Artículo de método

Un modelo preclínico de sinopolitis utilizando tejido sinovial humano ex vivo con función y arquitectura preservadas

DOI:

10.3791/69734

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20 de marzo de 2026

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1Department of Emergency Medicine, University of Iowa Health Care, 2Interdisciplinary Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 3Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Iowa Health Care, 4Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Office of Research and Development, Iowa City Veterans Affairs Health Care System, 6Department of Internal Medicine, University of Iowa Health Care, 7Iowa State University, 8Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desarrollamos un sistema transwell ex vivo humano capaz de evaluar cambios inflamatorios agudos, infecciosos y estructurales en el sinovio.

Resumen

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La artritis es un estado inflamatorio en las articulaciones que provoca daño en el cartílago, dolor y pérdida de movilidad. Los avances recientes en la investigación sobre la artritis demuestran específicamente que la cápsula articular (por ejemplo, la sinovia) es una fuente importante de esta inflamación, pero no existen modelos humanos que repliquen la arquitectura sinovial esencial. Para abordar esto, se creó el Sistema de Análisis Espacial Conjunto, o JSAS. Se obtuvo sinovio anterior intraoperatoriamente de pacientes sometidos a una artroplastia total de rodilla (ATC). El sinovio fue diseccionado y seccionado en núcleos de biopsia de 3 mm. Los núcleos se colocaron en el pozo superior de un pozo de 5 μm o 0,4 μm con 300 μl de DMEM y un 10% de FBS. En el pozo inferior, se añadieron 600 μL de medio y se intercambiaron cada 2-3 días. Se evaluó la viabilidad hasta 7 días en condiciones de incubación hiperóxicas (50%), atmosféricas/estándar (~21%) y fisiológicas (5%). Los estímulos en el pozo inferior incluyeron la proteína quimioatrátrica monocitos 1 (MCP-1/CCL2), lipopolisacáridos (LPS), N-acetil cisteína, S. aureus y B. burgdorferi. Se almacenó el medio para ELISA y el tejido para el análisis con parafina fija de formalina (FFPE). En condiciones estándar, el sinovio permaneció completamente viable durante 3 días. El estímulo modificó la estructura y función del revestimiento íntimo y de las células sinoviales subalineantes, incluyendo la pérdida del borde residente del macrófago, la expansión del subrevestimento, la regulación al alza de fibroblastos patógenos y la producción de citocinas IL-1β y TNFα. Las células inmunitarias y los fibroblastos migraron a la cámara inferior (poros de 5 μm) según el análisis de citometría de flujo. B. burgdorferi móvil migró al tejido con un tamaño de poro de 0,4 μm, mientras que S. aureus no móvil no lo hizo. Las citocinas relevantes se expresaron en cantidad suficiente para ELISA. JSAS es un sistema modular capaz de estudiar alteraciones agudas en el sinovio humano, permitiendo la complejidad de las estructuras 3D en un modelo preclínico manteniendo la estructura y función biológicamente relevantes.

Introducción

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La artritis afecta a más del 20% de todos los adultos en EE. UU. y al 50% de los mayores de 65 años con enfermedadescrónicas 1. También es una de las principales causas de discapacidad en todoel mundo 2. La artritis incluye no solo daño en el cartílago, sino también inflamación de la cápsula articular o del sinovio (por ejemplo, sinovitis). La sinopolitis crónica es probablemente una fuente importante de citocinas proinflamatorias que potencian el daño óseo y cartílago en la artrosis y la artritisreumatoide 3,4. Por lo tanto, comprender los cambios mediados por el sistema inmunitario dentro del sinovio es probablemente esencial para desarrollar nuevas opciones terapéuticas y posiblemente preventivas para pacientes con artritis.

La sinovio es una estructura organizada compuesta por dos capas principales: el revestimiento íntimo celular (IntL) y el subrevestimiento (SubL). El IntL se conecta con el fluido sinovial (SF), y el SubL produce componentes de SF y contiene estructurasvasculares 5. Dentro del IntL hay tanto macrófagos como sinoviocitos similares a fibroblastos (FLS). Los macrófagos de la IntL son células residentes, renovadas localmente por macrófagos intersticiales dentro del SubL6. Estos macrófagos sinoviales residentes (RSMs) están sesgados hacia M2 por la expresión de CD206 y TREM2, epitelalizados y expresan marcadores de unión estrecha. Esta subestructura del IntL puede ser clave para mantener funcional y físicamente la homeostasis del espacioarticular 5,6. Esto se ha observado en la artritis reumatoide (AR). Por ejemplo, cuando el IntL se estropea, los pacientes con artritis reumatoide experimentan síntomas de brote, que se resuelven cuando el revestimientose reconstruye 6,7. La remisión espontánea de la AR está específicamente asociada con MerTK +CD206+ macrófagossinoviales 7. También se identificaron RSM en SF de pacientes con dolor articular agudo, encontrando que la gravedad de la enfermedad infecciosa o inflamatoria correlacionaba con la cantidad de RSM y citocinasinflamatorias 8. Desafortunadamente, la relación entre las estructuras IntL y SubL, las alteraciones funcionales de los RSM y FLS, y la producción de mediadores inflamatorios que pueden dañar cartílago y/o hueso es difícil de cuestionar, especialmente en humanos.

Para investigar los mecanismos subyacentes de la sinopolitis en múltiples entornos clínicamente relevantes, se desarrolló un modelo ex vivo humano llamado Sistema de Análisis Espacial Conjunto (JSAS). Este sistema produce resultados reproducibles con elementos modulares para permitir una evaluación amplia de la artritis inflamatoria e infecciosa. Este artículo describe los procesos de adquisición de tejido en cirugías comunes de articulación abierta, como el reemplazo total de articulaciones, el diseño JSAS, la histomorfometría necesaria para cuantificar alteraciones estructurales agudas en el sinovio y las respuestas funcionales del tejido, incluyendo inmunofluorescencia (FI), ARNscopio y ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA). El JSAS se diferencia de los modelos humanos in vitro comunes por mantener las estructuras IntL y SubL, lo que permite obtener una visión casi in vivo sobre la sinopolitis aguda o aguda en crónica que conduce a daños en el cartílago. Manteniendo la estructura nativa del sinovio, es posible diseccionar las capacidades intrínsecas del RSM y FLS para amortiguar o perpetuar la inflamación. Como modelo ex vivo , no requiere diferenciación de células inmunitarias periféricas en macrófagos sinoviales ni simplificación excesiva del sinovio a solo 1-2 tipos celulares discretos. Se diferencia de modelos animales como la Artritis Inducida por Colágeno (CIA) por utilizar tejido humano naturalmente enfermo, lo que permite una evaluación específica del patógeno relevante para el ser humano. Finalmente, se pueden simular múltiples infecciones, lo que permite un modelo de artritis séptica además de la osteoartritis y la artritis inflamatoria. La principal limitación es el cultivo durante 3 días en condiciones estándar antes del inicio de la apoptosis.

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Protocolo

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El consentimiento del paciente y el protocolo de procesamiento de tejidos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional local (IRB). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Adquisición de tejido y biopsia

  1. Identificar a los pacientes preoperatoriamente según los horarios del cirujano. Recluta pacientes de entre 18 y 65 años que estén sometiéndose a cirugía articular abierta, como la artroplastia total de rodilla (ATC) o la osteotomía del tubérculo tibial (TTO, también conocida como Fulkerson), y que no estén tomando medicación inmunomoduladora sistémica.
    NOTA: Idealmente, excluir a los pacientes que se someten a más de una artroscopia o a más de una inyección de glucocorticoides, ya que estos pacientes presentaron un mayor fracaso intraoperatorio en la adquisición de tejido que otras poblaciones debido a fibrosis. Dado el riesgo de transmisión de infección, se puede aplazar el reclutamiento de pacientes con antecedentes de hepatitis C o virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) a menos que sea relevante para los resultados. Practica en todo momento prácticas seguras de manipulación con tejido humano fresco, independientemente del estado de la enfermedad infecciosa.
  2. Los cirujanos ortopédicos realizan artrotomías y disecciones como parte del procedimiento quirúrgico estándar. Identificar la sinovia anterior inmediatamente proximal al surco troclear, y utilizar electrocauterio para extirpar la sinovio en bloque, evitando la disección del músculo articular genu o cerca de los epicóndilos medial y lateral. La sinonovectomía es relativamente neutra para los resultados de la ATC y, en condiciones inflamatorias, puede serbeneficiosa 9,10. Pasar la sinovio de forma estéril al miembro del equipo de investigación y colócala en un recipiente estéril para muestras con solución salina con fosfato (DPBS) fría de Dulbecco sobre hielo.
    NOTA: Terminar la adquisición de tejido si el equipo quirúrgico detecta anomalías, o si la sinonovectomía afectaría el cierre o el resultado quirúrgico. Esto último, en particular, sería muy poco común en la ATC, ya que la escisión de sinovio puede utilizarse como procedimiento extensil para aflojar articulaciones tensas. La cantidad de escisións depende del tamaño del experimento. Es posible obtener aproximadamente cuatro núcleos de biopsia de 3 mm por cada 1 cm2 de tejido. En muchos casos, es posible obtener 24cm 2 o más de tejido. El peso del tejido depende en gran medida de la disección quirúrgica, por lo que no es tan fiable como la superficie para determinar la adecuación del experimento. La Figura 1 ilustra los pasos 1.2-1.7.
  3. Devuelvo el sinovio al laboratorio y lávao dos veces en DPBS frío durante 10 minutos sobre un balancín de placa.
  4. Transfiere la sinovio a una placa de Petri estéril de 10 cm o más en condiciones estériles en un gabinete certificado de bioseguridad nivel 2 (BSL2). Añade medios fríos, estériles y de baja glucosa Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) que contienen piruvato sódico y L-glutamina, suficiente para llenar el plato hasta la mitad. Identifica el revestimiento sinovial por la capa IntL perlada (Figura 2A), en contraposición al lado cauterizado (Figura 2B).
    NOTA: El IntL es frágil. Ten cuidado de no despegarlo, o se disociará del subrevestimiento (Figura 2A, sujetado por hemostato). La perla puede estar alterada por antecedentes previos de hemartrosis (que aparece de color amarillo-anaranjado debido a la hemosiderina), un IMC alto (cubierto de adiposa) o inflamación (roja, friable y villosa). Es absolutamente esencial identificar correctamente al IntL antes de proceder. Examina detenidamente si hay signos de escisión quirúrgica, cauterización, sangrado y coagulación para determinar que los siguientes pasos no se están realizando en el IntL.
  5. Disecciona tejido adiposo y estroma externo en el lado cauterizado para aislar la sinovia, manteniendo aproximadamente 4-5 mm de profundidad tisular en todas las áreas. Se pueden usar tijeras de iris o bisturís según su preferencia personal. Cambiar el medio de la placa de Petri según sea necesario para mantener el campo de visión.
    NOTA: El tejido estromal posterior o adiposo se extirpa fácilmente. Sin embargo, la dificultad para la disección o la sensación de gran resistencia indican ligamentos retenidos, metaplasia tisular como deposición inapropiada de cartílago o corte a través del IntL.
  6. Una vez diseccionados a la profundidad adecuada, obtener núcleos de biopsia de 3 mm según sea necesario para un mínimo de 2 réplicas técnicas por condición probada. Actúa con el revestimiento sinovial orientado hacia la herramienta de extracción en lugar de contra la superficie de la placa de Petri. Un punzón de biopsia de calidad puede usarse aproximadamente 10-15 veces antes de necesitar ser reemplazado debido a un embotamiento, ya que un punzón de biopsia sin filo puede dañar la estructura del revestimiento íntimo.
    1. Realiza el núcleo con carga perpendicular fuerte y torsión suave. Si esto retuerce el tejido, la herramienta de biopsia se ha vuelto desafilada y necesita ser reemplazada. Estabiliza con la mano no dominante usando pinzas o hemostáticos.
      NOTA: Se utilizaron testemulos de 3 mm para maximizar la perfusión tisular, así como el número de testejos por paciente y garantizar suficientes réplicas técnicas para estos experimentos. Se pueden usar núcleos de tamaños alternativos, pero solo se probaron 3 mm para este protocolo.
      NOTA: El exceso de adiposo retenido por disección insuficiente puede causar que el núcleo flote en JSAS, lo cual es subóptimo. Si los núcleos flotan hacia la superficie en lugar de permanecer sumergidos, vuelve a la disección o elige un núcleo sumergido.
  7. Abre una segunda placa de Petri y llénala con 5-10 mL de medio caliente (37 °C) con un 10% de FBS. Con pinzas planas o sin dientes, transfiere los núcleos a esta placa para eliminar los restos con 1-2 segundos de agitación mecánica suave. No aprietes los núcleos con fuerza, o esto podría dañar el revestimiento íntimo.
    NOTA: Puede hacer una pausa aquí durante ≤24 horas colocando testosinas de tejido en la incubadora a un ajuste estándar de 37 °C y 5% deCO2.

2. Creación del Sistema Conjunto de Análisis Espacial (JSAS)

  1. Preparar el pozo inferior de JSAS con 600 μL de DMEM de glucosa baja calentada (37 °C) con un 10% de FBS. Aunque se ha analizado el 1% de penicilina-estreptomicina sin efectos negativos notables en este sistema, normalmente no se añaden antibióticos al medio si la esterilidad se ha mantenido adecuadamente.
    NOTA: Si se co-cultiva con bacterias o una línea celular que requiere un medio diferente, el pozo inferior puede ser un medio distinto. Evita medios antibióticos si se cultiva junto con bacterias.
  2. En el fondo del pozo, añade el tratamiento que prefieras. Por ejemplo, lipopolisacáridos (LPS). Para evitar diferencias de osmolaridad, se recomienda que el volumen del tratamiento no supere el 2,5% del volumen total (por ejemplo, ≤15 μL para 600 μL). Amortigua cualquier cambio de pH de los tratamientos para mantener el pH de 7,0 a 7,4. Si no, utiliza los controles del vehículo.
  3. Elige el tamaño del poro del pozo trans según el resultado experimental deseado (Figura 3).
  4. Añade 300 μL de DMEM de baja glucosa con un 10% de FBS al pozo trans.
  5. Transfiere suavemente los núcleos individuales con pinzas estériles al medio del transpozo. La orientación del tejido no puede controlarse; Sin embargo, la adiposidad y la flotabilidad natural del tejido estromal, de forma natural, hacen que el revestimiento íntimo esté orientado hacia abajo en la mayoría de los núcleos tisulares.
    1. Visualiza cuidadosamente los núcleos, ya que el proceso de perforación puede alterar el revestimiento íntimo, y evita usar núcleos que parezcan deshilachados al inicio del experimento. Si el núcleo está flotando, mejora la disección y elige un núcleo alternativo.
      NOTA: Considera una matriz de colágeno si la orientación del tejido es importante; Sin embargo, esto afectará el tiempo necesario para desarrollar un gradiente químico con el pozo del fondo.
  6. Colocarlo en incubadora a 37 °C y 5% deCO2 durante el tiempo deseado.
    NOTA: El momento más temprano recomendado para cambios biológicos es a las 8 horas. El último punto validado para la actividad biológica es de 3 días.

3. Desmontaje y análisis experimental

  1. Para la histología, se utilizan pinzas estériles y no dentadas para transferir tejido a 3-5 mL de formalina neutral tamponada al 10% (NBF) para análisis con formalina fijada y parafina (FFPE). Guárdalos en NBF durante 3-7 días antes de incrustar y seccionar.
    1. No dejes el tejido reposar durante largos periodos, ya que esto empeora la autofluorescencia. Realizar análisis histológicos, incluyendo tinción con hematoxilina y eosina (H&E)11 para histomorfometría, inmunofluorescencia (IF)12 y/o ARNoscopio con FI13 según métodos estándar.
      NOTA: Ten cuidado de no perforar el transwell con pinzas al retirar el tejido. Sé extremadamente suave al transferir el núcleo, o el revestimiento íntimo puede disociarse. Coloca suavemente el núcleo en el fijador y no agites. El NBF debe usarse dentro de una campana extractora certificada para productos químicos, debe desecharse conforme a las directrices locales de salud y seguridad ambiental (EHS) y no puede verter en los fregaderos. El tejido humano no utilizado del experimento se coloca en exceso de lejía al 10% durante 30 minutos, luego se coloca en contención secundaria según los requisitos locales del EHS y se elimina en contenedores de biohazard etiquetados para su incineración. La solución de lejía puede vertirse por el fregadero si la aprueba el servicio local de servicios de liquidación. Sigue las directrices locales, que pueden variar según la institución.
  2. Embed technical replicas en el mismo bloque FFPE. Utiliza casetes apantallados para evitar la pérdida de muestra. Sección en el eje longitudinal de 5 μm de espesor. Coloque tres secciones seriadas en una diapositiva (Figura suplementaria 1).
  3. Imagen de las diapositivas H&E a 10x y 40x usando microscopía de campo claro. Identifica el IntL como la capa celular organizada en la interfaz entre el tejido y el espacio vacío.
    1. Adquiere 3 secciones representativas de 10x y 10 secciones representativas de 40x distribuidas en un mínimo de 2 réplicas técnicas por condición de tratamiento, manteniendo el IntL en el campo de visión. Captura imágenes como TIFFs de alta resolución. Realizar análisis histomorfométrico:
    2. Realiza mediciones en ImageJ/FIJI. Primero, configura la escala usando el menú Analizar → Establecer Escala. Set Scale requiere el uso de una lámina de calibración realizada en cada microscopio respectivo en cada objetivo. Primero, utiliza la herramienta de línea recta para crear una línea de longitud conocida basada en la imagen de la diapositiva de calibración. Asigna la escala globalmente.
      NOTA: A 10x, la escala es de 3 px/μm. A 40x, la escala es de 12 px/μm.
    3. Mide el grosor SubL usando las imágenes 10x con la herramienta de línea recta. Mide el espesor como una profundidad de plomo desde la superficie IntL hasta el fondo del SubL (μm). Después de dibujar cada línea, utiliza el atajo de teclado m para medir la longitud de la línea.
      1. Haz una media mínima de 5 mediciones por cada imagen de 10x (Figuras 4A, B). La transición entre el tejido subL y el estroma se delimita mediante una transición hacia áreas menos organizadas y menos celulares que contienen colágeno y adiposo (Figura 4B). Divide el punto de transición entre compartimentos tisulares.
    4. Para mediciones 40x del grosor IntL, la cellularidad IntL, la integridad IntL y la celularidad SubL, comienza abriendo el TIFF 40x en Adobe Photoshop (o cualquier editor de imágenes similar). El IntL se define como una capa de ~1-5 células de grosor, organizada en una capa celular distinta en la interfaz entre el tejido y el espacio vacío (por ejemplo, líquido sinovial) (Figura 4C).
    5. Crea una nueva capa. Selecciona la herramienta Lazo Poligonal . Mediante un clic del ratón para iniciar las inflexiones del lazo y ancla en la línea, se divide la transición entre el IntL y el SubL a lo largo de toda la imagen. Luego, continúa el lazo justo fuera del IntL, en el espacio vacío.
      1. Cierra el lazo con un doble clic. Invierte el área seleccionada (selecciona → inverso), luego rellena el espacio con negro usando la herramienta de cubo de pintura . Esto cubrirá todas las áreas que no sean el IntL. Guarda esta imagen como un JPG de alta resolución que representa el IntL y luego oculta la capa.
    6. Crea una nueva capa. En la configuración de lazo poligonal, selecciona la característica de intersección , que solo seleccionará dónde se cruzan la nueva zona del lazo y las antiguas. Haz lazo alrededor de la capa de sublining haciendo clic por el centro del IntL, alrededor de los bordes izquierdo y derecho de la imagen hasta el lienzo de fondo, y luego bisecta la transición entre el SubL y el tejido acelular detrás de ella.
      1. Si la parte inferior del SubL supera las dimensiones de la imagen de 40x, simplemente selecciona el lienzo de fondo alrededor del borde restante. De nuevo, selecciona el inverso de esta zona como antes, luego usa la herramienta cubo de pintura para rellenar con negro. Guarda esta imagen como un JPG de alta resolución que representa el SubL. Guarda esta imagen en capas como PSD para futuras referencias.
        NOTA: Los eritrocitos son comunes en estas láminas y pueden interferir con futuras mediciones de recuento celular. Si hay grandes áreas de vasculatura, utiliza la herramienta de lazo poligonal, la herramienta de pincel u otras herramientas preferidas para crear máscaras en una capa separada que cubra esas áreas.
    7. En FIJI, abre la imagen de la máscara  IntL. Mide el grosor IntL (μm) como un promedio de un mínimo de 5 mediciones sobre la imagen de 40x usando la herramienta de línea recta como en los pasos 3.3.2-3.3.3.
    8. Mide la longitud total (μm) del IntL usando la herramienta de línea segmentada. Luego mide solo la longitud de las áreas intactas, también con la herramienta de línea segmentada (Figura 4D,E). Las secciones IntL que no están intactas están delimitadas por huecos entre células, un aspecto devorado por polillas y la ruptura o desprendimiento de IntL del tejido.
      1. Calcula el % de frontera intL intacta en como (intL intacto/total IntL)*100. Esto debe compararse con los mismos controles de puntos temporales para compensar cualquier artefacto de seccionamiento.
    9. Mide la cellularidad del IntL usando la imagen de la máscara IntL. Primero, transforma a 8 bits (Tipo → Imagen → 8 bits). Luego el umbral (Imagen → umbral) para minimizar el ruido y maximizar la identificación de la celda. En el menú de umbrales, desselecciona fondo oscuro y usa el interruptor inferior para ajustes.
      1. Determinar manualmente el umbral por imagen, ayudado por la desaparición del ruido (por ejemplo, artefacto de fondo) manteniendo el número original de cuerpos nucleares. Compara frecuentemente la imagen original para mantener la fidelidad. Cuando el ruido se minimiza (falso positivo) pero la señal de hematoxilina se maximiza (verdadero positivo nuclear), es apropiado establecer el umbral (Figura suplementaria 2).
        NOTA: El umbral será consistente en un escaneo de diapositivas, pero variará entre escaneos de diapositivas y también entre imágenes individuales de 10x o 40x. También variará entre lotes de H&E, ya que la profundidad de color probablemente no sea constante. Por tanto, los macros simples son inapropiados si existen diferencias en cualquiera de las siguientes categorías entre imágenes: paciente, lote H&E, grosor de sección, condiciones de iluminación (brillo de la luz en la sala o microscopio/temperatura de color), software utilizado para adquirir la imagen, microscopio utilizado para adquirir la imagen y uso de algoritmos de balance de blancos o de color de equilibrado. Esta lista no es exhaustiva. Utilizando el microscopio AmScope T390B-3M con cámara y software compatibles, con luz máxima en una sala tenuemente iluminada, utilizando ajustes automáticos de balance de blancos, 10 imágenes aleatorias 40x que abarcan 3 pacientes, el umbral osciló entre 96 y 182, con una media de 137. Este amplio rango refleja las diferencias en los histogramas subyacentes de 8 bits, no la inconsistencia del usuario. Por tanto, es esencial asegurar la fidelidad visual entre la imagen original y la imagen umbral, no el número exacto del umbral. Automatizar este proceso está fuera del alcance típico de un científico de laboratorio y requeriría la programación de un profesional del análisis de imágenes.
    10. Utiliza Analizar Partículas (Analizar → analizar partículas) con tamaño celular de 8-150μm2 para identificar y contar núcleos como sustituto del número celular. Selecciona máscaras superpuestas en la configuración para visualizar las celdas identificadas, de nuevo comparando con la imagen original. Como el IntL es principalmente una estructura lineal, no volumétrica, normaliza estos 100 μm de longitud IntL (por ejemplo, #cells/100 μm). Esto promedió aproximadamente 13,19 células (rango 5,4-21,9, DE 3,9) por 100 μm en tejido sinovial recién extraído.
      NOTA: El rango 8-150μm 2 se determinó basándose en la Escala de Conjunto y la comparación visual iterativa de la imagen umbral con la imagen original. Los límites determinados empíricamente a través del conjunto de datos corresponden a supuestos de forma basados en macrófagos que tienen un diámetro celular que puede variar aproximadamente entre 8-20μm 14,15. Se excluyeron tamaños mayores, ya que esto a menudo representaba múltiples núcleos discretos en estrecha proximidad que se leían como una sola celda.
      NOTA: Se pueden establecer flujos de trabajo similares, por ejemplo, en QuPath.
    11. Abrir la máscara SubL con los eritrocitos excluidos (Figura 4G). Realizar la transformación de 8 bits, el umbral y analizar partículas como se menciona en los pasos 3.3.9-10. Como el SubL es una capa volumétrica, normalizar el número de celdas contadas a 100μm2 del área SubL (por ejemplo, medición de áreas no enmascaradas) (Figura 4H).
  4. Para el análisis de citometría de flujo de células migratorias en el pozo de fondo, centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 10 minutos y mantener el pellet celular en hielo. Espera ~20.000 células vivas migratorias por núcleo de biopsia de 3 mm a las 24 horas. Los métodos de citometría de flujo han sido publicados anteriormente8.
  5. Para ELISA, centrifugar medios a máxima velocidad (>5000 x g) durante 5 minutos a 4 °C para pelletar cualquier célula o residuo celular. Guárdalo a la temperatura deseada. Los métodos ELISA se han publicadoanteriormente 8.

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Resultados

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Optimización de las condiciones de cultivo de oxígeno

La perfusión fisiológica de tejidos es aproximadamente entre un 6% y un 8% de oxígeno, mientras que las condiciones estándar de incubación para cultivo celular son en niveles de oxígeno atmosférico (~21%)16. En comparación, la hiperoxigenación puede mejorar la viabilidad del cultivo celular o sertóxica 17. La utilización adecuada del JSAS requirió una determinación temprana de...

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Discusión

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Este trabajo demostró capacidades de JSAS, específicamente el mantenimiento de tejido sinovial vivo con arquitectura sinovial intacta y funcionalmente responsiva. La muerte celular fue mínima hasta 72 horas de cultivo en la mayoría de las condiciones de incubación. Para evaluar los cambios microscópicos de la estructura sinovial, se describió un sistema histológico único de medición que cuantifica las alteraciones estructurales del IntL y el SubL. Estos cambios indican una sinovitis agud...

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Divulgaciones

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No hay conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Este protocolo no sería posible sin la generosidad de los pacientes que donaron su tejido y la habilidad de nuestros colegas de cirugía ortopédica, que están dispuestos a adquirir tejido de forma segura en nombre del trabajo. K.I.C. cuenta con el apoyo de NIAMS K08 AR084605, y C.P.P. cuenta con el apoyo del Programa de Desarrollo Profesional de Asuntos de Veteranos [IK2BX004532]. Este grupo reconoce el uso del Centro Central de Investigación en Microscopía de la Universidad de Iowa, un recurso central apoyado por el Vicepresidente de Investigación de la Universidad de Iowa y la Facultad Carver de Medicina. Los datos de citometría de flujo se obtuvieron en la Instalación de Citometría de Flujo, que es una instalación central de investigación del Carver College of Medicine / Centro Integral de Cáncer Holden en la Universidad de Iowa. La instalación se financia mediante tasas de usuario y el generoso apoyo financiero del Carver College of Medicine, el Holden Comprehensive Cancer Center y el Iowa City Veteran's Administration Medical Center. La investigación reportada en esta publicación contó con el apoyo de: el Centro Nacional de Recursos de Investigación de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número 1 S10 OD034193-01; y el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número P30CA086862.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10 cm Petri dishesCorningCLS430167
23srRNA RNAscope probeACD/Biotechne468211
24 well platesLife Sciences3524
3 mm biopsy punchesIntegra12460406
50 mL conicalsN/A
70% ethanol (for sterilization)N/A
Borrelia burgdorferiATCC35210 must be utilized in the late exponential phase for maximum pathogenicity
BSK-HSigma-AldrichB8291
CD68 antibodyInvitrogen14-0688-821:1000
CO2 tank (standard conditions)N/A
Dulbecco's Phosphate buffered saline (Ca-/Mg-)Thermofisher14190144
fetal bovine serumBiotechneS11150Heat inactivated Lot: F22100
forceps (non-toothed)N/A
hemostatN/A
Humidified cell incubator (standard conditions)N/A
Hypoxia incubatorN/A
hypoxia tank (5% O2, 5% CO2, remainder N2, physiologic conditions)N/A
IL-4 antibodyThermofisherMA5-424701:100
iNOS antibodyThermofisherPA1-0361:100
Iris scissorsN/A
LipopolysaccharideSigma-AldrichL2630
low glucose DMEM (+Sodium pyruvate, +L-glutamine)Life Technologies11885084
MMP9 antibodyThermofisherMA5-327051:1000
Modular incubator chamber (hyperoxic conditions)Emrbient, IncMIC-101
Monocyte chemoattractant protein 1Peptrotech300-04-20UG
N-acetyl cysteineSigma-AldrichA9165Must be made fresh for each experiment and buffered in equimolar sodium bicarbonate to a pH of 7-7.4
OPG ELISAMilliporeRAB04841:1 dilution
Oxygen tank with liter per minute flow regulatorN/A
PDPN antibodyInvitrogen14-9381-821:100
Propidium IodideThermofisherJ66764.MC
RNAscope multiplex fluorescent V2 assayACD/Biotechne323100
sRANKL ELISAMyBioSourceMBS2626241:1 dilution
Staphylococcus aureus USA 300 MRSAATCCBAA-1717
SYBR GreenThermofisherS756310,000X stock
TNF antibodyThermofisherPA5-198101:100
transwell inserts - 0.4 um sizeMillicellPICM01250
transwell inserts - 5 um sizeCorningCLS3421

Referencias

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