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Artículo de método

Aislamiento y purificación de vesículas extracelulares vegetales de hojas de Arabidopsis utilizando un método optimizado de recogida por lavado apoplástico

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DOI:

10.3791/69715

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24 de marzo de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método optimizado para aislar vesículas extracelulares (EVs) de hojas de Arabidopsis thaliana para apoyar análisis moleculares y funcionales posteriores.

Resumen

Las vesículas extracelulares (EV) son nanopartículas vinculadas a membranas secretadas por diversos organismos y tipos celulares y cada vez se reconocen más como mediadores importantes de la comunicación intercelular y entre reinos. Aunque la biología de los VE está bien establecida en sistemas mamíferos, la investigación sobre los VE en plantas es relativamente reciente y está en rápida expansión, impulsada en parte por la evidencia de que los EV vegetales pueden suministrar pequeños ARN, ARNm, proteínas y otras cargas implicadas en la inmunidad y las interacciones planta-microbio. Sin embargo, aislar vehículos eléctricos de plantas de alta pureza sigue siendo técnicamente complicado debido a las paredes celulares rígidas, la abundancia de metabolitos secundarios y el riesgo de contaminación citosólica durante la recogida de fluidos apoplásicos. Este protocolo describe un flujo de trabajo optimizado para el aislamiento y purificación de vehículos eléctricos vegetales a partir del tejido foliar de Arabidopsis thaliana . Se utiliza un paso de infiltración suave basado en jeringuilla para minimizar el daño celular y las fugas citosólicas, mientras que el uso de láminas individuales (sin pecíolos/tejido vascular) ayuda a reducir la contaminación por contenidos vasculares y intracelulares. Los EV se enriquecen inicialmente mediante centrifugación diferencial y pueden purificarse aún más mediante fraccionamiento por gradiente de densidad de sacarosa o cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). Este protocolo proporciona EVs con integridad estructural preservada y reducción de la contaminación celular al minimizar el daño celular y la fuga citoplasmática durante la recogida de fluidos apósicos, según evaluados mediante análisis de seguimiento de nanopartículas y microscopía electrónica de transmisión. Estas muestras de EV son adecuadas para aplicaciones posteriores, incluyendo perfilado de ARN, proteómica y ensayos funcionales para estudios de interacción planta-microbio. En conjunto, este método proporciona un enfoque reproducible y adaptable para obtener vehículos eléctricos de planta de alta calidad.

Introducción

Las vesículas extracelulares (EV) son partículas de membrana ligadas a la bicapa lipídica secretadas por una amplia variedad de organismos, desde bacterias hasta humanos 1,2. En los sistemas animales, los EVs suelen clasificarse en exosomas, microvesículas y cuerpos apoptóticos en función de sus vías de biogénesis y tamaño3. Los exosomas (~30-150 nm de diámetro) se originan de la fusión de cuerpos multivesiculares (MVB) con la membrana plasmática, lo que conduce a la liberación de vesículasintraluminales 4, mientras que las microvesículas (~100-1000 nm de diámetro) brotan directamente de la membranaplasmática 5. Además de exosomas y microvesículas, las células mammifèras también producen cuerpos apoptóticos, que se liberan durante la muerte celularprogramada 6. Estas vesículas han estado implicadas en la modulación inmunitaria, la progresión tumoral y la administración terapéutica, lo que las convierte en objeto de intensa investigaciónbiomédica 7,8. En las plantas, la clasificación de los EV está menos definida que en animales. Estudios en Arabidopsis thaliana han identificado múltiples subtipos de EV vegetales basándose en diferencias en marcadores proteicos, tamaño y vías de biogénesis potenciales. Estos incluyen los EVs positivos para tetraspanina (TET), que se consideran vesículas similares a exosomas derivadas de cuerposmultivesiculares 9,10,EVs 11 positivos para la proteína sintaxina Penetration 1(PEN1), EVs derivados de orgánullos positivos en exocistos(EXPO) 12,13, así como otras poblaciones de EVs como los EVs14 relacionados con la autofagia y los polensómas15.

Cada vez hay más evidencia que sugiere que las plantas secretan vehículos eléctricos como parte de su estrategia de defensa contra patógenos. Los VE vegetales transportan diversas cargas moleculares, incluyendo pequeños ARN, ARNm y otras moléculas reguladoras, que suprimen la virulencia de patógenos fúngicos y oomicetos 10,16,17,18,19. Estos hallazgos destacan a los VE como vehículos de la "guerra de ARN", permitiendo a las plantas suprimir directamente la expresión génica de patógenos, un mecanismo con profundas implicaciones para la protección decultivos 20. Más allá de la inmunidad, los EVs de las plantas también pueden contribuir a la remodelación de la pared celular, respuestas al estrés y señalización deldesarrollo 21. A diferencia de la investigación en EV animal, donde los protocolos estandarizados de aislamiento y caracterización están ampliamenteestablecidos, el campo de VE en plantas aún está en sus fases formativas. Esto limita la reproducibilidad y la comparabilidad entre estudios, creando una necesidad urgente de metodologías robustas y estandarizadas para aislar y estudiar estas vesículas.

Aislar los VE de plantas presenta desafíos técnicos únicos que no se encuentran en los sistemas animales. Los tejidos vegetales dañados contienen abundantes metabolitos secundarios, restos de la pared celular y fragmentos orgánelos que pueden co-purificarse con los vehículos eléctricos, complicando la caracterización aguasabajo 23. Además, el líquido de lavado apoplástico (AWF), que se utiliza comúnmente como material de partida para el aislamiento y purificación de vehículos eléctricos de plantas, suele producir una mezcla heterogénea de vesículas ycontaminantes 24. Aunque la centrifugación diferencial sigue siendo un enfoque fundamental ampliamente utilizado, no puede resolver completamente subpoblaciones distintas de EV ni separar los EVs de complejos macromolecularescoaislados 25,26. Revisiones recientes y estudios metodológicos han proporcionado importantes orientaciones y consideraciones de mejores prácticas para el aislamiento y caracterización de vehículos eléctricosde plantas 27,28,29,30,31. No obstante, la implementación práctica e integración de estos enfoques sigue siendo un reto, y a menudo se requieren pasos adicionales de purificación como centrifugación por gradiente de densidad y cromatografía de exclusión de tamaño para mejorar la pureza y reproducibilidad de los VE entre estudios.

Aquí presentamos un protocolo simplificado para aislar los vehículos eléctricos del líquido de lavado apoplástico Arabidopsis utilizando una estrategia de purificación en varios pasos. A diferencia de los enfoques de aislamiento de EV vegetales comúnmente utilizados que dependen de la infiltración total de la planta con bombasde vacío 11, este protocolo evita la inclusión de pecíolos y tejidos vasculares, lo que puede aumentar la contaminación por estructuras vasculares. En su lugar, se utilizan láminas aisladas y un método suave de infiltración basado en jeringuilla para mejorar la recogida de apoplastos minimizando la alteración tisular. Un manejo cuidadoso de las hojas, orientación y centrifugación reduce aún más la contaminación por componentes intracelulares, proporcionando un material de partida más limpio para el aislamiento de los vehículos eléctricos. Tras centrifugación diferencial, los EV pueden purificarse aún más mediante fraccionamiento por gradiente de densidad de sacarosa o cromatografía de exclusión por tamaño para lograr una mayor pureza y resolución de la vesícula. Las preparaciones resultantes para los VE son muy adecuadas para aplicaciones posteriores, incluyendo secuenciación de ARN, perfilado proteómico y ensayos funcionales como la interacción de patógenos y los estudios de captación de EV, mejorando así la reproducibilidad y la interpretabilidad en la investigación de VE en plantas.

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Protocolo

NOTA: Realizar pasos de centrifugación en una centrífuga refrigerada a 4 °C para preservar la integridad del vehículo eléctrico. Se deben usar tubos estériles. Todos los pasos de manipulación de muestras deben realizarse de forma rápida y eficiente, idealmente por varias personas trabajando en paralelo, para minimizar el daño tisular y evitar contaminaciones que puedan comprometer la calidad de los vehículos eléctricos.

1. Preparación e infiltración de hojas

  1. Preparar 1 L de tampón de aislamiento de vesículas (VIB) compuesto por 20 mM de hidrato de mes, 2 mM deCaCl 2, 0,1 M de NaCl, pH 6.
  2. Cosecha las zonas distales de las hojas cortando en la base para eliminar el pecíolo.
    NOTA: Se recomienda al menos 100 plantas de cuatro semanas por tratamiento o genotipo para asegurar un rendimiento suficiente de EV. Las plantas de Arabidopsis se cultivaron durante ciclos de 8 horas de luz y 16 horas de oscuridad. No uses hojas que muestren signos visibles de estrés, como blanqueamiento o marchitamiento de hojas.
  3. Lava las hojas con agua de ósmosis inversa (RO) tres veces. Colócalos sobre papel de cocina y sécalos suavemente.
  4. Carga aproximadamente 50 mL de hojas en una jeringuilla de 120 mL. Golpea suavemente la jeringuilla para asentar las hojas.
  5. Añade aproximadamente 60 mL de VIB en la jeringuilla hasta que las hojas estén completamente sumergidas. Expulsa el aire atrapado presionando suavemente el émbolo. Presiona un trozo de parafilm doblado cuatro veces en la punta de la jeringuilla para evitar fugas.
    NOTA: Al realizar infiltración por vacío con jeringuilla, asegúrese de que la jeringuilla y el émbolo estén bien montados antes de aplicar vacío. Aplica la fuerza gradualmente y mantén un agarre firme sobre la jeringuilla para evitar movimientos bruscos del émbolo o pérdida de control.
  6. Infiltra las hojas tirando lentamente del émbolo hacia fuera para crear un vacío. Mantén el émbolo en la posición extendida durante 5 segundos y luego suelta lentamente. Repite este ciclo de infiltración 2-3 veces hasta que las hojas parezcan más oscuras y translúcidas, indicando una infiltración exitosa.
  7. NOTA: Tirar del émbolo requiere una fuerza moderada debido a la resistencia al vacío. La jeringuilla debe sujetarse firmemente mientras el émbolo se retira lentamente para mantener una infiltración controlada.
  8. Una vez que las hojas han sido infiltradas, saca el émbolo. Vierte el exceso de amortiguador en el fregadero.
  9. Repite los pasos 1.4-1.7 hasta que todas las hojas cosechadas estén infiltradas (Figura 1A).

2. Recogida de líquido de lavado apoplástico (AWF)

  1. Corta una tira de cinta Scotch de ~12 pulgadas y colócala con el lado pegajoso hacia arriba. Asegura un extremo de la cinta envolviéndolo alrededor de una jeringuilla vacía e innecesaria de 1 mL justo debajo del extremo más ancho. Coloca cuidadosamente aproximadamente entre 50 y 70 hojas infiltradas en capas superpuestas a lo largo de la superficie pegajosa, posicionándolas de modo que la base de cada hoja mire hacia la jeringuilla inferior y las puntas apunten hacia arriba para la recogida (Figura 1B).
    NOTA: Colocar varias hojas en una tira de cinta ayuda a prevenir daños. Alinear todas las hojas con la pala orientada hacia un extremo y orientada hacia la parte inferior del tubo de recogida para permitir una recuperación eficiente del fluido apoplástico durante la centrifugación.
  2. Envuelve las hojas unidas con cinta firmemente alrededor de la jeringuilla, luego sujeta la parte superior del paquete con dos tiras de cinta Scotch. Introduce la jeringuilla envuelta en un tubo de 50 mL con el extremo cortado de las hojas y la base de la jeringuilla orientada hacia el fondo del tubo. Asegúrate de que las hojas estén bien vendadas, ya que un vendaje suelto puede causar daños en las hojas y liberar células rotas que contaminan el líquido de lavado apoplast (Figura 1B).
  3. Centrifuga la jeringuilla envuelta que contiene hojas infiltradas a 900 × g durante 10 minutos a 4 °C usando una centrífuga refrigerada equipada con un rotor de ángulo fijo. Recoge el líquido de lavado apoplástico en un tubo cónico nuevo de 15 mL y guarda la muestra en hielo. Repite los pasos 2.1-2.3 hasta que todas las hojas se hayan usado para recoger AWF.
    NOTA: El AWF debe ser transparente, no verde ni siquiera verde claro. Un AWF verde indica la presencia de cloroplastos/clorofila y también puede indicar contaminación celular. Para minimizar el daño a las hojas, utiliza un rotor de ángulo fijo.

3. Aislamiento de Arabidopsis EV desde AWF mediante centrifugación diferencial

  1. Centrifugar el líquido de lavado apoplástico recogido a 2.000 g durante 20 minutos a 4 °C utilizando una centrífuga refrigerada equipada con rotor de cubo oscilante, con los ajustes estándar de aceleración y desaceleración. Tras la centrifugación, se utiliza un filtro de celda de nylon de 0,45 μm para eliminar grandes restos celulares del sobrenadante. Descarta la bola. Transfiere el sobrenadante filtrado a nuevos tubos de centrífuga (Figura 2).
  2. Centrifugar el sobrenadante filtrado a 10.000 × g durante 30 minutos a 4 °C utilizando una centrífuga refrigerada equipada con un rotor de ángulo fijo, con los ajustes estándar de aceleración y desaceleración. Descarta el perdigón y conserva el sobrenadante para la ultracentrifugación. Este paso elimina aún más los grandes restos celulares y las vesículas grandes (Figura 2).
  3. Transfiere el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga de 17 mL y ultracentrífuga a 100.000 × g durante 1 hora a 4 °C usando una ultracentrífuga equipada con rotor de cubeta oscilante, con los ajustes estándar de aceleración y desaceleración. Tras la centrifugación, descarte el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en aproximadamente 16 mL de buffer VIB para lavarlo. Repite la ronda de ultracentrifugación para recoger los vehículos eléctricos (Figura 2).
    NOTA: La centrifugación a 100.000 x g se realiza para la sedimentación de pequeñas vesículas como exosomas. Los pasos posteriores de lavado ayudan a eliminar proteínas no EV al volver a suspender el pellet en un tampón. Los tubos de ultracentrífuga deben equilibrarse cuidadosamente según la masa según las especificaciones del fabricante antes de centrifugar. Inspecciona los tubos y rotores en busca de defectos antes de usarlos y asegúrate de que el rotor esté bien asegurado antes de iniciar la marcha.
  4. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender la cápsula en VIB. Utiliza una punta de pipeta para raspar suavemente la parte inferior del tubo y facilitar la recuperación completa del pellet EV (Figura 2).
    NOTA: El perdigón EV suele ser translúcido y puede no ser detectable visualmente una vez resuspendido. Raspar suavemente la parte inferior del tubo facilita el proceso de resuspensión de los vehículos eléctricos. Ajusta el volumen de resuspensión para alcanzar la concentración deseada de EV, ya que volúmenes de resuspensión más pequeños suelen dar lugar a preparaciones de EV más concentradas. Normalmente, la resuspensión de EVs en 50 μL produce concentraciones proteicas de aproximadamente 1-1,5 μg/μL y concentraciones de partículas cercanas a 109-10 10 partículas/mL.
  5. Almacena los VE resuspendidos a 4 °C para uso inmediato o a -80 °C para almacenamiento a largo plazo sin congelación repentina en nitrógeno líquido.
    NOTA: El almacenamiento a largo plazo puede reducir la integridad de los vehículos eléctricos. Utiliza vehículos eléctricos recién preparados siempre que sea posible.

4. Uso de la fraccionación por gradiente de densidad de sacarosa para la purificación de EV

NOTA: La ultracentrifugación por sí sola co-sedimenta varios tipos de vesículas. Para lograr una resolución más fina, se puede emplear fraccionamiento por gradiente de densidad, separando las vesículas según su densidad de flotación y propiedades de flotación. En este enfoque, se utilizan gradientes de sacarosa para enriquecer subpoblaciones definidas de EV. Alternativamente, se pueden utilizar gradientes de iodixanol.

  1. Separación del gradiente de sacarosa de carga superior de los vehículos eléctricos
    1. Prepara stocks de gradiente de sacarosa del 10-90% que incluyan las siguientes concentraciones: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%. 52%, 58%, 64%, 70% y 90% usando VIB. Utiliza un baño María a 60 °C para ayudar a disolver las acciones del 70% y 90%.
    2. Preparar un gradiente discontinuo estratificando 1 mL de cada solución de sacarosa en un tubo ultracentrífuga de 17 mL, comenzando por la solución más concentrada en el fondo y procediendo secuencialmente hasta la menos concentrada. Excluye la capa del 10% de sacarosa al ensamblar el gradiente.
      NOTA: Dispensa cuidadosamente cada capa de densidad a lo largo de la pared interior del tubo para minimizar la mezcla entre capas adyacentes. Se recomienda una pipeta automática ajustada a una velocidad de dispensación lenta para proporcionar un flujo continuo y controlado y mejorar la estabilidad del gradiente. Si se utiliza una pipeta manual normal, la dispensación debe realizarse de forma lenta y constante, con la punta de la pipeta situada justo por encima de la interfaz de la capa anterior, y con cuidado para evitar la formación de burbujas de aire.
    3. Mezcla el pellet EV resuspendido (~100 μg de proteína EV) con 1 mL de solución de sacarosa al 10%. Luego, se añade esta mezcla como la capa final de la capa discontinua. El volumen total será de ~12,1 mL.
    4. Centrifugar a 100.000 g durante 16 horas a 4 °C.
      NOTA: Para tramos prolongados de ultracentrifugación, confirme que los tubos, tapas y rotores están homologados para funcionamiento prolongado a alta velocidad y que se siguen los procedimientos de balanceo recomendados por el fabricante.
    5. Recoge seis fracciones de 2 mL por muestra pipeteando desde arriba. Transfiere cada fracción a un nuevo tubo ultracentrífuga de 17 mL.
    6. Resuspender las fracciones recogidas en un tampón VIB de ~16 mL y centrífuga a 100.000 g durante 1 hora a 4 °C.
    7. Descarta el sobrenadante y luego vuelve a suspender cada pellet en 50 μL de VIB.
      NOTA: El perdigón del EV no es visible. Raspa suavemente el fondo del tubo con la punta de la pipeta para volver a suspender. Ajusta el volumen del buffer según sea necesario (por ejemplo, 10 μL para mayor concentración).
  2. Separación del gradiente de sacarosa de carga inferior de los vehículos eléctricos
    1. Prepara stocks de gradiente de sacarosa del 10-90% que consistan en las siguientes concentraciones: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%, 52%, 58%, 64%, 70% y 90% usando el buffer VIB. Utiliza un baño María a 60 °C para ayudar a disolver las acciones del 70% y 90%.
    2. Mezcla el pellet EV resuspendido (~100 μg de proteína EV) con 1 mL de solución de sacarosa al 90%. Luego, añade esta mezcla como la primera capa de una capa discontinua.
    3. Prepara el gradiente discontinuo restante de sacarosa superponiendo secuencialmente 1 mL de cada solución de sacarosa sobre la mezcla EV-90% de sacarosa, comenzando con 70% de sacarosa y avanzando paso a paso hacia concentraciones más bajas (64%, 58%, 52%, 46%, 40%, 34%, 28%, 22%, 16% y 10%). Dispensa cuidadosamente cada capa a lo largo de la pared del tubo usando una pipeta para minimizar la mezcla entre capas adyacentes. El volumen total será de ~12,1 mL.
    4. Centrifugar a 100.000 g durante 72 horas a 4 °C.
      NOTA: Para tramos prolongados de ultracentrifugación, confirme que los tubos, tapas y rotores están homologados para funcionamiento prolongado a alta velocidad y que se siguen los procedimientos de balanceo recomendados por el fabricante.
    5. Recoge seis fracciones de 2 mL por muestra pipeteando desde arriba. Transfiere cada fracción a un nuevo tubo ultracentrífuga de 17 mL.
    6. Resuspender las fracciones recogidas en un ~16 mL de tampón VIB y centrifugar a 100.000 g durante 1 hora a 4 °C.
    7. Descarta el sobrenadante y luego vuelve a suspender cada perdigón en 50 μL de buffer VIB.
      NOTA: El perdigón del EV no es visible. Raspa suavemente el fondo del tubo con la punta de la pipeta para volver a suspender. Ajusta el volumen del buffer según sea necesario (por ejemplo, 10 μL para mayor concentración).

5. Uso de cromatografía de exclusión de tamaño (columna de 35 nm) para purificar vehículos eléctricos

  1. Preparación del tampón y equilibrio de columnas
    1. Prepara el VIB y todos los buffers adicionales frescos. Filtrar todos los tampones a través de una membrana de 0,22 μm y desgasificar bajo vacío antes de usarlos para evitar la formación de burbujas de aire y la obstrucción de los poros.
      NOTA: Un desgasificación incompleta o el uso de buffers sin filtrar pueden introducir burbujas de aire o partículas en la cama de resina, lo que provoca una interrupción del flujo y una reducción de la eficiencia de separación de los EV. Si se observan burbujas en la columna, la corrida debe detenerse y la columna reequilibrarse.
    2. Deja que la columna y los buffers se equilibren a temperatura ambiente (18-24 °C) antes de retirar los tapones de columna.
      NOTA: La columna y los buffers deben estar completamente equilibrados a temperatura ambiente antes de retirar la tapa. Aplicar un tampón a temperatura ambiente a una columna fría puede provocar la formación de burbujas dentro de la resina, lo que resulta en perfiles de elución distorsionados y una menor reproducibilidad.
    3. Coloca la columna en posición vertical y retira cuidadosamente la tapa superior de la columna.
    4. Quita la tapa inferior y deja que el amortiguador se drene completamente fuera de la columna.
      NOTA: Asegúrese de que el buffer de almacenamiento se haya vaciado completamente de la columna antes de la equilibración.
    5. Equilibrar la columna enjuagando con tres volúmenes de columna (25,5 mL) de buffer VIB desgasificado de 0,22 μm.
  2. Carga de vehículos eléctricos y recogida de muestras
    1. Utiliza 100 μg de proteína EV total para cada purificación SEC. Antes de cargar en la columna SEC, ajusta las muestras de EV a un volumen final de 500 μL usando VIB.
    2. Aplica la suspensión EV de 500 μL directamente sobre la frita de carga en la parte superior de la columna.
    3. Deja que la muestra entre completamente en la cama de resina antes de añadir el buffer VIB. Mantener un flujo continuo de columnas durante toda la separación para asegurar una elusión precisa basada en el tamaño.
      NOTA: El flujo en columnas debe permanecer continuo durante toda la separación. Permitir que la columna se seque o detener el flujo durante largos periodos altera la separación basada en el tamaño y puede provocar solapamiento de fracciones y reducción del enriquecimiento de EV.
    4. Después de que la muestra de EV (500 μL) haya entrado completamente en el lecho de resina, añade 2 mL de VIB y deja que eluya completamente. Este eluado corresponde al volumen muerto de la columna y debe descartarse. Las fracciones de EV se recogieron añadiendo secuencialmente 400 μL de VIB y recogiendo el eluato, repitiendo este proceso para obtener las fracciones 1-6 en tubos microcentrífugas de 1,5 mL.
      NOTA: El volumen muerto no debe contener vehículos eléctricos. Según la validación utilizando la columna de 35 nm, los EVs suelen recuperarse en fracciones 1-3. Si es necesario, el volumen muerto puede evaluarse mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) o inmunoblot para detectar marcadores de EV y así confirmar la ausencia de EVs.
  3. Limpieza y almacenamiento de columnas
    1. Inmediatamente después de la recogida de fracciones, enjuaga la columna con un volumen de columna (8,5 mL) de 0,5 M NaOH para desinfectar la resina. Luego, enjuague la columna con 17 mL de VIB para restaurar el pH del neutro. La columna está entonces lista para cargar la siguiente muestra.
      NOTA: Enjuagar la columna solo con tampón no es suficiente para eliminar proteínas o vesículas residuales. El paso de limpieza con NaOH es esencial para evitar la transferencia entre muestras, especialmente en análisis posteriores de ácidos nucleicos o ARN.
    2. Para almacenamiento a largo plazo, enjuague la columna con dos volúmenes de columna de agua desionizada tras la limpieza, seguidos de dos volúmenes de columna con etanol al 20% para su almacenamiento. Recaptar la columna y guárdala en posición vertical.
      NOTA: Enjuagar la columna con agua desionizada antes del almacenamiento de etanol evita la cristalización de la sal dentro del lecho de resina, lo que preserva el rendimiento de la columna.

6. Validación, cuantificación y evaluación de tamaño/morfología de los EV

  1. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
    1. Mide la distribución del tamaño del EV y la concentración de partículas mediante NTA.
    2. Diluye las muestras de EV a 1:100 en VIB estéril y filtrado a 0,2 μm para lograr una concentración de partículas dentro del rango óptimo de detección (aproximadamente 10⁷-10⁹ partículas/mL).
    3. Mezcla suavemente las muestras diluidas para evitar la formación de burbujas y cárgalas en el instrumento equipado con un láser de 532 nm y una cámara sCMOS de alta sensibilidad.
    4. Realizar adquisición y análisis de datos utilizando el software NS Xplorer con un umbral de detección de 10 nm (hasta 1.000 nm), aplicando un algoritmo dinámico de concentración basado en volumen de observación.
  2. Análisis de Western blot de marcadores EV
    1. Para el análisis de Western blot, lavar y resuspender las fracciones de EV obtenidas tras la separación del gradiente de sacarosa en 50 μL de VIB. Mezclar una aliterota de 10 μL de cada fracción con un tampón de carga SDS, desnaturalizado, y resuelto en un gel de trisglicina al 12% antes de la inmunoblotting con anticuerpos TET8 del marcador EV.
    2. Para fracciones EV derivadas de la SEC, primero se concentran 400 μL de cada fracción a 50 μL utilizando un filtro centrífugo de corte molecular de 100 kDa. Luego, utiliza 10 μL de la muestra concentrada para el análisis de Western blot como se ha descrito anteriormente.
  3. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
    1. Depositar 5 μL de VE suspendidos en VIB en rejillas de carbono-formvar de 300 mallas descargadas con glow-dump. Luego, elimina el exceso de muestra con papel de filtro.
    2. Luego, teñe negativamente la rejilla con 3 μL de tinte de microscopía electrónica, elimina la mecha con papel de filtro y deja que se seque al aire antes de hacer la imagen con un TEM de 300 kV.

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Resultados

Para evaluar si el protocolo optimizado de recogida de AWF reduce el daño tisular y la contaminación citoplasmática, el AWF obtenido mediante nuestro método (Método 1) se comparó directamente con un método alternativo (Método 2) basado en la infiltración de la bomba de vacío de toda laplanta 11. El daño celular tras la infiltración fue evaluado mediante tinción con Trippan Blue, que reveló una reducción notable de la tinción en hojas procesadas mediante el Método ...

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Discusión

Los VE de plantas han surgido como actores clave en la inmunidad vegetal, especialmente en la mediación de la comunicación entre reinos con patógenosfúngicos 32. Cada vez hay más evidencia que muestra que las plantas secretan EVs en el apoplasto, donde funcionan para entregar pequeños ARN (ARNs), ARNm y proteínas que pueden suprimir la virulencia en patógenos invasores, como Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani y el patógeno oomiceto Phytopht...

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Divulgaciones

Los autores no revelan ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

El B.D. cuenta con el apoyo de la beca Pathways to the Doctorate de la Universidad Texas A&M. B.H. cuenta con fondos iniciales de la Universidad Texas A&M y del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos HATCH 7009138 proyecto número: TEX08074.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,45 & micro; Filtros de nylon mVWR76479-032
1 ml de jeringuilla innecesariaBD Biociencias309659
Filtro ultra centrífugo de 100 kDaAmiconUFC 910008
100 ml jeringuilla innecesariaBD Biociencias551721050
Tubos cónicos de 15 mlVWR89039-664
Tubos cónicos de 50 mlVWR89039-656
Arabidopsis thaliana (Col-0)Líneas mantenidas en laboratorioNo aplicable
Rejillas de 300 mallas de formvar de carbonoTED PELLA01753-F
Cinta transparenteCinta mágica escocesaS-9783
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Búfer PBSFabricado en casaNo aplicable
qEV columna original Gen2 35 nmIZON ScienceICO-35
Centrífuga refrigeradaEppendorf5810R
Rotor de ángulo fijo de centrifugadora refrigeradaEppendorfF-34-6-38
Rotor de cubo oscilante refrigerado para centrífugaEppendorfA-4-62
SacarosaVWR470302-810
UltracentrífugaBeckman CoulterXPN-100
Tubos ultracentrífugasBeckman Coulter337986
Tinción UranyLessCiencias de la Microscopía Electrónica250218-01

Referencias

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