Este protocolo describe la fabricación de parches de microaguja disolubles que incorporan nanomicelas de α-lactalbúmina cargadas con capsaicina. El método ofrece un enfoque reproducible y mínimamente invasivo para la administración transdérmica dirigida de bioactivos hidrofóbicos al tejido adiposo, facilitando una reducción eficiente de la grasa local y potencialmente ampliando aplicaciones en el manejo de la obesidad.
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Artículo de método
Fabricación de parches microagujas disolubles cargados con nanomonimilas de α-lactalbúmina para la administración transdérmica de capsaicina y la reducción del tejido adiposo
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Resumen
Resumen
Este protocolo describe la fabricación y aplicación de parches de microaguja disoluble (MN) que contienen nanomicelas de α-lactalbúmina para la administración transdérmica dirigida de capsaicina al tejido adiposo. El proceso comienza con la hidrólisis enzimática parcial de la α-lactalbúmina, que da lugar a péptidos anfifílicos que se autoensamblan en nanomicelas encapsulando el compuesto hidrofóbico capsaicina. Las nanomicelas cargadas de capsaicina se mezclan con una matriz de ácido hialurónico (HA) y alcohol polivinílico (PVA), se funden en moldes de polidimetilsiloxano (PDMS) y se centrifugan para producir matrices de 10 × 10 MN. Tras el secado al vacío, los MNs muestran una resistencia mecánica adecuada para la penetración de la piel y se disuelven en aproximadamente 30 minutos tras la aplicación. Los resultados representativos incluyen microscopía electrónica de barrido, que confirma la morfología uniforme de las MNs, microscopía confocal, que verifica la penetración cutánea y liberación del fármaco, y experimentos in vivo en ratones con dieta alta en grasas (HFD) que mostraron reducción de masa grasa, aumento de la actividad metabólica e inducción del pardeamiento adiposo. Este protocolo proporciona un método reproducible y mínimamente invasivo para la administración transdérmica de bioactivos hidrofóbicos, ofreciendo un enfoque terapéutico prometedor para el manejo de la obesidad. Este protocolo está optimizado para la reproducibilidad y es adecuado para la adaptación a otros bioactivos hidrofóbicos.
Introducción
La obesidad se ha convertido en uno de los desafíos más urgentes en la salud global, con una prevalencia que aumenta de forma constante tanto en países desarrollados como en desarrollo. Según la Organización Mundial de la Salud, más de 650 millones de adultos fueron clasificados como obesos en 2016, y en 2022, aproximadamente el 43% de los adultos de ≥18 años tenían sobrepeso y el 16% vivían con obesidad1. La obesidad está estrechamente asociada con el síndrome metabólico, las enfermedades cardiovasculares, la diabetes tipo 2 y varios tipos de cáncer, lo que supone cargas socioeconómicas y sanitarias considerables. Las estrategias terapéuticas actuales, como la restricción dietética, el ejercicio, la farmacoterapia y la cirugía bariátrica, ofrecen solo beneficios parciales y a menudo transitorios. Estos enfoques suelen sufrir una mala adherencia del paciente, eficacia limitada a largo plazo, alta invasividad y efectos adversosindeseables 4,5. Por ello, existe una necesidad urgente de terapias localizadas seguras, eficaces y que cumplan con el paciente para el manejo de la obesidad.
Los compuestos bioactivos naturales han despertado un interés creciente como agentes antiobesidad debido a sus acciones multisegmentadas y a sus perfiles de seguridad generalmente favorables. Por ejemplo, la rubina, un glucósido flavonoide, exhibe efectos antilipogénicos y reguladores metabólicos al suprimir factores de transcripción adipogénicos y promover la biogénesis mitocondrial6. Se ha informado que la capsaicina, el componente penetrante de los pimientos picantes, mejora el gasto energético, induce el pardeamiento del tejido adiposo blanco e inhibe la acumulación de lípidos mediante la activación del potencial receptor transitorio vaniloide 1 (TRPV1) que emitela señalización 7,8. Sin embargo, la traducción clínica de estos compuestos se ve dificultada por una pobre solubilidad acuosa, baja biodisponibilidad oral, metabolismo acelerado y, en el caso de la capsaicina, irritación gastrointestinal alingerir.
Los sistemas de liberación de fármacos basados en nanotecnología ofrecen soluciones prometedoras a estas limitaciones. Los liposomas, nanopartículas poliméricas y nanoportadores basados en proteínas pueden mejorar notablemente la solubilidad, estabilidad y captación celulardel fármaco 10. En particular, la α-lactalbúmina, una proteína de la leche de origen alimenticio, puede hidrolizarse parcialmente en péptidos anfifílicos que se autoensamblan en nanomicelas capaces de encapsular moléculas hidrofóbicas como lacapsaicina 11. Se ha demostrado que estas nanoestructuras de α-lactalbúmina mejoran la solubilidad, estabilidad y biodisponibilidad de diversos bioactivos hidrofóbicos en matrices alimentarias yfarmacéuticas 12,13. No obstante, la administración sistémica de nanoportadores puede seguir conduciendo a una distribución tejidular fuera del objetivo y a una posible toxicidadsistémica 14.
La tecnología de microagujas (MN) ha surgido como una plataforma mínimamente invasiva y amigable para el paciente para la administración transdérmica de fármacos. Los MN disolubles preparados a partir de polímeros biocompatibles como el ácido hialurónico (HA) y el alcohol polivinílico (PVA) pueden penetrar sin dolor en el estrato córneo, disolverse tras la inserción y permitir una deposición local precisa de fármacos en tejidos objetivo15,16. La combinación de nanoportadores con MNs aumenta aún más la acumulación de fármacos en el tejido adiposo subcutáneo, al tiempo que reduce la exposición sistémica y los efectossecundarios 17. Es importante destacar que los parches de MN disolvibles basados en HA y PVA se están avanzando hacia un uso clínico para la administración transdérmica de vacunas y biofármacos, demostrando una seguridad favorable, aceptación por parte del paciente y manufacturabilidad a escala18.
Basándose en estos avances, el presente estudio describe la fabricación de parches de MN disolubles cargados con nanomicelas de α-lactalbúmina que encapsulan capsaicina. En este protocolo, la α-lactalbúmina se disuelve a 6 mg/mL y se hidroliza enzimáticamente para generar péptidos anfifílicos que se autoensamblan en nanomicelas cargadas de capsaicina. Las nanomicelas se incorporan en una matriz HA/PVA (5% de peso y V cada una) y se funden en moldes de polidimetilsiloxano (PDMS) para formar matrices de 10 × 10 MN con una altura de aguja de 600 μm, una configuración compatible con los procesos estándar de micromoldeo y fácilmente escalable a parches de tamaño humano. Se espera que este diseño integrado mejore la solubilidad y estabilidad de la capsaicina, proporcione una liberación sensible al pH dentro del tejido adiposo y aumente la eficacia local antiobesidad in vivo al promover el marrón del tejido adiposo, suprimir la lipogénesis y mejorar los parámetros metabólicos sistémicos. Aprovechando α-lactalbúmina de grado alimenticio y materiales de disolución de MN clínicamente avanzados, esta plataforma ofrece una estrategia mínimamente invasiva y relevante para traslacionalidad que podría adaptarse a parches a escala humana para la terapia de obesidad autoadministrada y localizada.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales Experimentales en Pekín. El número de aprobación asignado al laboratorio/investigador es AW03019102-3. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de nanomicelas de α-lactalbumina que encapsulan capsaicina 12
- Disuelva α-lactalbúmina en agua desionizada hasta una concentración de 6 mg/mL y ajusta el pH a 7,4. Remueve la solución con un agitador magnético a 8-28 × g hasta que la α-lactalbúmina esté completamente disuelta (normalmente 20-30 minutos).
- Añadir la proteasa Bacillus licheniformis (BLP) a una proporción enzima-sustrato de 1:100 (p/p).
- Incubar la mezcla a 50 °C durante 30 minutos para generar péptidos anfifílicos.
- Termina la reacción calentando la solución a 95 °C durante 5 minutos, luego enfría hasta temperatura ambiente y filtra a través de una membrana de 0,22 μm.
- Disuelve capsaicina en etanol hasta una concentración de 1 mg/mL. Añade la solución de capsaicina gota a gota en la solución peptídica bajo una remoción suave.
- Continúa removiendo durante 2 horas para permitir el autoensamblaje de los nanomicelas.
- Eliminar la capsaicina libre dializando la mezcla (MWCO 3,5 kDa) contra agua desionizada durante 12 horas, reemplazando el agua cada 4 horas.
- Liofilizar (liofilizar) las nanomicelas de α-lactalbúmina preparadas.
- Caracterizar las nanomicelas usando análisis de potencial TEM, DLS y zeta.
2. Fabricación de parches de microagujas solubles 11
- Prepara la solución polimérica disolviendo HA (5% p/v) y PVA (5% p/v) en agua desionizada a 60 °C y removiendo hasta que la solución se despeje.
- Enfría la solución polimérica a temperatura ambiente y mézclala con las nanomicelas cargadas de capsaicina (M(Cap)) en una proporción 4:1.
- Desgasifica la mezcla al vacío en un desecador conectado a una bomba de vacío (aproximadamente −80 kPa) durante 10 minutos para eliminar burbujas de aire antes de fundirla en moldes PDMS.
- Carga 200 μL de la mezcla en moldes PDMS (matriz de 10 × 10 agujas, altura de 600 μm).
- Centrifuga los moldes a 1800 × g en RT durante 10 minutos para asegurar el relleno completo de las cavidades de la microaguja.
- Repite el llenado una vez, seguida de una segunda centrifugación bajo las mismas condiciones que en el paso 2.5, y después seca los moldes al vacío (aproximadamente −80 kPa) a temperatura ambiente durante 12 horas.
- Quita cuidadosamente los parches de microaguja de los moldes.
- Examina la morfología de las microagujas por MEB.
3. Ensayo mecánico de microagujas 19
- Coloca el parche de microaguja en el escenario de un analizador de texturas con las agujas orientadas hacia arriba.
- Comprime el parche usando una sonda a una velocidad de 20 μm/s hasta alcanzar un desplazamiento de 0,7 mm.
- Registra la fuerza de fractura y confirma que es de ≥0,15 N por aguja para asegurar la capacidad de penetración de la piel.
4. Prueba de inserción y disolución in vitro 11
- Afeita la piel abdominal de los ratones y extirpa la piel para pruebas ex vivo .
- Coloca la piel extirpada sobre un soporte de gel de agarosa.
- Presiona firmemente el parche de microaguja sobre la piel durante 30 segundos.
- Mantén el contacto entre el parche y la piel durante 30 minutos.
- Observa la disolución de la aguja.
- Tingue la piel con tinción H&E y visualiza los sitios de inserción bajo CLSM.
5. Estudio de liberación in vitro 11
- Sumerge los parches de microaguja en un tampón PBS (pH 6,5 o 7,4) a 37 °C.
- A intervalos definidos, retira muestras de buffer y repone inmediatamente con un volumen igual de buffer fresco.
- Determina la concentración de capsaicina en las muestras recogidas utilizando HPLC.
- Compara los perfiles de liberación en diferentes condiciones de pH usando HPLC.
6. Aplicación in vivo en ratones obesos inducidos por ICD 11
- Induce obesidad en ratones C57BL/6N alimentando una dieta alta en grasas (HFD, 60% kcal de grasa) durante 8 semanas.
- Dividir aleatoriamente los ratones en cinco grupos: control normal, control HFD, parche de microaguja micela en blanco (MP-M), inyección nanomicela cargada de capsaicina (InJ-M(Cap)) y microaguja nanomicela cargada de capsaicina (MP-M(Cap)).
- Depilar la región inguinal de cada ratón.
- Aplica un parche de microaguja en la zona depilada cada 2 días durante 28 días y mantén el parche en su sitio durante 30 minutos.
- Registra el peso corporal y la ingesta de alimentos cada 2 días durante el periodo de tratamiento.
- Analiza la composición de la grasa corporal total y los tejidos magros mediante una resonancia magnética al final del tratamiento.
- Evalúa la actividad física, el consumo de oxígeno, la producción de CO₂ y el coeficiente respiratorio (QR) en jaulas metabólicas según las instrucciones del fabricante.
- Recoger iWAT, sBAT y órganos principales, fijar, incrustar, seccionar y teñir los tejidos con H&E, y evaluar los cambios histológicos mediante microscopía óptica.
- Realizar Western blot para TRPV1, PPARγ, C/EBPα, UCP1 y Cyt C utilizando procedimientos estándar.
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Resultados
Morfología y caracterización de nanomicelas
La microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostró que las nanomicelas de α-lactalbúmina eran partículas esféricas dispersas uniformemente con una distribución de tamaño estrecha (Figura 1). Tras la encapsulación de capsaicina, el diámetro medio de la partícula aumentó de ~22 nm a ~30 nm, lo que indica una carga exitosa de fármacos en el núcleo micelar. De forma constante, el potencial zeta ...
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Discusión
Este estudio demuestra que los parches de microaguja (MN) disolubles cargados con nanomicelas de α-lactalbúmina que encapsulan capsaicina (M(Cap)) pueden lograr efectos antiobesidad localizados y mínimamente invasivos. α-lactalbúmina nanomicelas encapsularon eficientemente la capsaicina hidrofóbica, mejoraron su dispersibilidad acuosa y aumentaron la captación celular, lo que llevó a una inhibición más fuerte de la adipogénesis y a una biogénesis mitocondrial más prominente en los adipoc...
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Divulgaciones
No hay divulgaciones.
Agradecimientos
Este proyecto fue apoyado por el Fondo de Jóvenes Científicos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (N.º 32202024), el Fondo de Jóvenes Científicos de la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Shandong (N.º ZR2024QC103), el Plan Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Shandong (2025CXGC010803, 2022CXPT022), el Sistema Tecnológico de la Industria Avícola de la Provincia de Shandong (SDAIT-11-10) y el Programa de Colaboración Universidad-Industria financiado por la Oficina de Educación de la ciudad de Yantai, China (Desarrollo de la Plataforma de Vacunas de Próxima Generación para Animales de Compañía).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Preadipocitos 3T3-L1 | ATCC | CL-173 | Línea celular para estudios de adipogénesis |
| Proteasa Bacillus licheniformis (BLP) | Sigma-Aldrich | P5380 | Hidrólisis enzimática de la &alfa;-lactalbúmina |
| Capsaicina (≥ 98%) | Sigma-Aldrich | M2028 | Compuesto activo a encapsular |
| Centrifugadora (≥ 4000 rpm) | Eppendorf | 5810R | Para rellenar moldes |
| Microscopio de barrido láser confocal (CLSM) | Zeiss | LSM 900 | Visualizar la distribución y penetración de las micelas |
| Tinte fluorescente Cy3 | GE Healthcare | PA23001 | Para el marcado de nanomicelas |
| Tintes fluorescentes Cy5 o Cy7 | Fanbo Biochemical, Pekín, China | N/A | Para la imagen de biodistribución |
| Dulbecco' s Modified Eagle' s Medio (DMEM) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Para el cultivo celular |
| Etanol (≥ 99.7%) | Reactivo químico Sinopharm | 100092683 | Disolvente para capsaicina |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 16000-044 | Para el cultivo celular |
| Dieta alta en grasas (60% kcal grasa, D12492) | Research Diets, EE. UU. | D12492 | Para inducir la obesidad en ratones |
| Ácido hialurónico (HA, Mw 100– 300 kDa) | Aladdin Biochemical Technology Co., China | H108124 | Polímero para fabricación de microagujas |
| Isoflurano | RWD, China | R510-22-10 | Anestesia |
| Sistema metabólico de jaulas | Panlab, EE. UU. | N/A | Evaluar la actividad, el consumo de oxígeno y el cuadrante de edad |
| Agua desionizada Milli-Q | Millipore | N/A | Disolvente |
| Sistema de resonancia magnética | NiuMag, China | MesoQMR23-060H-I | Para medir la grasa/composición corporal magra |
| Moldes de microagujas PDMS (10 y veces 10.600 y mu; m de altura) | Blueacre Tecnología o personalizado | N/A | Fabricación de microagujas |
| Penicilina– Estreptomicina | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Para el cultivo celular |
| Suero con fosfato y nbsp; (PBS, pH 7,4) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Amortiguador para estudios in vitro e in vivo |
| Alcohol polivinílico (PVA, Mw 30 y ndash; 70 kDa) | Aladdin Biochemical Technology Co., China | P109389 | Polímero para fabricación de microagujas |
| Microscopio electrónico de barrido (SEM) | FEI Tecnai | G2 F30 | Para caracterizar la morfología de la microaguja |
| Analizador de texturas | BosinTech, Shanghái, China | GRACIAS. XTC-20 | Para probar la resistencia de la microaguja |
| Solución de azul de tripán (0,4%) | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Para visualizar los sitios de inserción de microagujas |
| UV– Espectrofotómetro de vis | PerkinElmer | Lambda 35 | Para ensayos de liberación de fármacos |
| Horno de vacío/desecador | Thermo Fisher Scientific | N/A | Para secar microagujas |
| Aparato de borrado Western | Bio-Rad | Tetra mini-PROTEANO | Análisis de proteínas |
| α-Lactalbumina (≥ 95%) | Sigma-Aldrich | L6010 | Fuente de proteínas para la formación de nanomicelas |
Referencias
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