Métodos para la cuantificación in situ de la morfología mitocondrial en células musculares y terminales de Schwann de ratones

Resumen

Inyecciones locales de un marcador mitocondrial con marcador mitocondrial terminal de células de Schwann en vivo para microscopía confocal. Este método utiliza pruebas de concepto demostradas en tejido muscular esquelético de ratones con músculo sano o enfermo para proporcionar una visualización mitocondrial de alta resolución.

Resumen

La morfología de la red mitocondrial se utiliza ampliamente como indicador de la salud celular; sin embargo, cuantificar la arquitectura mitocondrial dentro de tejidos intactos sigue siendo técnicamente un reto. Las células terminales de Schwann (tSC), que son esenciales para el mantenimiento y regeneración de las uniones neuromusculares, son particularmente difíciles de analizar in situ debido a su ubicación anatómica y sensibilidad a la alteración tisular. Este protocolo describe un enfoque reproducible para marcar y cuantificar la morfología de redes mitocondriales tridimensionales en el músculo esquelético de montaje completo y en las células teocondritales en ratones mediante microscopía confocal estándar. El método emplea la administración in vivo de un colorante mitocondrial sensible al potencial de membrana, seguida de un procesamiento rápido de tejidos e imagen confocal de alta resolución. Se analizan las pilas de imágenes para cuantificar la conectividad, el área y la fragmentación de la red mitocondrial. El protocolo se valida primero en músculo esquelético distrófico y sano para confirmar las diferencias esperadas en la morfología mitocondrial y posteriormente se adapta para visualizar y cuantificar redes mitocondriales en tSCs identificadas con ratones reporteros S100β. Este enfoque permite analizar la morfología mitocondrial dentro de tejidos neuromusculares intactos sin necesidad de reporteros mitocondriales transgénicos ni plataformas especializadas de imagen. El protocolo requiere únicamente equipos comúnmente disponibles en las instalaciones centrales de la universidad y puede adaptarse a otros tejidos finos o superficialmente accesibles.

Introducción

Las mitocondrias son notablemente orgánulos plásticos que actúan como los pulmones de la célula, consumiendo oxígeno durante la respiración celular para apoyar la producción de trifosfato de adenosina (ATP) en respuesta a la demanda^{metabólica 1}. Aunque antes se consideraban orgánulos discretos, ahora se entiende que las mitocondrias están altamente ^{integradas en 2,3,4}, compartiendo sustratos energéticos en toda su red de acuerdo con los requisitos locales. La integración ofrece una ventaja clara sobre el aislamiento: las mitocondrias conectadas sostienen déficits energéticos, manteniendo gradientes electroquímicos para la fosforilación oxidativa durante una demanda metabólica elevada. De hecho, la distribución, el volumen y la morfología de las mitocondrias se adaptan a las necesidades energéticas en su^{entorno 5}. En salud, se mantiene la renovación regular de las redes mitocondriales mediante la biogénesis mitocondrial, eventos de fusión y fisión, y la^{mitofagia 2,3}. La biogénesis mitocondrial es necesaria para mantener y expandir mitocondrias sanas. La demanda metabólica, como el ejercicio físico, aumenta la expresión del receptor activado por proliferadores de peroxisomas γ el coactivador 1α (PGC-1α)⁵. Este proceso ocurre mediante señales primarias de resistencia, específicamente la elevación inducida por el ejercicio de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), calcio y especies reactivas de^{osígeno 6,7}. La fusión expande las redes, promoviendo la supervivencia y complementando los déficits, mientras que la fisión mitiga daños mitocondriales adicionales mediante la exclusión preferencial de la región ^{disfuncional 2,3,8}. Una vez eliminadas, las regiones excluidas deben someterse a mitofagia, evitando la acumulación de orgánulos y proteínas^{disfuncionales 6,9}.

El músculo esquelético representa aproximadamente el 40% de la masa corporal y depende de las mitocondrias para el metabolismo aeróbico y la señalización celular para mantener la^{homeostasis 10}. En conjunto, en condiciones de disfunción muscular esquelética, los mecanismos de control de calidad mitocondrial se ven^{afectados 10}. Las investigaciones sobre la disfunción muscular suelen medir la respiración mitocondrial, el volumen, la morfología y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) para evaluar la calidad mitocondrial ^3,10. En ese sentido, durante una disfunción muscular prolongada, la respiración mitocondrial se reduce, mientras que los ROS aumentan y las redes se^{fragmentan 3,10}. Las perturbaciones en la morfología mitocondrial surgen principalmente de la activación de proteínas de fisión mitocondrial, la proteína relacionada con dinamina 1 (DRP1) y la fisión mitocondrial 1 (FIS1)^2,8,11. En respuesta a la atrofia muscular, FIS1, que reside en la superficie de la membrana mitocondrial externa, recluta DRP1 para oligomerizar con múltiples dímeros de DRP1 y crear un filamento alrededor de las mitocondrias, disminuyendo de tamaño hasta que una sección determinada de las mitocondrias es "pellizcada", promoviendo la^{fragmentación 3,11}. En conjunto, la sobreactividad de la fisión mitocondrial, las reducciones en la fusión de mitocondrias recién formadas y la mitofagia disfuncional son responsables de la apariencia fragmentada de redes mitocondriales disfuncionales, como las descritas en músculos inactivos^{o enfermos 2,12}.

La unión neuromuscular (NMJ) es el lugar de excitación muscular. Los potenciales de acción iniciados en el soma se propagan a lo largo de axones, recubiertos por células de Schwann mielinizantes (SC), y terminan en las NMJs, que están encapsuladas por células terminales de Schwann (tSC). Los NMJ pueden regenerarse tras una lesión. Sin embargo, la probabilidad y velocidad de regeneración disminuyen a medida que la distancia entre el lugar de la lesión y el NMJ aumenta^13,14. Tras una lesión nerviosa por transección, aplastamiento o estiramiento, los SC se desdiferencian hacia un estado desmielinizado similar al^{progenitor 15,16}. Los SC desmielinizados proliferan y trabajan en conjunto con macrófagos para remodelar el entorno local para su regeneración eliminando los restos entre el lugar de la lesión y el tocón axón proximal a través de la degeneración^{walleriana 17,18}. Los SC migratorios señalan una respuesta inflamatoria que remodela el entorno para lograr una regeneración nerviosa^{exitosa 18}. La regeneración nerviosa ocurre dentro de la vaina neural formada por los SCs progenitores, que forman bandas de Bunger, a través de las cuales los axones^{regeneran 19}. El muñón axonal extiende entonces los filópodos para iniciar la inervación¹⁴. Tras la reineración, la presinapsis puede regenerarse completamente, siempre que las CST se reinviertan en el^{NMJ 20}.

La morfología mitocondrial varía notablemente entre tipos celulares, ajustándose a la función^{tisular 21}. Los informes de tejidos hepáticos sugieren que las mitocondrias son más compactas y esféricas, mientras que las de la sustancia blanca del cerebro son más alargadas y^{tubulares 22}. Al ser desafiados, como en condiciones de envejecimiento y estrés oxidativo, las mitocondrias en estos tejidos presentan un fenotipo similar al de una rosquilla. Sin embargo, en los osteoblastos, la formación y fragmentación de donuts mitocondriales se relacionaron con un aumento de secreción de mitocondrias y vesículas derivadas de mitocondrias, y con la maduración de^{osteoblastos 23}. Aunque las redes mitocondriales del músculo esquelético han sido examinadas extensamente en múltiples especies, persisten limitaciones en la obtención de imágenes de redes mitocondriales a partir de las CST del sistema nervioso periférico. Estos son difíciles de capturar en sus entornos nativos, ya que la ultraestructura celular se altera significativamente tras el aislamiento, y estos tejidos son difíciles de atacar con tinte in vivo sin cargar también el músculo esquelético correspondiente.

Las técnicas de imagen utilizadas para capturar la morfología mitocondrial en sistemas vivos pueden clasificarse como microscopía óptica o^{electrónica 5}. Con la microscopía tradicional de captura de luz, los colorantes pueden marcar células vivas, las células fijas pueden ser inmunomarcadas y las mitocondrias pueden ser etiquetadas^{genéticamente 5,24}. La imagen de células vivas normalmente requiere incubar las células durante 20–60 minutos antes del análisis de fluorescencia. Los colorantes se dirigen a las mitocondrias mediante el potencial de membrana y, por tanto, pueden alterarse bajo condiciones de potencial de membrana^{alterado 5}. Es teóricamente posible capturar la morfología mitocondrial de las tSCs dentro del músculo esquelético mediante la carga de colorantes; sin embargo, requeriría imágenes de tejidos enteros y técnicas detalladas de marcado. En particular, captura mitocondrias dentro de estructuras intactas, sin interferencia del marcaje muscular esquelético. Para superar estas limitaciones, se utilizó la tinción fluorescente mitocondrial para marcar músculo esquelético vivo en ratones sanos y distróficos, seguida del marcaje de mitocondrias tSC para imágenes in vivo e in situ. El músculo tibial anterior (TA) fue seleccionado para optimizar la imagen del músculo esquelético debido a su ubicación anatómica superficial, volumen de inyección bien caracterizado y dispersión^miofascial 25,26,27, y su idoneidad para mediciones funcionales concurrentes. El músculo glúteo mayor (GM) fue seleccionado para la imagen de las CETs basándose en su procedimiento de inyección^{establecido 28,29}, su arquitectura delgada, que minimiza la fluorescencia de fondo, y la posición ventral superficial de las uniones neuromusculares entre la GM y el glúteo medio, permitiendo el marcaje preferente de las CST antes de las fibras musculares esqueléticas.

Protocolo

Macho adulto DBA/2J [Tipo salvaje (WT) de seis meses (n=3) (RRID: IMSR_JAX:000671) y D2.B10-DMD^D2.mdx/J [D2.mdx (mdx)] (RRID: IMSR_JAX:013141), mientras que macho y hembra adultos B6 de tres a cinco meses (n=8); D2-Tg(S100-EGFP)^1Wjt/J (S100B) (RRID: IMSR_JAX:005621) [también agrupados con WT dado que no hay diferencias respecto a DBA] se utilizaron de una colonia en curso de ratones mantenidos por el investigador. El flujo de trabajo experimental general para inyecciones de TA y GM, procesamiento de tejidos e imágenes se resume en la Figura 1. Un D2 adicional. MDX mouse fue donado por el investigador para la imagen de la TC en mdx (n=1). Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Universidad Texas A&M (AUP 2022-0215) y se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía del Consejo Nacional de Investigación para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8ª edición⁾³⁰. La eutanasia se realizó mediante una luxación cervical bajo una sobredosis anestésica de isoflurano.

1. Preparación de una solución de trabajo de tinción mitocondrial fluorescente de 2 μM

1. Suspender la tinción mitocondrial (50 μg) en 322 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) según las instrucciones del fabricante para preparar una solución de stock de 200 μM.
2. Para preparar 30 mL de solución de trabajo de 2 μM, transfiera 300 μL de solución de 200 μM a 29,7 mL de solución salina estéril. Mezcla bien.
3. 250 μL de la solución de trabajo de 2 μM en tubos de microcentrífuga y se almacenan a -80 °C hasta su uso.
   NOTA: No se observó degradación detectable de señales tras 3 años de almacenamiento a -80 °C.

2. Tintes y preparación animal

1. Descongelar una alicota congelada 15 minutos antes de la experimentación. Extrae la solución en una jeringuilla de insulina de 30 g y 1 cc.
2. Anestesiar al animal con isoflurano. Aplica ungüento oftálmico, afeita el lugar de la inyección y mantén la temperatura corporal usando una lámpara de calentamiento con una sonda de temperatura situada entre el animal y la fuente de calor.
3. Limpia el sitio de la inyección afeitada con alcohol isopropílico al 70%.

3. Administración y función del tinte mitocondrial del músculo tibial anterior (TA)

1. Administración de tintes TA
   1. Inyectar 50 μL de tinción mitocondrial de 2 μM en el músculo TA derecho de ratones anestesiados WT y D2.mdx.
   2. Introduce la aguja en el tendón distal, hacia la rodilla, y presiona el émbolo mientras retiras la aguja a lo largo del camino de inyección.
   3. Incuba el colorante in vivo durante 1 hora antes de la disección.
2. Medidas de función muscular TA
   1. Tras 45 minutos de incubación del colorante, anestesiar al ratón usando isoflurano (inducción 2%–3%, 1,5%–2% de mantenimiento en oxígeno).
   2. Expone quirúrgicamente el músculo TA izquierdo mientras se preservan los tejidos circundantes. Ata el tendón distal al haz de carga del sistema de prueba muscular.
   3. Envuelva el músculo expuesto con una toallita de laboratorio e irriga a 3 mL min⁻¹ con solución fisiológica estéril al 0,9% calentada a 40 °C. Mantén la temperatura muscular en 32 °C usando una lámpara de calor.
   4. Coloca electrodos de alambre de platino/iridio sobre el abdomen muscular para estimulación directa.
   5. Conecta el haz de carga a un micrómetro y ajusta la longitud óptima (L₀) usando contracciones de espasmo (T_w) a 1 Hz. Graba L₀ con un calibrador digital.
   6. Induce contracciones tétánicas máximas (P₀) tres veces a 140 Hz con 60 segundos de descanso entre contracciones. Registrar el valor de fuerza más alto (g). Obtén datos utilizando el sistema de función muscular con software de análisis.
3. Procesamiento de tejidos TA
   1. Tras la incubación, aisla y disecciona el músculo TA antes de la eutanasia.
   2. Coloca haces aislados de fibras musculares en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 15 minutos mientras juegas suavemente con las fibras bajo un estereomicroscopio.
      PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico y debe manipularse en una campana extractora química mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes y protección ocular).
   3. Añadir la tinción de ácido nucleico permanente a una concentración final de 5–10 μg/mL para marcar los núcleos.
   4. Lava muestras tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 minutos cada una para eliminar el exceso de colorante.
   5. Deshidrata muestras secuenciales en 50%, 75% y 100% etanol durante 5 minutos cada uno.
   6. Incubar muestras secuencialmente en soluciones de limpieza de tejidos I y II durante 30 minutos cada una a temperatura ambiente, utilizando suficiente volumen para sumergir completamente el tejido.
   7. Colocar los haces de TA despejado sobre un abrigo y aplanar suavemente usando un bloque de vidrio (2,5 cm × 2 cm × 1 cm; masa 7,8 g)²⁶.

4. Imagen de muestras de músculo TA

1. Imágenes de muestras musculares con un microscopio confocal para obtener secciones ópticas tridimensionales (3D) de alta resolución.
2. Adquiere imágenes Z-stack a una profundidad aproximada de 100 μm para el músculo usando un objetivo con ampliación de 63x (N.A. 1.40).
3. Utiliza el software confocal del sistema de imagen con una longitud de onda de excitación de 646 nm para proporcionar la mayor claridad con el menor fondo posible.
4. Adquirir imágenes usando el modo de deconvolución, empleando parámetros "System Optimized" con pasos de 1 μm.
   NOTA: Para combatir la deshidratación y el fotoblanqueo, transfiere los tejidos a la solución limpiadora II y colócalos sobre una capa de cobertura. Coloca dos gotas de solución de aclarador 2 directamente sobre el tejido antes de la imagen.

5. Carga de colorantes y imagen del músculo GM tSC

1. Utiliza ratones S100β para la identificación específica por fluorescencia de los tSCs.
2. Realiza una pequeña incisión cutánea sobre el músculo GM. Inyectar 75 μL de una tinción mitocondrial fluorescente rojo distante de 2 μM debajo del GM, antes del cierre de la^{herida 25}.
3. Cierra la herida y deja que el tinte incube durante 45 minutos para marcar selectivamente las células musculares sin marcar significativamente las fibras musculares subyacentes.
4. Disecciona los músculos GM y colócalos inmediatamente en solución salina estéril al 0,9% fría. Recorta rápidamente el exceso de grasa y tejido conectivo.
5. Transfiere a los GMs diseccionados a una cubierta para la imagen.
6. Solo si se usan ratones D2.mdx, añade el tinte fluorescente del receptor de acetilcolina (AChR) a una dilución 1:500 al baño de microdisección. Incuba el tejido durante 30 minutos para visualizar los componentes postsinápticos de la unión neuromuscular (NMJ).
7. Utiliza este enfoque de doble marcado para diferenciar las mitocondrias postsinápticas de las mitocondrias específicas de la tSC.
   PRECAUCIÓN: Limitar la disección y limpieza del GM a no más de 10 minutos antes de colocarlo en un abrigo para obtener imágenes, minimizando los cambios morfológicos tras la disección. Este límite de tiempo es fundamental para minimizar los cambios morfológicos post-disección y la degradación mitocondrial.
8. Realizar microscopía confocal para obtener secciones ópticas tridimensionales (3D) de alta resolución.
9. Adquirir imágenes Z-stack a una profundidad aproximada de 16 μm para tSCs usando un objetivo de ampliación 20x (N.A. 0,75). Obtén imágenes representativas de alta resolución de tSCs individuales usando un objetivo con ampliación de 63x.
10. Implementa procedimientos de montaje para minimizar la deshidratación de tejidos y el fotoblanqueamiento durante la sesión de imagen.
    PRECAUCIÓN: Transfiere los tejidos en solución salina a un abrigo de cobertura, asegurando que el lado ventral esté orientado hacia abajo para la microscopía invertida.
11. Aplica 2 μL de medio de montaje general sobre la superficie dorsal del GM.
12. Aplanar suavemente el tejido utilizando un bloque de vidrio calibrado (2,5 cm × 2 cm × 1 cm; masa 7,8 g) para asegurar un plano de imagen uniforme.

6. Microscopía de haz de iones enfocados

1. Realizar microscopía electrónica de barrido de haz de iones enfocado (FIB-SEM) según los protocolos^{previamente establecidos 26}.
   1. Aplicar FIB-SEM específicamente para confirmar y visualizar nuevas características morfológicas identificadas durante la imagen confocal.

7. Análisis de imágenes

1. Muestras de músculo TA
   1. Realizar análisis cuantitativo de secciones ópticas confocales (1 μm) de escaneos TA (aproximadamente 75–112 μm de grosor) utilizando software de análisis de imágenes impulsado por IA.
      NOTA: Realizar múltiples sesiones de entrenamiento supervisadas antes de la segmentación automatizada para mejorar la adaptación del algoritmo.
   2. Importar secciones ópticas individuales (Z-slices) para enseñar al software a retener información pixelada que representa el tinte mitocondrial blanco excluyendo el fondo negro.
   3. Desarrollar máscaras de imagen para revisión por parte del investigador y así garantizar un análisis de alta calidad y precisión.
   4. Separar las pilas de imágenes 3D en secciones ópticas individuales siguiendo la optimización del algoritmo.
   5. Selecciona cada cinco Z-slices de cada imagen 3D para su análisis, representando cada punto de datos la media de estas secciones individuales por muestra.
   6. Cuantificar la morfología mitocondrial para derivar métricas de distribución espacial y conectividad de red.
   7. Estandariza los umbrales de intensidad, los ajustes de detección de bordes y la calibración del tamaño de los vóxeles en todas las muestras para minimizar la variabilidad experimental.
2. TSCs en muestras de GM
   1. Montar secciones ópticas de 1 μm en pilas Z (aproximadamente de 6 a 25 μm de grosor) y separar las imágenes en canales de color individuales utilizando software de análisis de imágenes 2D.
   2. Calibra el software usando barras de escala y aplica umbrales para optimizar la visualización de mitocondrias de tSC con mínima interferencia de fondo.
   3. Realizar binarización y eliminar el ruido de fondo para aislar las mitocondrias o tSCs para la medición del área y el recuento de partículas.
   4. Guarda imágenes binarias para asegurar un procesamiento consistente y realiza todos los experimentos de imagen en condiciones idénticas para garantizar la reproducibilidad entre réplicas biológicas.

8. Inmunohistoquímica

1. Incrustar muestras de músculo TA izquierdo en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) para evaluar el área de sección transversal (CSA).
   1. Muestras en sección a 10 μm de espesor usando un criostato ajustado a -17°C y recogidas en láminas de microscopio.
   2. Secciones transversales del músculo de tinte para laminina para identificar los bordes de miofibra usando anticuerpo primario antilaminina de conejo (1:400) y anticuerpo secundario anti-rodamina de conejo (1:400).
   3. Monta las diapositivas usando un medio de montaje adecuado antes de la imagen.
2. Imágenes de diapositivas usando un microscopio confocal seleccionando aleatoriamente 2–3 regiones de interés (580 x 580 μm) por muestra con un objetivo de 20x (N.A. 0,75).
3. Valores medios en regiones por músculo y análisis de aproximadamente 400 miofibras por sección de músculo TA.
4. Utiliza un software semiautomático de segmentación muscular para determinar la CSA (μm²) enmascarando las miofibras.

9. Análisis estadístico

1. Informa de los datos resumen como media ± error estándar de la media (S.E.M.).
2. Realizar análisis estadísticos utilizando un software estadístico dedicado, utilizando pruebas t de Student paramétricas y no emparejadas para determinar la significación entre las diferencias medias de grupos.
3. Realizar regresiones lineales simples sobre la CSA y la fuerza muscular de los músculos TA, utilizando estos como marcadores de la patología de la DMD para comparar la morfología mitocondrial del músculo TA y los TSC GM.
4. Evalúa los coeficientes de correlación Pearson-r para determinar la correlación entre la patología de la DMD y la patología mitocondrial. Defina la significación estadística como P ≤ 0,05.

Resultados

Las redes mitocondriales mostraron las reducciones esperadas en la conectividad
Se presentan imágenes representativas en 3D fluorescentes de las exploraciones confocales del músculo TA en dos grupos, WT y mdx (Figura 2). En comparación con el grupo WT, la conectividad mitocondrial parece reducida en ratones mdx en comparación con WT (Figura 2A–D). Se observaron un mayor número de pequeños fra...

Discusión

La ubicación de las mitocondrias dentro de las estructuras celulares, así como su morfología, se correlaciona con la salud mitocondrial y la demanda^{metabólica 21}. Dada la relevancia clínica de la salud mitocondrial, junto con la cinética respiratoria divergente y las morfologías de diferentes tipos celulares, se desarrolló un método de microscopía confocal fácil de aplicar para la evaluación de morfologías mitocondriales en las tSC tras evaluar primero el método e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
3-in-1 Whole Animal System	Aurora Scientific, Ontario, Canada	1300A	Sistema de función muscular con software de análisis
AIVIA	Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA	15	Software de análisis de imágenes impulsado por IA
anti-laminin	MilliporeSigma	L9393-.2mL	Etiqueta de límite de miofibras
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:005621	S100β
Cryostar NX50 Cryostat	Epredia, Kalamazoo, MI, USA	https://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50	Criostato
D2.B10-DMDD2.mdx/J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:13141	D2.mdx
DBA/2J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:00671	WT
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	BP231-100	Reactivo de reconstitución de tinción mitocondrial
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Tinción de ácido nucleico permeable a las células
ImageJ/Fiji	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	SCR_002285	Software de análisis 2D
Invitrogen ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Fisher Scientific, Hampton, NJ, USA	P36941	Medio de montaje
KimWipe	Kimberly-Clark, Irving, TX, USA	06-666A	Toallitas de laboratorio
Leica LAS_X software	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	SCR_013673	Software confocal
MitoView Fix 640	Biotium	70075-50ug	Tinción mitocondrial fluorescente de color rojo lejano
NIS-Elements Advanced Research software	Nikon, Melville, NY, USA	SCR_014329	Software de análisis de área de sección transversal
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA	#SP15-100	Medio de montaje general
Prism 9 software	GraphPad Software, La Jolla, CA, USA	RRID: SCR_002798	Software de análisis estadístico
Rhodamine (TRITC)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	AP132RMI	Anticuerpo secundario
Stellaris 5 White Light Confocal Microscope and corresponding deconvolution software	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	158301313:158201310:158004752: 158301312:158301314:158401100: 158209011:158301130:158204510: 158301120:158401140:158204511: 15500332:15506428:15506517:155 13859:15521522:15525226:155252 32:15525314:15555009:15555017: 15555046:27100022:155933660: 155933666:155933668:158000640 :158002407:158003150:158004141 :158004201:158004421:158004423 :158200681:158202140:158203114: 158203200:158203220:158204201: 158204510:158204709:158301200: 9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP _CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_ LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C	Microscopio confocal
SZ61	Olympus, Breinigsville, PA, USA	sz61	Microscopio estereoscópico
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA	23-730-571	Compuesto de temperatura de corte óptima
Visikol I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1-30	Solución de aclarado de tejido 1
Visikol II	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H2-30	Solución de aclarado de tejido 2
α-bungarotoxin 552	Biotrend, Koln, Germany	00014	Colorante de receptor de acetilcolina