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Artículo de método

Gavage oral en cachorros de ratón neonatal y evaluación funcional de la integridad de la barrera intestinal usando cámaras de uso

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DOI:

10.3791/69751

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9 de enero de 2026

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1INSERM U1149, Center of Research on Inflammation, Université Paris Cité, 2CHRU Nancy, IHU Infiny

En este artículo

Resumen

Este artículo describe: (1) administración oral por gavage de moléculas de prueba a ratones neonatales tan pronto como el DOL 6; y (2) evaluación ex vivo de la función de la barrera epitelial del colon en biopsias desde cachorros DOL 10 hasta destete (DOL 20) mediante la evaluación de la permeabilidad paracelular y transcelular con cámaras de Ussing.

Resumen

La creciente evidencia subraya la importancia de los primeros 1.000 días de vida en la configuración del eje intestino-microbioma. Esta ventana de vida temprana es fundamental para el establecimiento de trayectorias fisiológicas a largo plazo y adaptaciones inmunológicas, lo que puede influir en la susceptibilidad a enfermedades relacionadas con la disbiosis y la disfunción de la barrera. Una comprensión más profunda de los mecanismos subyacentes requiere una evaluación exhaustiva de parámetros fisiológicos clave, incluyendo la permeabilidad paracelular y transcelular del intestino neonatal. Evaluar estos parámetros es esencial para esclarecer cómo las exposiciones tempranas a moléculas exógenas pueden influir en la integridad intestinal y los resultados de salud a largo plazo. Por ello, la primera parte de este artículo describe la administración oral de moléculas de interés en cachorros de ratón tan pronto como en la edad de la vida, minimizando al mismo tiempo el estrés, el riesgo de lesiones y el canibalismo. Se utilizan agujas de alimentación lubricadas y de punta redondeada de 24 g para hacer el gatillo de ratón que pesan al menos 2,5 g. La segunda parte describe la evaluación ex vivo de la permeabilidad paracelular y transcelular utilizando ensayos en cámara de Ussing en muestras de colon de crías entre DOL-10 y el destete. Se utilizan deslizadores sin pasadores adaptados para pequeñas biopsias en combinación con cámaras de Ussing para montar muestras de colon neonatal. La sonda paracelular FITC-Dextran 4 kDa y el marcador transcelular peroxidasa de rábano picante 44 kDa Tipo VI se añaden al compartimento apical del sistema al inicio del ensayo. Las muestras se recogen en el compartimento basolateral a 0 min, 30 min, 60 min, 90 min y 120 min para cuantificar el paso de la sonda. El paso de ambos marcadores se cuantifica directamente (FITC) e indirectamente (HRP) mediante un lector de placas, calculado usando curvas estándar y expresado como flujo.

Introducción

La integridad de la barrera intestinal desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la salud general al coordinar la respuesta inmune mucosa y regular la permeabilidad selectiva del epitelio intestinal. Este sistema de barrera controla el paso de nutrientes mientras previene la translocación de patógenos, antígenos y toxinas en la circulaciónsistémica 1. La alteración crónica de esta interfaz, asociada a un aumento de la permeabilidad intestinal, comúnmente conocida como "intestino permeable", se identifica ahora no solo como consecuencia, sino también como un factor que provoca estados inflamatorios crónicos y una serie de patologíasextraintestinales 2.

Por ejemplo, se ha demostrado que la función comprometida de la barrera intestinal es un componente clave de trastornos autoinmunes y metabólicos como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la artritis idiopática juvenil (JIA) y la diabetes tipo 1 (DT1). Esto destaca el estado de barrera intestinal como biomarcador clave, pero también como un objetivo terapéutico para prevenir el inicio de procesos fisiopatológicos lo antes posible y para prevenir la progresión de la inflamación aguda a un estado crónico 3,4,5,6.

En este contexto, el periodo neonatal representa una ventana de desarrollo única y altamente sensible durante la cual el establecimiento y maduración de la interfaz intestino-microbiota influyen profundamente en la salud intestinal y sistémica alo largo de toda la vida 7. En esta etapa temprana, el epitelio intestinal y el sistema inmunitario muestran una sensibilidad aumentada tanto a factores endógenos como exógenos, experimentando un crecimiento y diferenciación rápidos mientras se adaptan simultáneamente a la colonización microbiana y a los cambios en la dieta. Las alteraciones que perjudican la integridad de la barrera intestinal durante esta ventana crítica de desarrollo pueden desempeñar un papel fundamental en la aparición de un amplio espectro de trastornos agudos y crónicos más adelante en la vida. Estas condiciones incluyen enfermedades inmunomediadas como alergias alimentarias, y enfermedades crónicas más graves, como EII, JIA y la diabetestipo 1 7,8,9. Estas enfermedades subrayan cómo los procesos fisiopatológicos suelen originarse temprano, ya que el inicio principal generalmente ocurre entre la infancia y la primera edadadulta 10,11. Por lo tanto, comprender los mecanismos que rigen la función de la barrera intestinal en los neonatos es esencial para desarrollar estrategias preventivas y terapéuticas destinadas a reducir la carga de muchas enfermedades crónicas.

En este contexto, existe una necesidad urgente de herramientas fiables y fisiológicamente relevantes para estudiar la integridad de la barrera intestinal, los mecanismos de enfermedades crónicas y la inflamación, específicamente en el entorno neonatal. Estas herramientas deben permitir replicar ensayos experimentales ya probados en el contexto adulto sin sacrificar precisión y eficacia. Además, es cada vez más urgente investigar tanto los efectos a corto como a largo plazo de muchos candidatos moleculares de interés, que se espera tengan efectos beneficiosos o perjudiciales sobre la homeostasis intestinal en el contexto neonatal. Entre las herramientas disponibles, la administración oral de gavage en cachorros de ratón neonatal representa un método más que fiable para administrar moléculas de interés en una etapa definida del desarrollo. Permite realizar investigaciones controladas sobre los efectos de diversos compuestos bioactivos, fármacos o metabolitos microbianos en la maduración intestinal y la función de la barrera.

La primera parte de este artículo describe un método para el gavage de crías de ratón desde el Día de la Vida (DOL) 6, permitiendo estudiar intervenciones antes, durante y después de la enorme expansión del número de especies de la microbiota intestinal inducida por la diversificación alimenticia. Así, esta técnica permite análisis longitudinales de los efectos del tratamiento en la salud intestinal a medida que los cachorros crecen y se desarrollan.

En la segunda parte de este artículo, y complementando este enfoque, la evaluación ex vivo de la función de la barrera epitelial del colon utilizando cámaras de Ussing proporciona una medida sensible y cuantitativa de las características de permeabilidad. La evaluación de la permeabilidad tanto paracelular como transcelular en biopsias de colon de ratones neonatales (por ejemplo, cachorros DOL 10) permite determinar con precisión el impacto de varios candidatos clave en la integridad y función de la barrera epitelial. El transporte paracelular es un mecanismo esencialmente pasivo que ocurre a través del espacio intercelular de la capa epitelial. Permite el paso de pequeños solutos impulsados por gradientes electroquímicos y osmóticos desde el lumen hasta el lado basolateral. Este mecanismo está regulado principalmente por proteínas de la familia de las uniones estrechas, como los Claude y la ocludina. El transporte transcelular, en cambio, es un mecanismo activo que permite la absorción de solutos más grandes y ocurre a través de las células epiteliales a través de canales específicos, portadores y bombas.

El isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (4 kDa) sufre predominantemente transporte paracelular debido a su tamaño, mientras que la peroxidasa de rábano picante (HRP; 44 kDa) se transmite selectivamente al lado basolateral a través de vías transcelulares. La cuantificación de estos marcadores no endógenos permite así una evaluación distinta de la permeabilidad paracelular y transcelular, respectivamente. El ensayo en cámara de Ussing con FITC y HRP preserva la arquitectura tisular y permite la medición en tiempo real de la permeabilidad paracelular y transcelular respectivamente de cualquier segmento del tracto intestinal. Esta combinación de análisis de la cámara neonatal y la cámara de Ussing ofrece una estrategia poderosa para estudiar cómo moléculas específicas afectan al funcionamiento de la barrera intestinal tanto de forma inmediata como durante períodos más largos, informando estrategias para mitigar la inflamación y prevenir enfermedades crónicas desde las primeras etapas de la vida.

En resumen, este protocolo describe dos procedimientos experimentales complementarios que permiten: (1) la administración de moléculas de interés en el periodo neonatal temprano a cachorros de ratón (paso 1); (2) evaluación tanto de la permeabilidad para como transcelular en segmentos del tracto intestinal desde crías neonatales hasta en proceso de destete utilizando cámaras de Ussing (pasos 2-6).

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo conforme a la normativa nacional aplicable y fueron aprobados por el Ministerio francés de Educación Superior, Investigación e Innovación a través de la plataforma APAFIS (Número de autorización: APAFIS#23855) y subvenciones de la Agence Nationale pour la Recherche (ANR): 11-IDEX-0005-02, ANR-24-CE15-7152 y 18-IDEX-0001. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Gavage de crías de ratón neonatal

NOTA: El siguiente método está adaptado de Francis et al.12. Aunque el protocolo original permitía el gavage de cachorros de ratón ya en el DOL 2, el gavage no se realizó antes del DOL 6 aquí, ya que las exigencias técnicas a edades más tempranas hacen que el procedimiento sea considerablemente más complicado. Además, el uso de cachorros más jóvenes complica los estudios, ya que aumenta el riesgo de pérdida de animales durante los primeros días de tratamiento, requiriendo así cohortes más grandes.

  1. Preparación y configuración de soluciones Gavage
    1. Pesa a cada cachorro individualmente.
    2. Ajusta la concentración y el volumen de la solución gavage para que el volumen total administrado no supere los 20 μL por gramo de peso corporal.
      NOTA: En condiciones estándar, los cachorros de ratón rara vez pesan menos de 2,5 g en el DOL 6.
    3. Lava una aguja de alimentación de punta redonda de 24 G enjuagándola bien con agua desionizada, seguida de un 70% de etanol con una jeringuilla, y luego autoclave.
      NOTA: Se recomienda utilizar una aguja de alimentación separada para cada grupo de tratamiento para evitar la contaminación cruzada.
    4. Coloca toallas de papel limpias sobre una almohadilla térmica desinfectada a ~38 °C.
    5. Lava los guantes con etanol al 70% antes de abrir las jaulas para limitar la transferencia de olor a los cachorros y reducir el riesgo de canibalización.
    6. Traslada a la madre a una jaula separada en otra habitación para limitar el estrés causado por las posibles vocalizaciones de los cachorros.
    7. Frota los guantes limpios con materiales de anidación para limitar el riesgo de transferencia de olores externos a los cachorros durante el vaivén de la man.
    8. Mide la longitud entre el proceso xifoides (extremo inferior del esternón) y el hocico de un cachorro para marcar la longitud máxima de inserción en la aguja de alimentación (Figura 1A,B).
  2. Gavage intraesofágico de cachorros de ratón
    1. Sujeta la cabeza de la aguja a una jeringuilla de forma estéril y toma más de la cantidad deseada de solución de gavage para administrar todo el volumen requerido sin riesgo de administrar burbujas de aire, ya que aumentan drásticamente el riesgo de aspiración.
    2. Usando el pulgar y el índice de la mano no dominante, pellizca suavemente la piel entre las escápulas para levantar al cachorro.
      NOTA: No saques demasiada piel de la espalda del cachorro, ya que esto podría inducir asfixia.
    3. Sujeta al cachorro en una posición casi horizontal e inserta suavemente la aguja de alimentación en la cavidad oral, avanzando perpendicularmente a la faringe hasta llegar a la parte trasera de la garganta (Figura 1C).
    4. Manteniendo el mismo ángulo y profundidad, desliza la aguja hacia la parte derecha o izquierda de la cavidad bucal para evitar la lengua.
    5. Ajusta lentamente el ángulo de la aguja inclinando suavemente la cabeza del cachorro hacia atrás, hasta que la jeringuilla, la cabeza y la espalda estén alineadas, inclinando ligeramente hacia atrás (Figura 1D).
    6. Sin aplicar presión, dejar que la jeringuilla descienda lentamente bajo su propio peso hasta que la marca máxima de inserción esté cerca o alcance el nivel del hocico (Figura 1E).
      NOTA: Si se encuentra resistencia, gira suavemente la jeringuilla haciéndola rodar de un lado a otro entre los dedos para facilitar el descenso. Si la jeringuilla sigue sin avanzar, intenta ajustar el ángulo de inserción o reinicia el procedimiento usando una aguja de alimentación lubricada con la solución de gavage. La aguja no debe permanecer insertada más de 20 segundos para evitar asfixia.
    7. Una vez alcanzada o cercada la marca máxima de inserción, dispensa rápidamente el volumen deseado. Si se encuentra resistencia al dispensar el volumen, comprueba la alineación de la jeringuilla-cabeza-atrás y ajusta ligeramente la profundidad de inserción.
      NOTA: Se recomienda una dispensación rápida del volumen, ya que la inserción prolongada de la aguja aumenta significativamente el riesgo de asfixia, dificultades y posibles lesiones en el animal.
    8. Una vez administrado el volumen correcto, retira suavemente la aguja en el mismo ángulo utilizado para la inserción.
    9. Coloca al cachorro sobre la toalla de papel que antes colocó sobre la almohadilla térmica y controla la recuperación. Un patrón de respiración normal debería volver en menos de 20 segundos.
      NOTA: La aparición de burbujas desde el hocico o la boca del animal indica aspiración y requiere eutanasia inmediata en crías menores que el DOL 14. La presencia de una cantidad muy pequeña de sangre en la boca del animal causada por una lesión entre la orofaringe y el esófago requiere un seguimiento del animal, pero no una eutanasia sistemática. Si la recuperación del cachorro no es cierta, colócalo de lado. Si no intenta enderezarse, eutanasia inmediatamente.
    10. Una vez confirmada la recuperación del animal, vuelve a colocar al cachorro en el nido y reagruparlo con su madre.
      NOTA: Hasta el DOL 10, los cachorros tienen poca movilidad y pueden permanecer en la almohadilla térmica hasta que se complete el ataque de todos los cachorros en la jaula. Los cachorros mayores no deben quedarse descuidados en la alfombrilla, ya que podrían intentar escapar.

Figura 1
Figura 1: Gavage de un cachorro de ratón recién nacido en el DOL 10. La distancia entre el hocico y el proceso xifoides se mide (A), permitiendo marcar la longitud máxima de inserción en la aguja de alimentación (B). La aguja de alimentación se inserta en la parte izquierda o derecha de la cavidad oral (C). Una vez alcanzado la parte trasera de la garganta, se ajusta el ángulo de la aguja hasta que la jeringuilla, la cabeza y la espalda del animal quedan alineadas (D). Se deja que la aguja se deslice suavemente hacia abajo sin resistencia hasta que la marca máxima de inserción está casi alcanzada o alcanzada (E). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Eutanasia de cachorro neonatal y extracción de colon

  1. Realizar la eutanasia utilizando el método adecuado establecido por la legislación nacional.
    NOTA: Se recomienda la decapitación de cachorros hasta el DOL 10 y la dislocación cervical de cachorros de edad superior al DOL 10. No se recomienda la eutanasia con CO2 ni anestésicos, ya que los cachorros muestran una gran tolerancia a estos métodos.
  2. Coloca al animal eutanasiado bajo un microscopio binocular.
  3. Aplica etanol al 70% en el abdomen del animal.
  4. Con pinzas, pellizca la piel abdominal y el peritoneo subyacente y realiza una gran incisión transversal abdominal con tijeras finas (perpendiculares al eje rostral-caudal) sin cortar el intestino.
  5. Inserta suavemente las tijeras finas en la incisión y extiende el corte lateralmente a través del peritoneo por ambos lados.
  6. Utilizando pinzas y tijeras finas, se abren tanto las partes superiores como inferiores del peritoneo, desde la región torácica hasta la zona pélvica inferior (Figura 2A).
  7. Identifica la parte distal del colon y realiza una incisión paralela a su eje, hacia el recto.
  8. Haz una incisión en la parte terminal/rectal del colon para movilizarlo.
  9. Tira suavemente del colon y avanza hacia el ceco, eliminando posibles fragmentos de tejido conectivo o graso.
  10. Liberar el colon del abdomen cortando en la unión ileocecal, por encima del ceco (Figura 2B).
  11. Descarta el ceco y los primeros milímetros del colon proximal, luego recoge una o dos muestras del colon proximal que sean mayores que el tamaño de apertura del deslizador de Ussing (Figura 2C).
    NOTA: Se recomienda asegurar dos biopsias de gran tamaño, ya que el colon neonatal es extremadamente frágil y puede desgarrarse, lacerarse o perforarse fácilmente durante la limpieza y el montaje.
  12. Con las tijeras cerradas, retira suavemente el contenido fecal de la biopsia aplanada aplicando una ligera presión y deslizando desde el extremo proximal hasta el distal.
  13. Coloca la pieza de colon vacía en un buffer KRB bien frío.

Figura 2
Figura 2: Disección del colon de la cría DOL 10. La epidermis y el peritoneo del cachorro se cortan y abren en dos pasos para evitar una incisión involuntaria del colon, hasta que queda expuesta la totalidad de la cavidad abdominal (A). El colon se libera del abdomen mediante un primer corte de la sección distal/rectal, seguido de un segundo corte por encima del ceco (B). Se descartan los milímetros iniciales del colon proximal y se recogen una o dos muestras de colon mayores que el tamaño de apertura de los deslizadores de Ussing (C). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Ensayo de permeabilidad colónica utilizando biopsias de ratón en cámaras de Ussing

  1. Preparación del ensayo
    1. El día anterior al día del experimento de Ussing. Para garantizar condiciones óptimas para el ensayo, se recomienda preparar varias soluciones el día anterior al experimento. Estas soluciones se preparan según las instrucciones de la Tabla 1.
      NOTA: las siguientes tablas indican las cantidades requeridas para 12 cámaras Ussing, con KRB 10 veces en un gran exceso para permitir la alicuación.
      NOTA: La solución KRB 10x puede almacenarse a 4 °C durante hasta 6-12 meses.
    2. El día del experimento, 30 minutos antes de la eutanasia de los animales:
      1. Prepare 400 mL de buffer KRB, según las instrucciones de la Tabla 2.
        NOTA: El KRB 10x, el agua desionizada y el bicarbonato deben ser premezclados y burbujeados con gas carbogénico (95%O 2; 5% CO2) durante 15 minutos antes de añadir CaCl2 para evitar precipitaciones.
      2. Usando un sistema de carbogénicos (95%O 2; 5% CO2), burbujea el tampón KRB fresco durante 15 minutos.
      3. Dividir los 400 mL del tampón KRB en dos y preparar 200 mL de Krebs-Glucosa, 200 mL de Krebs-Mannitol y la solución HRP como se describe en la Tabla 3.
    3. Configuración del sistema Ussing
      1. Precalienta el sistema Ussing a 37 °C.
      2. Preensamblar las cámaras de la siguiente manera:
        1. Levanta los pestillos de cada ranura.
        2. Coloca las cámaras en sus ranuras sin apretar el sistema.
        3. Inserta los dos tubos de suministro de gas en cada parte de las cámaras.
        4. Introduce los cuatro electrodos en las aberturas frontales (si están disponibles - no se cubren aquí) o sella las cuatro aberturas usando conos de 200 μL llenos de pegamento antes del experimento.
        5. Coloca bandejas bajo las cámaras anticipando posibles fugas.
      3. Montaje de tejido
        1. Seca ligeramente la muestra de colon previamente limpiada con una toalla de papel para eliminar el exceso de humedad.
        2. Coloca el trozo de colon bajo una lupa e inserta muy suavemente una de las hojas de tijera fina en la parte luminal para abrirla (Figura 3A).
          NOTA: El corte puede hacerse de un solo movimiento una vez que las tijeras están completamente insertadas. La sección del colon utilizada debe estar lo más recta posible evitando la torsión.
        3. Usando pinzas finas, monta el tejido en la parte blanca del deslizador mientras mantienes la parte luminal hacia arriba, hacia el operador. El tejido debe estar libre de trazas de grasa, heces, arrugas, perforaciones y laceraciones, y debe cubrir ampliamente la abertura (Figura 3B).
        4. Cierra el deslizador bajo el microscopio binocular y comprueba si hay posible desplazamiento del tejido. Debe ser visible una ligera deformación del tejido cuando se aplica presión sobre el deslizador, lo que indica que el deslizador está firmemente cerrado.
          NOTA: Instala los deslizadores en la cámara de Ussing (Figura 4) y comienza el paso de equilibrio individualmente tan pronto como esté listo, para evitar la deshidratación de la muestra.
        5. Manteniendo una ligera presión sobre el deslizador para mantenerlo cerrado, inserta el deslizador en la cámara de Ussing, asegurando que el lumen (la parte transparente del deslizador) mire hacia la izquierda.
        6. Cierra ambos pestillos y aprieta el tornillo situado a la derecha hasta que la cámara sea hermética y el deslizador no pueda moverse.
      4. Configuración final y equilibrio
        1. Añade 4 mL de Krebs-Mannitol al compartimento izquierdo (apical) de la cámara.
        2. Añade 4 mL de Krebs-Glucosa en el compartimento derecho (basolateral) de la cámara.
        3. Coloca un pequeño trozo de parafilm entre ambos compartimentos para evitar la contaminación cruzada.
        4. Abre la entrada de gas (95% O2 / 5%CO2) y ajusta la salida entre 1-2 burbujas/s.
        5. Elimina cualquier burbuja grande que se encuentre en el tejido o en el sistema utilizando una pipeta Pasteur.
        6. Deja que el sistema se equilibre hasta 20-30 minutos.
        7. Preparar la solución FITC 4kDa + HRP + Mannitol como se describe en la Tabla 4.
  2. Inicio del ensayo de permeabilidad del colon
    1. Una vez alcanzado el equilibrio del sistema, se sustituyen 200 μL de Krebs-Mannitol del compartimento apical (izquierdo) por 200 μL de solución FITC 4Kd + HRP + Mannitol y se inicia inmediatamente un temporizador. Lava la punta haciendo suaves subidas y bajadas en el compartimento y desecha la punta entre cada cámara.
    2. Para cada cámara, recoge 2 duplicados de 100 μL del compartimento basal (derecho) y deposita los volúmenes en una placa negra de 96 pozos. Cubre la placa con papel de aluminio para evitar la fotodegradación del FITC presente en la placa.
    3. Sustituye inmediatamente los 200 μL previamente recogidos por 200 μL de Krebs-Glucosa fresca.
    4. Repite los pasos (2) y (3) cada 30 minutos hasta alcanzar el punto de tiempo de 2 horas, para obtener los puntos de tiempo: T0, T30, T60, T90 y T120.
    5. Sella la placa con papel de aluminio para evitar la fotodegradación del FITC y procede a la cuantificación del FITC.
MgCl2 1M
MW (g/mol)Volumen final = 20 mLConcentración final
mili-Q H2OLlevar al volumen final
MgCl2, 6H2O203.34,066 g1 M
KRB 10X
MW (g/mol)Volumen final = 1LConcentración final
mili-QH 20Llevar al volumen final
NaCl58.4470 g1,198 M
KCl74.553,4 g45,6 mM
Na2HPO 4,2H 2O177.991 g5,62 mM
NaH 2PO4, 2H2O156.012,3 g14,7 mM
MgCl2 1M5 mL5 mM
Bicarbonato 750 mM
MW (g/mol)Volumen final = 250 mLConcentración final
mili-Q H2OLlevar al volumen final
NaHCO38415,75 g750 mM
CaCl2 2M
MW (g/mol)Volumen final = 50 mLConcentración final
mili-Q H2OLlevar al volumen final
CaCl211111,098 g2 M

Tabla 1: Preparación de la solución el día anterior al experimento de Ussing.

Amortiguador KRB (400 mL)
VolumenConcentración final
KRB 10X40 mL1X
H2O (mili-Q)352 mL
Bicarbonato 750 mM8 mL15 mM
CaCl2 2M240 μL1,2 mM

Tabla 2: Preparación del buffer KRB el día del experimento Ussing.

Krebs-Glucosa/Mannitol (200 mL cada uno)
Volumen final = 200 mLConcentración final
KRB BufferLlevar al volumen final
Glucosa360 mg10 mM
o
Mannitol364 mg10 mM
Solución HRP
Volumen final = 1480 μLConcentración final
Krebs-MannitolLlevar al volumen final
HRP13 mg8,8 mg/mL

Tabla 3: Preparación de soluciones de Krebs-glucosa/manitol y HRP el día del experimento de Ussing.

Solución FITC 4kDa + HRP + Mannitol
Para 12 cámarasVolumenConcentración final
HRP (8,8mg/ml)1345 μL
Krebs-Mannitol1155 μL
FITC 4Kd166,6 mg16,66 mM

Tabla 4: Preparación de la solución FITC de 4 kDa + HRP + manitol el día del experimento de Ussing.

Figura 3
Figura 3: Montaje de una muestra de colon de un cachorro DOL 9. Se inserta una hoja de un par fino de tijeras en el segmento luminal de la muestra para cortarla en un solo movimiento (A). La muestra abierta se monta en la apertura deslizante de Ussing con el lado luminal orientado hacia el operador (B). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Imagen de cámaras Ussing completamente preparadas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Evaluación de la permeabilidad paracelular del colon mediante cuantificación FITC

  1. Preparación de las normas FITC
    1. Diluir la solución FITC 4Kd + HRP + Mannitol en Krebs-Glucosa para preparar las diluciones estándar descritas en la Tabla 5 y la Figura 5.
    2. Depositar 2 x 100 μL (duplicados) de cada dilución estándar desde el n°1 hasta el n°7 en la placa. Sella la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz hasta que comience la lectura de la placa.
  2. Adquisición de datos: Utilizando un lector de placas, ajusta la longitud de onda de excitación a 485 nm y la emisión a 535 nm, y lee la placa lo antes posible.
    NOTA: Se recomienda leer la placa tanto con ganancia óptima como con una ganancia ajustada manualmente para facilitar la comparación de valores entre placas y permitir la interpolación de datos si se ha cometido un error durante las diluciones estándar.
  3. Almacenamiento de placas: Una vez almacenados los datos de cuantificación FITC, se almacenan las placas selladas con papel de aluminio a 4 °C durante la noche si la cuantificación HRP se va a realizar en los días siguientes, o congeladas a -80 °C para un almacenamiento prolongado.

Figura 5
Figura 5: Representación visual de la preparación de diluciones estándar FITC. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Diluciones estándar FTIC
N°1234567
Dilución1:10000 de solución de stock FITC1:2 de dilución n°11:2 de dilución n°21:10 de dilución n°11:2 de la dilución n°41:2 de la dilución n°5
Krebs-Glucosa
FITC (μM)1.660.830.4150.1660.0830.04150

Tabla 5: Preparación de las diluciones estándar FITC el día del experimento de Ussing.

5. Evaluación de la permeabilidad transcelular del colon mediante cuantificación HRP

  1. El día anterior al día del ensayo de cuantificación HRP:
    1. Garantizar condiciones óptimas el día del ensayo; Se requiere la preparación de varias soluciones el día anterior al experimento. Estas soluciones se preparan tal y como se describe en la Tabla 6.
      NOTA: Las siguientes tablas indican las cantidades requeridas para una placa de 96 pozos. Los estándares HRP pueden ser alicotados y almacenados a -20 °C o -80 °C durante varios meses. Debido a la inestabilidad, usa solo tampones frescos de carbonato/bicarbonato.
    2. Tras la preparación de la solución de anticuerpos anti-HRP, recubre inmediatamente una microplaca Clear Flat Bottom de alto enlace de 96 pozos con 100 μL por pozo. Envuélvelo en papel de aluminio y incuba durante la noche a 4 °C.
  2. El día del ensayo de cuantificación HRP:
    1. Prepare el buffer de bloqueo de BSA al 5% como se describe en la Tabla 7.
    2. Desecha el contenido de la placa y lava con 280 μL de PBS Tween 4 veces, agitando 1 minuto a 350 rpm entre cada lavado.
    3. Añade 200 μL de buffer bloqueador de BSA a cada pozo.
    4. Sella la placa con papel de aluminio e incuba en un agitador a 500 rpm durante un mínimo de 1 hora. Mientras tanto, descongelar y diluir muestras (1:10 o 1:50) y preparar las diluciones estándar descritas en la Tabla 8.
    5. Desecha el contenido de la placa y lava con 280 μL de PBS Tween 4 veces, agitando 1 minuto a 350 rpm entre cada lavado.
    6. Añadir 50 μL de muestras estándar o diluidas, sellar la placa e incubar a 300 rpm durante 1 hora en RT.
    7. Durante la incubación, lleva los reactivos QuantaBlu a RT y prepara la solución de trabajo como se describe en la Tabla 9.
    8. Desecha el contenido de la placa y lava con 280 μL de PBS Tween 4 veces, agitando 1 minuto a 350 rpm entre cada lavado.
    9. Añade 100 μL de solución de trabajo QuantaBlu a cada pozo a RT o 37 °C (1,5-90 min, 30 min de media).
      NOTA: El progreso del ensayo puede ir seguido por la aparición de una fuerte fluorescencia azul bajo una fuente de luz ultravioleta.
    10. Añadir 100 μL de solución QuantaBlu Stop a cada pozo para detener la actividad de la peroxidasa. Sella la placa e incuba durante 10 minutos en RT bajo agitación a 350 rpm.
    11. Usando un lector de placas, ajusta la longitud de onda de excitación a 315 nm y la emisión a 470 nm. Lee la matrícula lo antes posible.
      NOTA: Se recomienda leer la placa tanto con ganancia óptima como con una ganancia ajustada manualmente para facilitar la comparación de valores entre placas y permitir la interpolación de datos si se ha cometido un error durante las diluciones estándar. Alternativamente al kit de sustratos de peroxidasa fluorogénica QuantaBlu, se pueden usar otros sustratos de peroxidasa como la tetrametilbenzidina (medidos a 450 o 650 nm con o sin solución de parada, respectivamente), pero el uso de esta alternativa conlleva una menor sensibilidad.
Solución BSA
MW (g/mol)Volumen final = 12,7 mLConcentración final
Milli-Q H2OLlevar al volumen final
BSA664301,27 g100 mg/mL
Krebs-Glucosa + BSA
MW (g/mol)Volumen final = 30 mLConcentración final
Krebs-GlucosaLlevar al volumen final
Solución BSA60 μL0,2 mg/mL
PBS Tween
MW (g/mol)Volumen final = 500 mLConcentración final
PBS 1XLlevar al volumen final
Preadolescente-20500 μL0.1%
Carbonato sódico sol.
MW (g/mol)Volumen final = 3,22 mLConcentración final
Milli-Q H2OLlevar al volumen final
Na2CO3105.9934,13 mg0,1 M
Bicarbonato sódico sol.
MW (g/mol)Volumen final = 12,7 mLConcentración final
Milli-Q H2OLlevar al volumen final
NaHCO384106,68 mg0,1 M
Buffer de recubrimiento: pH 9,6
Volumen final ≈ 11 mL
Carbonato sódico sol.2,58 mL
Bicarbonato sódico sol.Añadir hasta que pH = 9,6 (~8,4 mL)
Estándar HRP de 10 μM
Concentración inicialVolumen final = 5 mLConcentración final
Krebs-GlucosaLlevar al volumen final
Solución HRP8,8 mg/mL50 μL0,088 mg/mL
Solución BSA100 mg/mL10 μL0,2 mg/mL
Estándar HRP de 1,5 nM
Concentración inicialVolumen final = 15 mLConcentración final
Krebs-GlucosaLlevar al volumen final
Estándar HRP de 2,0 μM0,088 mg/mL2,25 μL13,2 ng/mL
Solución BSA0,2 mg/mL3 μL40 ng/mL
Solución de anticuerpos anti-HRP
Concentración inicialVolumen final = 10 mLConcentración final
Amortiguador de recubrimientoLlevar al volumen final
Anticuerpo anti-HRP5,6 mg/mL8,93 μL5 μg/mL

Tabla 6: Preparación de la solución el día anterior al experimento HRP.

Búfer de bloqueo BSA
Concentración inicialVolumen final = 25 mLConcentración final
PBS 1X12,5 mL
Solución BSA100 mg/mL12,5 mL50 mg/mL

Tabla 7: BSA bloqueando la preparación del tampón el día del experimento HRP.

EstándarKrebs-Glucosa + BSAEstándar HRP de 1,5 nMFmol HRP/50 μL
Blank1000 μL0 μL0
1993,75 μL6,25 μL0.09375
2987,5 μL12,5 μL0.1875
3975 μL25 μL0.375
4950 μL50 μL0.75
5900 μL100 μL1.5
6850 μL150 μL2.25
7800 μL200 μL3
8700 μL300 μL4.5
9600 μL400 μL6
10400 μL600 μL9
11200 μL800 μL12

Tabla 8: Preparación estándar de HRP el día del experimento HRP.

Solución Funcional QuantaBlu
Volumen final = 12 mL
Solución de sustrato QuantaBlu10,8 mL
Solución estable de peróxido QuantaBlu1,2 mL

Tabla 9: Preparación de la solución de trabajo de QuantaBlu el día del experimento HRP.

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Resultados

Cuantificación de curvas estándar y concentración de pozos
El valor medio de los blanks se restaba de cada pozo de la placa. Con valores de absorbancia en el eje Y y concentraciones en el eje X, se creó una curva estándar usando la función "Interpolate a standard curve" de GraphPad Prism. Si todos los puntos estándar están alineados, el modelo "Línea" ofrece los mejores resultados. Alternativamente, el modelo "Sigmoidal, 4 PL, X es concentración" ofrece gran flexibilidad y precisión con interpolación ...

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Discusión

El gavage oral permite la administración repetida de una dosis luminal precisa y definida a ratones neonatales individuales. En cambio, la alimentación voluntaria, aunque es una alternativa viable, requiere un tiempo de administración prolongado por animal para administrar una cantidad de compuesto menor con una precisión de dosificaciónreducida 12. Además, el gavage oral acomoda volúmenes mayores que los posibles mediante vías inyectables, facilitando do...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo se realizó con el apoyo financiero de ANR-11-IDEX-0005-02 Laboratoire d'excellence INFLAMEX, un premio de la Fondation de l'avenir (2025, AP-RM-24-012), y las subvenciones ANR Diab1GUT (ANR-24-CE15-7152). El estudio se llevó a cabo en el marco del consorcio INFIBREX y contó con el apoyo del plan de inversión "France 2030", lanzado por el gobierno francés e implementado por la Université Paris Cité bajo su programa IdEx "Iniciativa de Excelencia" (ANR-18-IDEX-0001). Agradecemos mucho a la Plataforma Técnica de la Cámara Ussing en el Centro de Investigación de la Inflamación por su invaluable apoyo, y expresamos un agradecimiento especial a Alexandra Willemtz y Maude Le Gall por su ayuda experta. También queremos expresar nuestro sincero agradecimiento a la Plataforma de Instalaciones Animales del Centro de Investigación de Inflamación por su apoyo esencial, con un agradecimiento especial a Isabelle Renault y Guillaume Anselmet.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10 DPBS sin Ca y Ca MgDulbeccos14200091
Anticuerpo anti-HRPNordic BiositeGTX10183Peroxidasa de rábano picante monoclonal de ratón [2H11]
Lupa binocularOlympus SZ61No se requiere ninguna especificación.
Placa negra de fondo plano de 96 pozosThermoFisher Scientific137101Las placas deben ser negras y adaptadas a las lecturas de fluoresencia. Hay que quitar la tapa durante la lectura.
BSAMerckA4503
Ratones C57BL/6JRío Charles632C57BL/6J 
CaCl2Merck2382
Encuadernación alta transparente con fondo plano transparente de 96 pozosCorning9018
D-(+)-glucosaMerckG8270 
H< 2/sub>O destilado
D-MannitolMerckM4125
Pinzas finasFST11445-12
Tijeras FinasFST14058-09
FITC-Dextran 4KdFD4Laboratorios TdBSensible a la fotodegradación.
Almohadilla térmicaMinerve20 031 01
HRPMerckP8375
MgCl2, 6H2OMerckM2670 
Milli-Q H2O
Sistema de Uso P2300 EasyMount & DespachosInstrumentos fisiológicosEM6-C-CELos sistemas, cámaras y deslizadores deben ser todos compatibles.
P2306 Ussing Chamber SliderInstrumentos fisiológicosPI-P2306Existen diferentes modelos de deslizadores para distintos tamaños y tipos de pañuelos.
Kit de sustrato de peroxidasa fluorogénica QuantaBluThermoFisher Scientific15169
Agujas reutilizables de alimentación con punta redondaFST18061-24Calibre 24, punta de 1,25 mm de diámetro, punta redonda. Debe lavarse con agua estéril, etanol al 70% y ser autoclavado antes de usar.
Bicarbonato de sodioMerckS6297
Carbonato de sodioMerckS7795
EspectrofotómetroTECAN Spark 10MSe requiere un lector de placas con adquisición superior si se utilizan las 137101 placas negras.
Preadolescente-20MerckP7949

Referencias

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