
18. Quita la tapa de entrada del filtro encapsulada. Conecta la jeringuilla de la Solución B a la entrada del filtro encapsulado mediante la punta de bloqueo del luer y añade lentamente toda la Solución B presionando el émbolo. Empujar demasiado rápido puede provocar la formación de contrapresión, así que asegúrate de bajar el émbolo lentamente. Recubre la tapa de entrada del filtro.
19. Sacude vigorosamente el filtro cerrado durante 5 minutos.
    NOTA: Para evitar la fatiga, se pueden preparar varias muestras hasta este paso y todas se apretan a mano al mismo tiempo. Si está disponible, se puede usar un mezclador de vórtice recargable para realizar este paso en lugar de hacer el movimiento de mano.
20. Quita la tapa de entrada.
21. Con el filtro invertido, empuja 1 mL de aire dentro del filtro usando una jeringuilla de 3 mL unida a la unidad de filtro encapsulada y luego tira del émbolo para eliminar la mayor cantidad posible de lisado (líquido).
    NOTA: Si el lisato es particularmente viscoso, puede ser necesario empujar y tirar del émbolo varias veces para extraer la solución del filtro.
22. Añade el lisado a un tubo de perlas de 5 mL. Tapa el tubo y sella con parafilm en la parte superior.
23. Sacude vigorosamente el tubo con la mano durante 5 minutos. Coloca el tubo en posición vertical mientras continúas con los pasos.
    NOTA: Para evitar la fatiga, se pueden preparar varias muestras hasta este paso y todas pueden apretarse a la mano al mismo tiempo. Si está disponible, se puede usar un mezclador de vórtice recargable para realizar este paso en lugar de hacer el movimiento de mano.
24. Evitando la contaminación de la tapa de aluminio, coloca el cartucho de preparación de muestras sobre una superficie plana.
25. Retira la jeringuilla de 1 mL de su embalaje y atornilla la columna con bloqueo de luer al extremo de la jeringuilla. Utiliza la punta puntiaguda de la columna para hacer dos agujeros en la primera sección del cartucho de preparación de muestras.
    PRECAUCIÓN: Algunas secciones del cartucho contienen sales caotrópicas y/o etanol. Lleva guantes y gafas de seguridad.
26. Usando una pipeta volumétrica de plástico, transfiere 1 mL de lisato (solo líquido, evitando transferir las perlas tanto como sea posible) desde el tubo de la perla al agujero recién perforado de la primera sección de preparación del cartucho de muestra. Para obtener mejores resultados, añade lentamente el lisado en un ángulo leve al pipetear en el agujero del papel de aluminio.
27. Inserta la columna de jeringuilla de nuevo en la sección roja del cartucho. Tira el líquido completamente dentro de la jeringuilla y luego échalo fuera. Realiza esta acción de bombeo 10 veces.
28. Expulsa todo el líquido de la jeringuilla y devolviéndolo a la sección roja del cartucho antes de pasar al siguiente paso. No se debe transferir ningún líquido de una sección a otra; esto se aplica a cada paso restante del protocolo de aislamiento del ADN de la muestra.
29. Coloca la punta puntiaguda de la columna de jeringuilla sobre la sección rojo-anaranjada y perfora dos agujeros a través de la barrera de aluminio. Usa el émbolo para sacar todo el volumen de la jeringuilla y el líquido subir por la jeringuilla y bombea de nuevo hacia fuera. Repite este paso una vez para un total de 2 bombas, expulsando todo el líquido. No transfieras ningún líquido al siguiente paso.
30. Coloca la punta puntiaguda de la columna de jeringuillas sobre la sección naranja y perfora dos agujeros a través de la barrera de aluminio. Usa el émbolo para extraer todo el volumen de líquido de la jeringuilla hacia dentro y bombea completamente hacia afuera. No transfieras ningún líquido al siguiente paso.
31. Coloca la punta puntiaguda de la columna de jeringuilla sobre la sección amarilla y perfora dos veces a través de la barrera de aluminio. Usa el émbolo para extraer todo el volumen de líquido de la jeringuilla hacia dentro y bombea completamente hacia afuera. No transfieras ningún líquido al siguiente paso.
32. Coloca la punta puntiaguda de la columna de jeringuilla sobre la sección azul secada al aire y perfora la barrera de papel de aluminio solo una vez. Usa el émbolo para extraer todo el volumen de aire de la jeringuilla hacia dentro y bombea rápidamente hacia afuera. Repite rápidamente esta acción de bombeo un mínimo de 20 veces hasta que la columna parezca seca.
33. Coloca la punta puntiaguda de la columna de jeringuillas sobre la última sección verde y perfora dos veces la barrera de aluminio. Usa el émbolo para extraer todo el volumen de líquido de la jeringuilla hacia dentro y bombea completamente hacia afuera. Repite este paso para un total de 5 bombas.
34. Utilizando la jeringuilla de 1 mL y la columna de preparación de la muestra, transfiere toda la solución de la sección verde a un microtubo bien marcado de 1 mL; esta es la muestra de ADN extraída en el campo. Guárdalos a 1-10 °C (por ejemplo, en una nevera con hielo/bolsas de hielo, o en una nevera, etc.) durante hasta una semana, o hasta que se usen.
    NOTA: Para almacenamiento a largo plazo, las muestras de ADN pueden almacenarse a -20 °C indefinidamente.

2. Protocolo de análisis qPCR basado en campo usando una unidad qPCR de campo

NOTA: El instrumento qPCR basado en campo y el teléfono que controla el instrumento dependen de baterías recargables. Asegúrate de que ambos estén completamente cargados antes de ir al campo.

1. Coloca hasta tres muestras de ADN extraídas en campo en las ranuras puras de la bandeja. Asegúrate de que haya una muestra por sección: una muestra en los espacios 1, 2 o 3, una en los espacios 4, 5 o 6, y una muestra en los espacios 7, 8 o 9.
2. Coloca las tiras de ensayo de cada muestra en las ranuras correspondientes A, B o C de la bandeja. Alina el primer pozo en la tira con la primera ranura en la bandeja.
3. Desbloquea el teléfono y abre la aplicación que lleva el nombre del instrumento qPCR registrado. El teléfono y la unidad qPCR de campo se conectan mediante inalámbrico integrado de corto alcance. Cuando se abra la app, pulsa el botón Start Run .
   NOTA: La aplicación está preinstalada en el teléfono incluido y no puede descargarse en ningún otro sitio.
4. En la siguiente pantalla, pulsa el botón Generar IDs .
5. Esta siguiente pantalla es donde se introduce la información de la muestra para cada muestra; toca debajo de ID de muestra y escribe el nombre de la muestra.
   1. Toma las unidades de muestra y selecciona la unidad de volumen adecuada para el tipo de muestra utilizada en la extracción (gramos [g], mililitros [mL] o hisopo).
   2. Luego toca por debajo de la cantidad de muestra y tipifica el volumen de muestra que se utilizó en la extracción de campo anterior (por ejemplo, mililitros de agua filtrada). Repite este proceso para las dos muestras restantes.
   3. Cuando se complete introducir la información de muestra de todas las muestras, pulse el botón de continuar .
      NOTA: Si se usan menos de 3 muestras, deja el ID de muestra como predeterminado, selecciona cualquier unidad y escribe un 1 en la línea de cantidad de muestra para que las muestras no utilizadas puedan proceder.
6. En la siguiente pantalla, toca la carpeta. Muévete a la siguiente pantalla y pulsa guardar en la carpeta actual.
7. En la siguiente pantalla, escribe el nombre de una carrera y pulsa confirmar.
8. Enciende el instrumento manteniendo pulsado el botón de encendido , situado en la parte superior izquierda del instrumento, hasta que todas las luces frontales del instrumento estén encendidas (~5 s). Luego, pulsa confirmar en la app para continuar.
9. En la siguiente pantalla, toca conectar mediante inalámbrico integrado de corto alcance. Pulsa el botón inalámbrico integrado de corto alcance (un símbolo conocido y registrado) en la parte superior del instrumento hasta que la luz azul comience a parpadear. Pulsa confirmar y espera a que la app y el instrumento se sincronizen juntos. Una vez sincronizadas, toca el nombre del instrumento en la app para seleccionarlo y luego pulsa el botón de conectar para continuar cargando las tiras de ensayo.
   NOTA: Si el instrumento y la app no se sincronizan a la primera, asegúrate de que la luz inalámbrica de corto alcance integrada en el instrumento siga parpadeando y vuelve a escanear.
10. Antes de retirar las tapas de las tiras de ensayo, comprueba que los pellets liofilizados no estén en la parte superior de ninguno de los pozos de ensayo. Si lo están, da un suave golpecito al fondo del pozo para que el pellet baje más dentro del pozo.
11. Quita los tapones de los tubos de la tira de go-strip para la primera muestra. Añade 18 μL de agua estéril al primer pozo de la tira de ensayo y pipotea suavemente arriba y abajo para disolver la bola. Repite para los 2 pozos restantes.
12. Añade 2 μL de la muestra a cada pozo y sella los tubos insertando un conjunto de tapones de tiras de ensayo de goma en los tubos, con las muescas entre los condensadores orientadas hacia la parte trasera de la bandeja. Repite los pasos 2.10-2.12 para las muestras restantes si es necesario. Una vez que todas las tiras de ensayo hayan sido llenas y selladas con tapas, pulsa confirmar en la app.
13. Retira cada tira de ensayo una por una y comprueba si hay burbujas en el fondo de los pozos. Si hay burbujas en el fondo de alguno de los pozos, mueve suavemente la tira hacia adelante y hacia atrás hasta que las burbujas suban hacia la parte superior del pozo. Una vez que todos los pozos hayan sido revisados, pulsa confirmar en la app y procede a cargar las tiras en el instrumento.
14. Abre la tapa del instrumento y coloca las tiras de ensayo en el instrumento qPCR de campo en el mismo orden y orientación que están en la bandeja, de modo que las bisagras del pozo y las muescas entre los tapones estén orientadas hacia la parte trasera del instrumento. Después de añadir todas las tiras, empuja suavemente la tapa hacia abajo hasta que se bloquee y pulsa confirmar.
15. Pulsa el botón de iniciar carrera en la app.
    NOTA: La carrera comenzará y tardará ~45 minutos en completarse usando condiciones preestablecidas. Estas condiciones no son editables.
16. Cuando termine la partida, toca los resultados por correo electrónico. Una vez que el teléfono esté conectado a Wifi, los resultados se enviarán para análisis e informes; Hasta entonces, los resultados se almacenan en el instrumento.
    1. Una vez conectado al Wifi, el usuario tendrá que pulsar de nuevo el botón de enviar para enviar los resultados.
17. Limpia la bandeja entre pasadas para evitar contaminaciones entre muestras.
    NOTA: La salida es un archivo de Excel que contiene valores de umbral de ciclo (Ct) para cada pozo. Estos resultados se envían al laboratorio, que comprueba la calidad de la amplificación y convierte los valores de Ct en abundancias utilizando curvas estándar validadas específicas para cada objetivo qPCR y basándose en el volumen y la matriz de la muestra original. Estos resultados se envían al usuario como entregable electrónico y PDF.

Results

La extracción de ADN de muestras ambientales representativas se realizó utilizando tanto el kit de extracción biológica de campo como un método de laboratorio altamente validado previamente^{descrito 4}. Como se muestra en la Figura 4, se confirmó la finalización exitosa del aislamiento de ADN utilizando el kit de campo al comparar los resultados de qPCR con un método de extracción altamente validado en laboratorio. Esta consistencia confirma que el método preservó la integridad del ADN de las muestras ambientales en el campo.

Los componentes del kit qPCR de campo se muestran en la Figura 5. El análisis de una dilución estándar de cultivo de Dehalococcoides (DHC) utilizando la unidad qPCR de campo se realizó tanto a temperaturas interiores (21 °C) como exteriores (30 °C) para ilustrar la robustez del instrumento en condiciones reales de campo. Los resultados, mostrados en la Figura 6, destacan la baja desviación para 10 repeticiones diferentes de cada una. Para dar un contexto completo, el DHC es un organismo capaz de degradar disolventes clorados y se cuantifica comúnmente mediante qPCR dentro de la industria de remediación ambiental⁴.

Para validar la precisión de los instrumentos, el DHC se analizó a tres concentraciones diferentes utilizando diez instrumentos qPCR de campo realizados en duplicados (Figura 7). Incluso en abundancias bajas, la desviación estándar relativa se mantuvo baja (por debajo del 5%) en todas las corridas. Nótese que, en comparación con la desviación estándar, la desviación estándar relativa es importante para los datos logarítmicos, ya que normaliza los resultados mediante la siguiente ecuación:

Donde RSD es la desviación estándar relativa, σ es la desviación estándar del conjunto de datos y μ es la media del conjunto de datos.

En conjunto, ambos métodos dentro de este artículo proporcionan resultados reproducibles a través de extracciones de campo replicado y ensayos qPCR. El acuerdo entre las extracciones de campo y de laboratorio y el análisis qPCR demuestra que se pueden obtener datos fiables y de alta calidad sin depender de la infraestructura de laboratorio, lo que permite realizar análisis microbianos en entornos remotos o con recursos limitados.

Figura 1: Componentes encapsulados del kit de filtros. El filtro encapsulado se utiliza para filtrar la biomasa de la muestra de agua. Al conectarse a una bomba peristáltica mediante tubos, el agua se empuja a través del filtro. Tras anotar el volumen total de agua, se descarta y la biomasa recogida en el filtro está lista para la extracción de ADN. Componentes: a. tubo estéril que sujeta el filtro y los componentes antes y después de su uso, b. tapa de entrada, c. abrazadera de manguera, adaptador de conexión de tubo de bloqueo de D. Luer, e. filtro encapsulado, f. tapa de salida de goma. Imagen utilizada con permiso de Microbial Insights, ^Inc.12. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Conexión del filtro y la tubería. El tubo se pasa sobre el adaptador de conexión de tubo de bloqueo de luer y se mantiene en su lugar mediante la abrazadera de manguera. El otro extremo de la tubería está conectado a una bomba peristáltica (esta conexión y el funcionamiento de la bomba están fuera del alcance de este protocolo). Imagen utilizada con permiso de Microbial Insights, ^Inc.12. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Componentes del kit de campo de aislamiento de ADN. Todos los componentes son estériles antes de su uso. Los componentes incluyen: (1) kit de filtros encapsulados (véase la Figura 1 para más detalles), (2) jeringuilla de 3 mL, (3) jeringuilla de 1 mL precargada con la Solución A, tapada, (4) 1 mL de jeringuilla precargada con la Solución B, tapada, (5) jeringuilla de 3 mL, (6) tubo de perlas de silicona, (7) jeringuilla de 1 mL con columna de aislamiento, (8) pipeta de transferencia desechable de 1 mL, (9) cartucho de preparación de muestras de aislamiento de ADN, (10) tubo microcentrífuga de 1,5 mL. No en la foto: cuadrados de parafilm para sellar durante la agitación, y toallitas preparadoras con alcohol usadas para limpiar la superficie que se usan para la extracción. Imagen utilizada con permiso de Microbial Insights, ^Inc.12. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Comparación de extracción de campo utilizando muestras del mundo real. Resultados comparativos de qPCR de ADN aislado de dos muestras representativas utilizando un método de laboratorio (barras rojas) frente al kit de extracción biológica (barras azules). Estos no se analizaron en réplica, como sería de esperar en un análisis qPCR estándar. Los objetivos génicos (eje x) muestran abundancia (eje y) dentro de un orden de magnitud para ambos métodos. No se incluye información sobre cada objetivo génico específico porque está fuera del alcance de este artículo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Instrumento y componentes de qPCR basados en campo. Los componentes incluyen: A. El instrumento qPCR basado en campo, la bandeja B. de preparación de muestras, la tira de ensayo C. que contiene reactivos liofilizados, el teléfono D. precargado con la aplicación utilizada para ejecutar el instrumento. Imagen utilizada con permiso de Microbial Insights, ^Inc.12. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Demostración de la robustez de la qPCR en campo. El estándar Dehalococcoides (DHC) analizado en diez réplicas bajo condiciones exteriores (30 °C, barras rojas) e interior (21 °C, barras azules), destacando la fiabilidad del instrumento para el campo. El número de la secuencia replicada se indica a lo largo del eje x y la abundancia calculada de DHC se indica a lo largo del eje y. La media interior (20 °C) se calculó en 4,92 × 10² celda/mL, DE = 1,14 × 10² celdas/mL (n = 10), y la media exterior (30 °C) se calculó en 5,89 × 10² celdas/mL, SD = 1,80 × 10² celda/mL (n = 10). Las mediciones obtenidas a 20 °C y 30 °C no difirieron significativamente (prueba t de Welch, p = 0,17). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Demostración de la precisión de la qPCR en campo. Interpretación de precisión entre 10 instrumentos diferentes, ejecutada en duplicado a tres concentraciones estándar distintas. El valor real y el número de réplica (n = 2 para 10 instrumentos en cada concentración estándar) se listan a lo largo del eje x, con barras de colores específicas para la unidad de campo. El eje y muestra la abundancia calculada para cada secuencia. El porcentaje de desviación estándar relativa para cada concentración estándar se muestra en las líneas punteadas sobre las barras. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discussion

Una característica crítica de este protocolo es que permite la extracción de ADN microbiano y el análisis qPCR en condiciones de campo sin necesidad de infraestructura de laboratorio ni electricidad¹². El método ha sido optimizado para equilibrar portabilidad y fiabilidad, proporcionando resultados reproducibles que son consistentes con los flujos de trabajo de laboratorio incluso cuando se realiza al aire libre bajo un rango de temperaturas^{ambientales 12}. El rango de uso sugerido es de 4 °C a 95 °C (39 °F a 104 °F), y la comparación lado a lado a temperaturas exteriores estándar (30 °C, 86 °F) para un equipo de campo muestra una consistencia fiable (Figura 6). Esta consistencia es esencial para garantizar que los resultados de campo sean interpretables junto con los conjuntos de datos de laboratorio.

Varios pasos son cruciales para el éxito del protocolo. Durante el proceso de extracción, la eliminación completa del líquido de los filtros y la mezcla exhaustiva de los reactivos son importantes para garantizar una lisis eficiente y la recuperación del ADN. Del mismo modo, una transferencia cuidadosa del lisato al cartucho de preparación de la muestra, minimizando el retención de las perlas, es clave para evitar obstrucciones o fallos en la columna. Las estrategias de solución de problemas incluyen ralentizar la depresión del émbolo para reducir la contrapresión y repetir el bombeo de jeringuilla si los lisados viscosos dificultan el movimiento del fluido. Para la qPCR, evitar burbujas en los pozos de ensayo y asegurar una resuspensión completa de los pellets es fundamental para una amplificación precisa.

A pesar de sus ventajas, el método tiene limitaciones. Los rendimientos de ADN pueden ser inferiores a los obtenidos con kits basados en centrifugación de sobremesa, y muestras muy turbias o ricas en compuestos orgánicos pueden poner a prueba el rendimiento de las columnas. Aunque los kits de aislamiento son sencillos y fáciles de usar para cualquiera —incluidos usuarios sin experiencia previa en laboratorio—, existe un riesgo adicional de error al comparar a una persona inexperta en el campo. Además, aunque la unidad qPCR de campo proporciona resultados rápidos, está restringida a un número limitado de reacciones simultáneas (actualmente limitada a 9 dianas génicas por ejecución) en comparación con los termocicladores estándar. Sin embargo, estas limitaciones se compensan con la velocidad del análisis y la capacidad de capturar perfiles de comunidades microbianas en el campo. No hay una limitación inherente sobre qué objetivos qPCR pueden analizarse aparte del catálogo del laboratorio que ofrece la unidad.

La importancia de este método radica en su capacidad para movilizar análisis moleculares, permitiendo la monitorización en tiempo real de poblaciones microbianas en entornos como campos petrolíferos, zonas agrícolas o ecosistemas remotos. Al preservar la integridad del ADN en el punto de muestreo y generar resultados in situ, este enfoque reduce las barreras logísticas, mejora la calidad de los datos y permite una toma de decisiones rápida. Las aplicaciones futuras pueden incluir la vigilancia de patógenos en salud pública, el seguimiento del progreso de la biorremediación o la evaluación de riesgos microbianos en sistemas acuáticos. Con modificaciones menores, la plataforma puede adaptarse continuamente para objetivos moleculares adicionales y ensayos qPCR emergentes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de silicio de 5/16"	Amazon (www.amazon.com)	796753613221	Modelos alternativos pueden ser aceptables
Cámaras frigoríficas	Grapas (www.staples.com)	24299978	Modelos alternativos pueden ser aceptables
Kit de Campo de Aislamiento de ADN	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/bio-extract/	Propietario
Unidad qPCR de campo con accesorios	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/fieldquant/	Propietario
Guantes	Amazon (www.amazon.com)	Depende del tamaño	Modelos alternativos pueden ser aceptables
Filtros de agua subterránea	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
Hielo	Tienda de conveniencia local	NA
Bomba peristáltica Kamoer DIP1500 24 V 1500 mL/min de alta intensidad	Amazon (www.amazon.com)	701705886813	Modelos alternativos pueden ser aceptables
Alicates de punta fina	Amazon (www.amazon.com)	762983170575	Modelos alternativos pueden ser aceptables
Servillas de papel	Grapas (www.staples.com)	2126874	Modelos alternativos pueden ser aceptables
Gafas de seguridad	Amazon (www.amazon.com)	B0BNHKWR6W	Modelos alternativos pueden ser aceptables
Marcador de punta fina con rotulador permanente	Amazon (www.amazon.com)	71641300033	Modelos alternativos pueden ser aceptables