Ensayo antiproliferativo de placas para cribado in vitro de moléculas bioactivas contra taquizoítos de Toxoplasma gondii

Resumen

Este trabajo pretende describir un método sencillo de ensayo de placa para ayudar en el cribado de nuevas moléculas bioactivas frente a la etapa taquizoítica del protozoo Toxoplasma gondii.

Resumen

La toxoplasmosis es una infección parasitaria comúnmente relacionada con lesiones oculares y malformaciones neonatales. Desde principios de los años 50, el tratamiento de primera línea de esta enfermedad se ha basado en la combinación de sulfadiazina, pirimetamina y ácido folínico. A lo largo de esos años, solo se han introducido unos pocos regímenes alternativos. Esto pone de manifiesto la necesidad de descubrir nuevas moléculas bioactivas contra Toxoplasma gondii. Dado que este patógeno es un parásito intracelular obligatorio, el cribado tradicional de fármacos en laboratorio suele requerir materiales y equipos costosos, como ensayos con proteínas fluorescentes o parásitos que expresan β-galactosidasa. Además, métodos como la cuantificación por microscopía óptica pueden ser lentos. El ensayo de placa es un método que evalúa la intensidad de la proliferación intracelular de patógenos midiendo el número de regiones y el área de destrucción en una monocapa celular dañada por el ciclo lítico del parásito. Este trabajo describe un protocolo optimizado de análisis de placas diseñado para el cribado de moléculas activas contra taquizoítos intracelulares de T. gondii in vitro. Este protocolo utiliza materiales económicos y un sistema de laboratorio sencillo, lo que produce resultados rápidos y reproducibles que facilitan la identificación de nuevas moléculas activas contra este parásito por parte de varios grupos de investigación.

Introducción

La toxoplasmosis es una enfermedad zoonótica con una distribución heterogénea a nivel mundial, que afecta aproximadamente a un tercio de la población^{mundial 1,2}. Los síntomas de esta enfermedad están asociados con el grado de inmunidad del huésped y la replicación del parásito ^3,4. La fase aguda de la enfermedad, caracterizada por la replicación de la etapa taquizoíta, es generalmente asintomática en individuos^{inmunocompetentes 5,6}. En cambio, las personas inmunodeprimidas presentan síntomas más frecuentes, incluyendo síntomas inespecíficos como malestar general, fiebre, así como encefalitis y retinocarbonitis ^6,7,8. A pesar de su importancia clínica, el tratamiento actual disponible es ineficaz contra la etapa de bradizoita Toxoplasma gondii (en fase crónica) y no da lugar a una cura parasitológica. Los eventos adversos de los medicamentos actuales también reducen la adherencia al tratamiento ^9,10,11. Por ello, es necesario encontrar tratamientos nuevos, más seguros y eficaces para la toxoplasmosis.

El desarrollo de nuevos fármacos implica un largo periodo de tiempo, inversiones de miles de millones de dólares y múltiples etapas de investigación. Dado que el coste del desarrollo de medicamentos es elevado, la industria farmacéutica debe seleccionar el mejor candidato con^{antelación 12, 13, 14, 15}. Para el cribado de fármacos, se pueden emplear varios enfoques, incluyendo métodos in silico, el uso de inteligencia artificial y el enfoque más común, los métodos^{biológicos 16,17,18,19}. El cribado biológico in vitro implica el uso de bibliotecas de moléculas (quimiobibliotecas) para poner las moléculas a disposición para la identificación de la actividad^biológica 20,21,22^. Como estas quimiobibliotecas contienen una diversidad de moléculas, es necesario optimizar los recursos y el tiempo. Por lo tanto, el ensayo de placa puede ser un método para ayudar a filtrar rápidamente nuevas moléculas bioactivas contra diversos patógenos, como T. gondii.

El ensayo de placas es un método in vitro que utiliza el ciclo lítico de patógenos intracelulares para cuantificar la concentración de patógenos en una monocapa celular, lo que resulta en la formación de placas necróticas a lo largo del^{tiempo 23}. El primer estudio que utilizó la técnica de ensayo de placas data de principios de la segunda mitad del siglo XX, cuando el equipo de Renato Dulbecco utilizó monocapas de fibroblastos de pollo infectados con el virus de la encefalomielitis equina occidental para demostrar la proporcionalidad entre el número de placas necróticas formadas y la concentración del virus¹⁶. El uso de esta técnica en T. gondii también ha sido bien descrito, como ya lo elucidaron Ufermann y sus^{colaboradores 23}.

Uno de los primeros estudios que utilizó el ensayo de placa para observar una respuesta en la inhibición de T. gondii frente a diferentes concentraciones de moléculas fue realizado por Roberts et al. en 1976-17. Aunque el ensayo de placas se utiliza ampliamente para la titulación^{viral 16,24}, este método ha sido empleado solo por unos pocos grupos de investigación para evaluar la actividad anti-T. gondii de^{moléculas 21,22,25,26,27}. Buscando un ensayo que permitiera analizar bibliotecas de compuestos con alto rendimiento, utilizando materiales económicos y un laboratorio sencillo, se exploró el ensayo de placa como alternativa para el cribado rutinario de fármacos en laboratorio. Esto llevó al establecimiento de un protocolo optimizado que permite la evaluación simultánea de la actividad de diferentes moléculas utilizando materiales simples y un sistema de adquisición de imágenes, produciendo resultados rápidos y reproducibles. Por ello, aquí describimos el protocolo detallado, validado en nuestro laboratorio, para ayudar a otros grupos en el cribado de nuevas moléculas bioactivas contra taquizoítos de T. gondii.

Protocolo

La manipulación de parásitos y cultivos celulares, así como la eliminación y destino de residuos, se realizó conforme a la legislación brasileña, según lo exigido por la Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria (ANVISA) RDC nº 222/2018. Todos los procedimientos fueron supervisados por el Comité Interno de Bioseguridad (CIBio) del ICB-UFMG. Este estudio no implica el uso de animales, humanos ni organismos genéticamente modificados. Subvenciones de CNPq, CAPES y FAPEMIG apoyaron este trabajo. ESMD (CNPq 308082/2023-0) y RWAV (CNPq 305574/2021-3) son becarios de productividad CNPq. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de un medio RPMI-1640 suplementado

NOTA: El medio RPMI-1640 fue desarrollado originalmente para el cultivo de células leucémicas humanas tanto en suspensión como en monocapa. Sin embargo, estudios posteriores han demostrado su idoneidad para una variedad de cultivos celulares de mamíferos.

1. A la botella que contiene 250 mL de RPMI-1640, añade 2,5 mL de 200 mM de L-glutamina (100 veces).
2. Añade 2,5 mL de antibiótico-antimicótico (100x) al medio.
3. A continuación, añade 5,0 mL o 25 mL de suero fetal bovino (FBS) al frasco con RPMI-1640 (FBS al 2% o 10%).
4. Guárdalo en un frigorífico (2-8 °C).

2. Preparación de PBS (1x)

NOTA: Para preparar 1 L de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,2 y 25 °C, siga los pasos siguientes.

1. Mide las siguientes cantidades de sales por separado: 1,4 g de Na_{2HPO 4}, 0,24 g de_{KH 2}PO₄ y 8,5 g de NaCl.
2. Añade las sales pesadas por separado en un vaso de precipitados de 1 L que contenga 800 mL de agua desionizada. Remueve la solución hasta que todas las sales estén completamente disueltas.
3. Mide el pH de la solución usando un medidor de pH. Debería ser 7,2. Si es necesario, utiliza 6 M de ácido clorhídrico o 3 M de hidróxido de sodio para llevar el pH a 7,2.
4. Utilizando una varilla de vidrio, transfiere cuantitativamente la solución anterior a un matraz volumétrico de 1 L.
5. Añadir agua desionizada al matraz volumétrico hasta que el volumen total alcance 1 L, asegurando que el menisco esté en la marca correcta.
6. Mezcla la solución en el matraz volumétrico, invirtiéndola suavemente.
7. Divide la solución final de PBS en botellas de vidrio más pequeñas (100-250 mL).
8. Autoclave de las botellas a 121 °C, 1,1 kg/^cm2 durante 15 minutos.
9. Guarda la solución de PBS en la nevera (2-8 °C).
   NOTA 1: Utilice PBS a 37 °C para todos los experimentos.

3. Preparación de una solución de formaldehído al 4%

1. Mezcla 35,68 mL de 1 PBS y 4,32 mL de formaldehído P.A. al 37%.
2. Guarda la solución en un matraz de plástico a temperatura ambiente (25 °C).

4. Preparación de la solución stock de las moléculas activas

NOTA: Comprueba la solubilidad de las moléculas en DMSO, DMF, etanol o agua, y selecciona el disolvente más adecuado. Para minimizar los posibles efectos de la toxicidad diluyente en parásitos, la solución de origen debe estar al menos 1000 veces más concentrada que la concentración más alta del compuesto a analizar. Por ejemplo, si la concentración más alta a analizar es 1 μM, la solución estándar debe ser al menos 1 mM. Para preparar una solución de 10 mM, sigue los siguientes pasos:

1. Pesa el compuesto a probar usando una balanza analítica con una precisión de 0,0001 g.
2. Determina el volumen del diluyente necesario para obtener una solución de 10 mM usando la siguiente fórmula:
   V (mL) = (Y MM) x 100
   Dónde:
   Y: masa del compuesto en miligramos (mg)
   MM: masa molar del compuesto
   V (mL): volumen del disolvente
3. Añade el diluyente al recipiente que contiene el compuesto ponderado.
4. Homogeneiza usando un mezclador de vórtice.
5. Divide la solución en pequeñas alicuotas y guárdalas en un congelador a -20 °C.
6. Antes de usar, deja que la solución alicuota se descongele completamente y se homogeneice de nuevo usando un mezclador de vórtice.
   NOTA: Para preparar soluciones sub-stock con otras concentraciones, utilice la siguiente fórmula
   V (μL) = x mM × y μL/10 mM
   V (μL) ∶ volumen de la solución estándar necesaria para preparar la nueva solución
   x mM: concentración deseada de la nueva solución.
   y (μL): volumen deseado de la nueva solución.

5. Cultivo celular

1. Utiliza las células NHDF girando suavemente el vial en el baño maria de 37 °C.
   NOTA: Las células NHDF pueden ser reemplazadas por fibroblastos del prepucio humano (HFF) u otras líneas celulares que forman una monocapa estable. El ensayo de placa solo funciona con líneas celulares que forman una monocapa estable, es decir, células cuyo crecimiento se detiene por contacto. No se pueden utilizar líneas celulares que no presentan inhibición de la proliferación, como las líneas tumorales, ya que las células compiten con los parásitos por los nutrientes en el medio de cultivo y reponen la zona de placa formada por los parásitos.
2. Transfiere inmediatamente las células descongeladas a un tubo cónico de 15 mL que contiene 10 mL de medio RPMI-1640 suplementado (véase paso 1).
3. Centrifuga las pilas a 200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Cuando el ciclo de centrifugado termina, debe verse una pastilla de celda en la parte inferior del tubo.
4. Desecha cuidadosamente el sobrenadante para preservar la bolita celular.
5. Resuspende el pellet celular con 12 mL de medio RPMI-1640 suplementado que contenga un 10% de FBS y siembra tres frascos^{de cultivo de 25} cm de 25 cm o uno^{de 2} matraz de 75 cm. Después de 2-3 días, examina el(los) matraz(es) de cultivo utilizando un microscopio de contraste de fase invertido para determinar la recuperación de la proliferación celular (las células deben mostrar al menos un 40%-50% de confluencia).
6. Cuando las células alcanzan una monocapa completa (confluencia al 100%), se retira el medio del matraz con una pipeta Pasteur. Descarta el medio y la pipeta.
7. Añade 1-2 mL de PBS 1 vez al frasco, espera 1 minuto y retira el PBS.
8. Añade 1 mL de solución de tripsina-verseno al 0,05% al matraz y colócalo en la incubadora con 5% de_CO2, humedad y una temperatura de 37 °C durante 2 minutos.
9. Tras 2 minutos, observa las células con el microscopio invertido para confirmar que se han desprendido.
10. Resuspender las células separadas con un medio RPMI-1640 suplementado de 24 mL con un 10% de FBS utilizando una pipeta serológica de 10 mL y un dispensador automático de pipeta.
    NOTA: Cada matraz de cultivo de 25 o 75 cm² con una monocapa confluente es capaz de replicarse en otras 5 o 15 botellas de cultivo de 25 cm², respectivamente.
11. Tras añadir el volumen necesario del medio (24 mL), homogeneizar la suspensión celular con la pipeta serológica.
12. Transfiere 4 mL de la suspensión celular en medio a cada 2 matraz de 25 cm o de 12 mL a² matrazas de 75 cm. Recuerda dejar 4 mL de suspensión de celda en el matraz inicial.
13. Coloque los frascos en una incubadora con 5% de_CO2, humedad y una temperatura de 37 °C.
14. Espera hasta que se obtenga una monocapa completa de células (100% de la confluencia).
    NOTA: Identifique cada frasco con la fecha y el número de paso.

6. Preparación de placas de cultivo

1. Inspecciona la integridad de la monocapa celular (confluencia al 100%) en el matraz de cultivo usando un microscopio invertido.
2. Sigue el procedimiento de tripsinización descrito anteriormente (pasos 5.7-5.9).
3. Utilizando una pipeta sorológica de 5 mL, resuspende las células desprendidas con un medio RPMI de 4 mL y transfierelas a un tubo cónico de 15 mL.
4. Centrifuga a 200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente durante 5 minutos.
5. Descarta cuidadosamente el sobrenadante.
6. Suspende la pastilla de celda con 1 mL de medio RPMI-1640 fresco.
7. Homogeneiza usando un mezclador de vórtice.
8. Transfiere 10 μL a un tubo de 1,5 mL que contenga 490 μL de una solución de formaldehído al 4% (dilución 1:50) utilizando una micropipeta con punta estéril.
   NOTA: Factor de dilución = (Volumen total (μL)) / (Volumen de muestra (μL))
9. Montar una cámara Neubauer.
10. Homogeneizar la solución fijadora con los parásitos (preparado en el punto 6.8) usando un mezclador de vórtice.
11. Añadir 10 μL de la solución con los parásitos fijos en la cámara de Neubauer.
12. Cuenta los cuatro cuadrantes de la cámara de Neubauer, cada uno compuesto por 16 casillas.
13. Determina el número de celdas por mL:
    Número de celdas (por mL) = [(n° celdas por cuadrado)/4] x Fd x 10⁴
    Dónde:
    Fd (factor de dilución) = 50
14. Siembra cada pozo de una placa de cultivo de 12 o 6 pozos, con 5 × 10 de⁴ o 10 de 5 celdas, respectivamente, resuspendidas en 1 o 2 mL de medio RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS.
15. Colocar las placas en una incubadora con un 5% de_CO2, una atmósfera húmeda y una temperatura de 37 °C.
16. Espera hasta que la monocapa celular alcance el 100% de confluencia.

7. Cultivo in vitro con taquizoíta

NOTA: Para el ensayo de placas, recomendamos la cepa RH de T. gondii.

1. Desechar el medio antiguo de un matraz² de 25 cm que contiene una monocapa completa (confluencia al 100%) de células NHDF usando una pipeta Pasteur. A continuación, añade 4 mL de medio completo RPMI-1640 nuevo al matraz.
2. Transfiere 5 μL de un sobrenadante que contenga taquizoítos recién emergidos de un matraz anterior con un cultivo infectado lisado. El volumen de 5 μL permite un ciclo lítico de 6-7 días por matraz de 25 cm².
3. Colocar el nuevo matraz infectado en una incubadora con 5% de_CO2, una atmósfera húmeda y una temperatura de 37 °C.

8. Cuantificación de taquizoítas

1. Retirar el medio del matraz de cultivo que contiene los parásitos recién expulsados usando una pipeta Pasteur y transfiere a un tubo cónico de 15 mL.
2. Centrifuga el tubo a 760 x g a temperatura ambiente durante 2 minutos. Cuando termina el ciclo de centrifugado, se ve un pellet visible en la parte inferior del tubo.
3. Descarta cuidadosamente el sobrenadante.
4. Resuspende el pellet parásito con 1 mL de medio RPMI-1640 fresco con un 2% de FBS.
5. Homogeneiza la suspensión parasitaria usando un mezclador de vórtice.
6. Transfiere 10 μL de la suspensión parasitaria a un tubo de 1,5 mL que contenga 490 μL de solución de formaldehído al 4% (dilución 1:50) con una pipeta de punta estéril.
7. Sigue los pasos descritos en la 6.10 a la 6.12.
8. Determinar el número de taquizoítos por 1 mL.
   NOTA: Número de taquizoítos (por mL) = [(n° taquizoítos de cuadrado)/4] x Fd x 10⁴
   Dónde:
   Fd (factor de dilución) = 50

9. Preparación de ensayos de placas para moléculas activas en creación S a partir de una quimiobiblioteca

NOTA: Este ensayo tiene como objetivo identificar moléculas que reducen la proliferación de T. gondii en más de un 50% a una concentración de 1 μM. Antes de iniciar este ensayo, debe realizarse un ensayo de citotoxicidad (por ejemplo, método MTS o método MTT) para asegurar que las concentraciones de compuestos utilizadas en el ensayo de placa no sean tóxicas para las células hospedadoras.

1. Confirmar que los cultivos celulares han alcanzado la confluencia del 100% en las placas de 12 o 6 pozos.
2. Descarta el medio antiguo y añade 1 o 2 mL de medio RPMI-1640 fresco suplementado con un 2% de FBS a cada pozo en las placas de 12 y 6 pozos, respectivamente.
3. Añade los compuestos a analizar en cada pozo a la concentración deseada. Para el cribado inicial, se recomienda una concentración de 1 μM.
   NOTA: Utilice la siguiente fórmula para calcular el volumen a añadir a cada pozo.
   V (μL) = (Concentración final en el pozo (μM) x Volumen dentro del pozo (μL))/(Solución stock (μM))
4. Añadir 600 taquizoítas (para la placa de 12 pozos) o 1.000 taquizoítas (para la placa de 6 pozos) de la deformación RH a cada pozo de placa.
   NOTA: Las variaciones en la proliferación de parásitos pueden deberse a diferencias en los proveedores de medio de cultivo o FBS, o a las líneas celulares utilizadas. Por ello, se recomienda realizar un experimento piloto para determinar el número óptimo de parásitos para cada condición de laboratorio. Ajusta la cantidad de parásito utilizado en este experimento, si es necesario.
5. Colocar las placas en un incubador a 37 °C con 5% de_CO2 y una atmósfera húmeda durante 7 días sin ninguna perturbación.
   PRECAUCIÓN: No se deben mover ni tocar las placas durante el periodo de incubación de 7 días. Si esto ocurre, el experimento se arruinará.

10. Tinción de placas con violeta cristalino y adquisición de imágenes

1. Después de 7 días, retira el medio de cada pozo.
2. Lava cada pozo cuidadosamente con 1x PBS a temperatura ambiente.
3. Descarta el PBS y añade cuidadosamente 1 mL de alcohol al 70% en cada pozo. Déjalo a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego deséchalo.
4. Añade la solución acuosa de violeta cristalina al 0,5% y déjala reposar 30 minutos a temperatura ambiente.
5. Elimina la solución de violeta cristalina.
6. Lava cada pozo cuidadosamente una vez con agua desionizada.
   PRECAUCIÓN: Al retirar el medio o PBS durante los pasos de lavado, no toque el fondo del pozo con la punta de la pipeta, ya que esto puede dañar la integridad de la monocapa. Durante los pasos de lavado, no eche un chorro de PBS o alcohol directamente sobre las celdas. Añádelos bien a lo largo del borde del pozo.
7. Coloca el plato boca abajo sobre papel absorbente para drenar el exceso de agua y déjalo secar a temperatura ambiente durante 24 horas.
8. Fotografía las placas usando un escáner de alta definición de cama^{plana 28,29} o un sistema de documentación de imágenes configurado para la opción de gel azul Coomassie 21,22,30.

11. Ensayo de reversibilidad

NOTA: El objetivo principal del ensayo de reversibilidad con taquizoítos de T. gondii es determinar si la capacidad de proliferación de los parásitos tratados se elimina completamente o se reduce tras la eliminación de los compuestos del medio^{de cultivo 31}.

1. Siembra una placa de 6 pozos con células NHDF como se describe en el paso 6. Para cada pozo, añade 1 x 10^{5 células} resuspendidas en 2 mL de RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS.
   NOTA: Una vez que la monocapa celular alcanza el 100% de confluencia en cada pozo, la placa está lista para el ensayo de placas.
2. Desecha el medio y añade 1 x^{10 4} taquizoites resuspendidos en 2 mL de medio fresco con un 2% de FBS en cada pozo.
3. Tras permitir que los taquizoítos interactúen con las células NHDF durante 1 hora, añadir los compuestos seleccionados a una concentración final cercana al valor inhibitorio del 90% (IC₉₀). Se utiliza un pozo que contiene únicamente el diluyente del fármaco como control positivo.
4. Trata los taquizoítos durante 4 días en una incubadora a 37 °C con un 5% de_CO2 y una atmósfera húmeda.
5. Tras el periodo de tratamiento de 4 días, lava la placa tres veces con 1 PBS a 37 °C para asegurar la eliminación completa de los compuestos.
6. Añade a cada pozo 2 mL de medio fresco sin los compuestos y mantén la placa en la incubadora durante 7 días adicionales.
7. Tiñe la placa con tinte violeta cristalino y fotografía como se describe en el paso 10.

12. Análisis de imágenes usando el software ImageJ

1. Abre las imágenes usando el software^{ImageJ 32}.
2. Seleccione el área correspondiente a un pozo usando la herramienta de selección de óvalo (Figura 1A,B).
   NOTA: Al hacer la selección, ignora las regiones en los bordes del pozo que presentan defectos. Estos suelen estar presentes en los bordes del pozo.
3. Copiar y crear una nueva imagen: copiar el área seleccionada pulsando Ctrl + C; crear un nuevo archivo de imagen pulsando Ctrl + N; pegar la imagen copiada en la nueva ventana negra usando Ctrl + V.
   NOTA: Al crear la nueva imagen, usa los ajustes por defecto: 8 bits, relleno con negro, 512 x 512 píxeles y una sección (Figura 1C).
4. Navega a: Imagen > Ajustar > umbral, o pulsa Ctrl + Shift + T (Figura 1D).
5. En la ventana de Umbral, selecciona las opciones Huang y Red y luego haz clic en Auto (Figura 1E).
6. Haz clic en Analizar y luego selecciona Analizar partículas (Figura 1F). Mantén las opciones predeterminadas en la ventana que aparece y haz clic en OK (Figura 1G).
7. Se abrirá una ventana nueva. Copie el valor mostrado en %Área (resaltado por un rectángulo rojo en la Figura 1H) para calcular el porcentaje de proliferación o inhibición de parásitos.
8. Repite estos pasos para cada pozo en la placa.
9. Para calcular el porcentaje de proliferación, utilice la siguiente fórmula:
   % de proliferación = (%Área tratada/%Área controlada pozo) × 100
10. Para calcular el porcentaje de inhibición, utiliza la siguiente fórmula:
    % de inhibición = [1- (%Área tratada/%Área controlada pozo)] × 100

Figura 1: Análisis paso a paso de los resultados en el software ImageJ. (A) Selección de herramientas "Oval". (B) Selección del área de interés en la imagen. (C) Nueva ventana de imagen (Ctrl + N) con los ajustes recomendados. (D) Pasos para "Análisis de umbral tras pegar el área de interés en la nueva ventana de imagen. (E) Huang y selección de opciones rojas en la ventana de umbral, lo que hace que todas las áreas blancas se rellenen en rojo. (F) Secuencia de los pasos usados para el "Analizar partículas". (G) El ajuste utilizado para analizar las partículas. (H) El resultado del porcentaje del área total destruida se muestra en la ventana de resumen. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

13. Análisis estadístico

1. Organiza los datos en una hoja de cálculo Excel dentro del software Office después de calcular el porcentaje de inhibición de la proliferación.
2. Abre el software GraphPad Prism 5.0 y haz clic en XY (Debajo de la nueva tabla y gráfica).
3. En la sección Y (debajo de "X:error bar"), introduzca el número de repeticiones de datos (normalmente tres réplicas biológicas). Este número puede variar según el número de repeticiones realizadas.
4. Selecciona Solo Promedio junto al gráfico y NO selecciones "Introducir y graficar valores de error ya calculados en otro lugar", luego haz clic en Crear.
5. Coloca los datos de concentración en el eje X y los datos de porcentaje de inhibición de proliferación en las columnas A, A:Y1, A:Y2, A:Y3, A:Y4, A:Y5.
6. Haz clic en = Analizar y luego en Transformar, y después OK. Se abrirá una ventana nueva. En esta nueva ventana, haz clic en Transformar valores X usando X = Log(X), luego haz clic en Crear un nuevo gráfico de los resultados, y finalmente OK.
7. Haz clic en = Analizar y luego en Normalizar. Se abrirá una ventana nueva. En la sección ¿Cómo se define el 0%?, haz clic y pon Y = 0.0. En la sección ¿Cómo se define al 100%?, haz clic y pones Y = 100; selecciona Porcentajes y haz clic en Crear un nuevo gráfico de los resultados.
8. Haz clic en el símbolo: Ajustar una curva con regresión no lineal ubicada arriba = Analizar. Haz clic en Dosis-respuesta - Inhibición, luego en logarítmic (inhibidor) vs. respuesta normalizada - pendiente variable, y después haz clic en OK.
   NOTA: Se abrirá una ventana que mostrará los siguientes resultados: el IC₅₀ (Concentración Inhibitoria del 50%), el intervalo de confianza del 95% y el valor R2. Estos valores son cruciales y deben incluirse en una tabla de resultados dentro del artículo.
9. Para estimar otras concentraciones inhibitorias, como IC₂₅,_{IC 90} o IC₉₅, utiliza el enlace (https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm), Quick Calcs - GraphPad; EC: concentración efectiva. Informa del IC₅₀ y del HillSlope obtenidos por el software Prism para cada fármaco analizado.

Resultados

Para evaluar el ensayo de placa tras el tratamiento, son cruciales tanto los controles positivos (células infectadas con taquizoítos y no tratadas) como negativos (células no infectadas con 0,1% de DMSO). Al final del experimento, el pozo control positivo debe mostrar espacios vacíos bien definidos con restos de células adheridas (Figura 2). En cambio, el pozo de control negativo debe mostrar una monocapa intacta sin espacios vacíos. El control negativo es crucial para confirmar la integrida...

Discusión

La estandarización de nuevos protocolos para pruebas antiproliferativas es un paso fundamental para avanzar en la investigación científica sobre la identificación de futuros fármacos. El protocolo presentado aquí ofrece un enfoque alternativo para evaluar in vitro la actividad de moléculas bioactivas contra taquizoítos de T. gondii. Dado que T. gondii es un parásito intracelular obligado que se locomota por motilidad deslizante, cuando los parásitos salen de un...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,05 % Tripsina-EDTA	Tecnologías de la vida	25300-062
Pipeta serológica de 10 mL	Olen	K17-110
Centrífuga Falcon de 15 mL	Fanem	Modelo: 206
Pipeta serológica de 5 mL	Olen	K17-115
Placa de cultivo de 6 pozos	Sarstedt	833920
Balance analítico	Mettler Toledo	Modelo: AB204 Número de serie: 1116473813
Antibiótico-Antimicoótico (100X)	Tecnologías de la vida	15240-062
Pipeta automática	Kasvi	K1-AID
Centrifugadora	Eppendorf	Modelo 5415 R Número de serie: 0023591
Incubadora CO2	PHC Corporation	Modelo Nº : MCO-230AICUVL-PA Número de serie: 210360090
Botella de cultivo 25 cm2	Sarstedt	833910
Dimetilsulfóxido (DMSO) P.A.	Merck	1,02,95,21,000
Ethanol P.A	Merck	1,00,98,31,000
Suero fetal bovino (FBS)	Tecnologías de la vida	12657-029
Formaldehído 37-38%	Panreac	131328
GraphPad Prism	GraphPad Software	-	Versión 8.0.1
ImageJ  software	-	-	Versión 1.52e
Sistemas de documentación de imágenes	Bio-Rad	Modelo:  Sistema de Imagen ChemiDoc MP Número de serie: 734BR2249
Campana de flujo laminar	Veco do Brasil	Modelo: VLFS-09
L-glutamina 200 mM (100X)	Tecnologías de la vida	25030-081
Microtubo 0,5 mL	Sarstedt	72,699
Fibroblastos Dérmicos Humanos Normales Neonatales (NHDF)	Lonza	CC-3132	Generosamente proporcionado por la Dra. Sheila Nardelli, de Fiocruz Paraná, Brasil
Cámara de Neubauer 0,100 mm 0,0025 mm2	Nueva óptica	7301-1
Metro	Micronal	Modelo: B374 Número de serie: 30/37
Pipeta 20-200 y micro; L	Kasvi básico	22032893
Pipeta 2-20 y micro; L	Labmate Pro	656630226
Pipeta  0.2-2 & micro; L	Labmate Pro	556610114
Pipeta  1000-5.000 y micro; L	Uniscience	YM4A021482
Pipeta  100-1000 y micro; L	Eppendorf Research plus	Q34354C
Fosfato de potasio monobásico   (KH2PO4) P.A	Sintetizador	01F2002.01.AF
Medio RPMI-1640	Sigma-Aldrich & nbsp;	R0883
Cloruro de sodio (NaCl) P.A.	Cromoline Quí mica Fina y Fin Roja;	-
Dibásico fosfato sódico (Na2HPO4) P.A.	CRQ Produtos Quimicos Eireli	R2715920500
Consejo 1.000 y micro; L	Sarstedt	7,01,186
Consejo 10 y micro; L	Sarstedt	7,03,010
Consejo 5.000 y micro; L	Sarstedt	70,11,83,001
Consejo y Consejos 200 y micro; L	Sarstedt	7,03,030
Pipeta de transferencia   (3,5 mL)	Sarstedt	86,11,71,001
Tubo 15 mL	Sarstedt	6,25,54,502
Cristal Violeta	Merck	101408
Mezclador de vórtice	Phoenix	Modelo: AP56 Número de serie: 6633
Baños de agua	Hemoquimica do Brasil	Modelo: HM1003 Número de serie: 700001556