Un método simplificado para la transformación mediada por agrobacterias de Phytophthora palmivora

Resumen

Presentamos un protocolo sencillo, eficaz y reproducible para la transformación mediada por Agrobacterium en Phytophthora palmivora, que también es aplicable a P. capsici.

Resumen

Phytophthora es un género de oomicetos que contiene numerosos patógenos vegetales destructivos, entre los que se encuentra la especie de amplio rango de hospedadores P. palmivora. La genómica funcional de Phytophthora ha estado limitada por la limitada disponibilidad de métodos de transformación robustos y fáciles de implementar. Entre los enfoques disponibles, la transformación mediada por Agrobacterium (AMT) es especialmente atractiva porque requiere un equipo especializado mínimo y a menudo produce transformantes estables con inserciones génicas de una sola copia. La mayoría de los protocolos de AMT para la transformación fúngica y de oomicetos utilizan sales de medio mínimo (MM) en medios de inducción y cocultivo de Agrobacterium . La preparación de estos medios suele implicar fabricar y mezclar múltiples soluciones de caldo, algunas de las cuales contienen numerosos componentes a diferentes concentraciones. El proceso es laborioso y propenso a errores, lo que conduce a un éxito de transformación inconsistente. Aquí presentamos un protocolo AMT simplificado, sencillo y reproducible para P. palmivora que utiliza medios basales Murashige y Skoog (MS) disponibles comercialmente para preparar el medio de inducción y co-cultivo de Agrobacterium . Este protocolo también se ha aplicado con éxito para transformar P. capsici y puede aplicarse a otras especies de Phytophthora .

Introducción

Phytophthora, un género de oomicetos, incluye muchos de los patógenos vegetales más destructivos del mundo, responsables de graves pérdidas^{económicas 1,2}. Entre ellos, Phytophthora palmivora es un patógeno de amplio rango de hospedadores que infecta muchos cultivos económicamente importantes, incluyendo cacao y^{papaya 3}. Es el agente causal más extendido de la podredumbre de la vaina negra en el cacao, un árbol perenne tropical que produce el componente principal de la industria del chocolate, valorada en miles de millones^{de dólares.} Comprender los mecanismos de patogenicidad molecular de este patógeno destructivo es fundamental para diseñar estrategias novedosas y efectivas de control de enfermedades, y la transformación genética es una herramienta esencial para posibilitar dichas investigaciones.

Se han desarrollado varios métodos para transformar Phytophthora spp., incluyendo el bombardeo de^{microproyectiles 7}, la transformación de protoplastos mediada por polietileno glicol y dicloruro de calcio (PEG/_{CaCl 2}⁾ 8,9,10,11, la electroporación de^{zoosporas 12,13,14} y la transformación mediada por Agrobacterium (AMT^)15.16. Entre estos enfoques, la AMT ofrece ventajas clave ya que normalmente genera integración génica de una sola^{copia 15,16} y es relativamente fácil de realizar sin necesidad de equipos especializados.

Anteriormente se ha desarrollado un protocolo para la transformación eficiente de P. palmivora mediante^AMT. Con este método, transformamos con éxito P. palmivora con múltiples^{constructos 17,18}. Este método utiliza medios de inducción y co-cultivo basados en sal de medio mínimo (MM), que se usan comúnmente para la transformación fúngica y de oomicetos 15,16,19. Aunque el protocolo de transformación basado en MM demostró ser eficaz para generar transformadores, preparar múltiples soluciones estándar y combinarlas para crear medios puede ser una tarea que consume mucho tiempo y es propensa a errores.

Aquí presentamos un método mucho más simplificado para el AMT de P. palmivora utilizando medios basales comerciales Murashige y Skoog (MS) para reemplazar los componentes del medio basado en sal de MM en el medio de inducción y co-cultivo^{de Agrobacterium 16}. Este método elimina la necesidad de preparar múltiples soluciones químicas stock, haciendo que el proceso sea menos laborioso y altamente reproducible. Además, este enfoque parece ofrecer una mayor eficiencia de transformación en comparación con el método¹⁶ descrito anteriormente, y también es aplicable a P. capsici.

Protocolo

1. Preparación de soluciones de stock, medios y otros materiales necesarios para la transformación

1. Soluciones antibióticas para stock
   1. Preparar soluciones de canamicina (50 mg/mL), G418 (15 mg/mL) y cefotaxima (100 mg/mL): Disuelva las cantidades adecuadas de antibióticos en agua, filtra las soluciones, prepara alicotas de 1 mL y alódalas a -20 °C.
   2. Preparar una solución de fondo de rifampicina (15 mg/mL): Disuelva la cantidad adecuada de rifampicina en DMSO, prepara 1 mL de alicotas de 1 mL, envólvelas en papel de aluminio y guárdalas a -20 °C.
      NOTA: Asegúrese de filtrar las soluciones químicas preparadas en DMSO utilizando filtros de jeringuilla hechos de materiales compatibles con DMSO, como nailon o PTFE (Teflón).
2. Medios para el crecimiento de Agrobacterium
   1. Medios líquidos Luria-Bertani (LB): Para preparar 250 mL de medios, añade 6,25 g de polvo LB a 250 mL de agua, autoclave la solución y guárdalo a temperatura ambiente (RT).
   2. Medio de agar LB: Para preparar 250 mL de medio, añade 6,25 g de polvo LB y 3,75 g de agar a 250 mL de agua, autoclave la solución y guárdalo en RT. Añade los antibióticos adecuados al agar LB derretido antes de preparar las placas. Guarda los platos suplementados con antibióticos a 4 °C.
3. Medios para el crecimiento y la transformación de P. palmivora
   1. Agar V8 al 10%: Para preparar 500 mL, añade 50 mL de zumo vegetal original 100% de V8 a 450 mL de agua. Luego añade 0,5 g de CaCO₃ a la suspensión y remueve para mezclarlo bien. Autoclave de la solución y viertela en platos.
      NOTA: Añadir los antibióticos adecuados cuando sea necesario. Guarda los platos suplementados con antibióticos a 4 °C.
   2. Medio líquido Murashige y Skoog (1/2 MS) de media concentración: Añadir 2,15 g de medio basal Murashige y Skoog (MS) a 950 mL de agua, ajustar el pH a 5,6 con 1 N KOH y añadir agua hasta 1 L. Usar directamente para hacer 1/2 MS de agar (paso 1.3.3), autoclave el resto de 1/2 MS líquido y almacenarlo en RT.
   3. 1/2 MS de agar para el co-cultivo agrobacterium-zoóspora (AZCA): Para preparar 600 mL de AZCA, mezcle 567 mL de 1/2 MS líquido del paso 1.3.2 con 9 g de agar. Autoclave de la solución y guárdala en RT.
   4. 50% de glicerol: Mezcla 50 mL de glucerol con 50 mL de agua, autoclave la solución y guárdalo en RT.
   5. 1M MES (pH 5,6): Para preparar 200 mL, añade 39,048 g de hidrato MES a 160 mL de agua y luego ajusta el pH a 5,6 con solución de NaOH. Después, añade agua hasta 200 mL, filtra la solución y guárdala en RT en condiciones oscuras.
      NOTA: El MES se irá disolviendo gradualmente a medida que suba el pH. Inicialmente, usa NaOH de 10 N para acercar el pH a 5,6, lo que casi disolverá el polvo. Luego, añade 1 N de NaOH para que el pH sea exactamente 5,6.
   6. 20% de glucosa: Disuelve 10 g de glucosa en 40 mL de agua, luego añade agua hasta 50 mL, filtra la solución y guárdala en RT.
   7. 200 mM Acetosiringona (AS): Disuelva 40 mg de 4'-Hidroxi-3',5'-dimetoxiacetofenona en 1 mL de DMSO (véase la NOTA bajo 1.1.2) y cubra la solución con papel de aluminio. Hazlo fresco el día de la transformación.
   8. Medio de inducción de agrobacterias (AIM): Para preparar 40 mL de medio, añadir 400 μL de glicerol al 50%, 400 μL de glucosa al 20%, 1,6 mL de 1 M MES (pH 5,6), 40 μL de 200 mM de AS a 37,6 mL de solución líquida de 1/2 MS (pH 5,6) (preparada en el paso 1.3.2) en un tubo estéril de 50 mL. Mezcla bien la solución, cubre el tubo con papel de aluminio y úsalo fresco en unas horas.
   9. Agar de cocultivo agrobacterio-zoóspora (AZCA): Para preparar 600 mL de ágar, añadir 6 mL de glicerol al 50%, 3 mL de glucosa al 20%, 24 mL de 1 M MES (pH 5,6), 600 μL de 200 mM de AS para autoclavar y derretir 567 mL 1/2 agar MS (pH 5,6) (preparado en el paso 1.3.3). Vierte la solución en platos y cúbrelos con un paño negro para protegerlos de la luz.
      NOTA: Añadir las soluciones químicas a medio MS de agar fundido (paso 1.3.9) cuando la temperatura esté entre 55-60 °C. Apaga las luces del capó durante los pasos 1.3.7-1.3.9, ya que el AS es fotosensible. Realiza estos tres pasos el día de la transformación.
   10. Agar plich: Para preparar 1 L del agar, en 950 mL de agua, añade 0,5 g KH₂PO₄, 0,25 g de MgSO_{4,7H 2}O, 1 g de L-asparagina, 5 g de glucosa, 0,5 g de extracto de levadura, 10 μL de tiamina (100 mg/mL en agua, almacenado a 4 °C), 10 mg de β-sitosterol (disuelvo en 3 mL de etanol antes de añadir). Remueve la solución para disolver todos los ingredientes, luego añade agua para que el volumen alcance 1 L. Divide la solución en porciones de 500 mL y añade 7,5 g de agar a cada 500 mL. Autoclave de la solución y añade los antibióticos adecuados cuando la temperatura baje a 55 °C, luego vierte la solución en platos.
   11. Membrana Hybond N+: Corta la membrana con las láminas protectoras en piezas de 5 cm x 6 cm, envuelve las piezas en papel de aluminio y autoclave. Al colocar la membrana autoclavada sobre un medio AZCA, manipularla con pinzas estériles y desechar las láminas protectoras.

2. Cultivo de P. palmivora

1. Siete u ocho días antes de la transformación, cultiva el aislado de papaya P. palmivora P1¹⁶ en placas de agar V8 recién elaboradas al 10% colocando un tapón de agar de un cultivo de Phytophthora previamente cultivado (o del stock) en el centro de la placa de Petri.
   NOTA: Para obtener una mayor concentración de zoósporas, es importante utilizar agar V8 recién preparado y sin clarificar al 10%.
2. Incubar las placas a 25 °C bajo un ciclo de 12 horas de luz y de 12 horas de oscuridad durante 7-8 días hasta la transformación.

3. Preparación de Agrobacterium tumefaciens

1. Tres días antes de la transformación, la cepa EHA105 de A. tumefaciens transporta pCB301TOR-GFP¹⁶ en una placa de agar LB suplementada con rifampicina (15 μg/mL) y kanamicina (50 μg/mL). Incuba la placa a 28 °C durante 2 días.
   NOTA: La preparación inicial de Agrobacterium (paso 3.1) puede realizarse una semana antes de la transformación, y las placas pueden almacenarse a 4 °C tras el periodo de incubación de 2 días.
2. El día antes de la transformación, toma una pequeña cantidad de células de Agrobacterium y extiéndelas sobre una nueva placa de agar LB suplementada con antibióticos (como se describe en el paso 3.1) utilizando la base inferior y plana de un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL. Para facilitar la distribución, añade 20 μL de medio líquido en el centro de la placa de agar LB, mezcla las células bacterianas con el medio LB y luego espállalas uniformemente por la placa. Incuba la placa a 28 °C durante la noche durante unas 16-18 horas.
3. Recoge las células cultivadas durante la noche con una punta de pipeta de 1 mL y resuéltalas en un medio de inducción Agrobacterium (AIM) de 1 mL pipeteando arriba y abajo. Diluir las células a OD₆₀₀ = 0,4 con AIM en un tubo estéril de 50 mL cubierto con papel de aluminio. Haz un mínimo de 5 mL para usar en coincubación con zoósporas de P. palmivora (paso 5.1).
   NOTA: Un OD₆₀₀ que varía de 0,1 a 0,8 permitiría una transformación exitosa. Se utiliza rutinariamente₆₀₀ = 0,4, ya que esta concentración produjo la mayor eficiencia de transformación cuando se usaron medios mínimos de inducción y co-cultivo de Agrobacterium basados en sal en medio (MM) para la transformación¹⁶.
4. Incubar las bacterias en RT en condiciones oscuras durante 1,5-2 horas en un agitador de plataforma con agitación suave (aproximadamente 70 rpm).
   NOTA: Se recomienda mantener apagadas las luces de la campana durante el paso 3.3 y aflojar la tapa del tubo de 50 mL durante la incubación (paso 3.4).

4. Liberación de las zoosporas

1. Tras 1 hora de incubación de Agrobacterium tumefaciens (paso 3.4), inundar una placa de P. palmivora de 7-8 días con 10 mL de agua pre-enfriada a 4°C, eliminar las burbujas de aire en la superficie del medio golpeando suavemente con la punta de una pipeta, e incubar la placa a 4 °C durante 15 minutos, seguida de 15 minutos en RT bajo luz.
2. Transfiere suavemente las zoosporas liberadas (unos 7-8 mL) a un tubo centrífugo estéril de 15 mL con una pipeta, sin alterar los micelios y los esporangios.
3. Para medir la concentración de la zoospora, transfiere parte de la suspensión de la zoóspora (por ejemplo, 20 μL) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y diluíra 10 veces con agua (180 μL H₂O para zoosporas de 20 μL). Envórtice el tubo durante 1 minuto para enquistar las zoosporas y facilitar el conteo, y luego contar el número de zoosporas bajo un microscopio usando un hemaciómetro. Multiplica el número contado por un factor de 10 para determinar la concentración de la suspensión de zoosporas preparada en el paso 4.2.
   NOTA: La concentración de zoosporas se mide para calcular la eficiencia de la transformación. Normalmente utilizamos concentraciones que van de 1,5 × 10⁶ a 5 × 10^{zoósporas 6} por mL, con éxito en la transformación.

5. Coincubación de Agrobacterium y zoósporas

1. Añade 5 mL de Agrobacterium (preparado en el paso 3.4) a 5 mL de suspensión de zoospore (preparada en el paso 4.2) en un tubo estéril de 50 mL cubierto con papel de aluminio. Mezcla y incuba suavemente el tubo en RT durante 2 horas en la oscuridad. Mantén la tapa suelta y no agites el tubo durante la coincubación.
2. Durante el periodo de coincubación (paso 5.1), preparar las placas AZCA (paso 1.3.9). Cuando el medio se solidifique, coloca una pieza de membrana Hybond ^N+ esterilizada (preparada en el paso 1.3.11) sobre cada placa AZCA y mantén las placas en la oscuridad.
3. Tras 2 horas de coincubación entre Agrobacterium y zoospora (paso 5.1), esparce 300 μL de la mezcla sobre cada membrana Hybond ^N+ colocada sobre las placas AZCA (paso 5.2) con una punta de pipeta, dejando los márgenes libres del líquido.
4. Deja que la mezcla se seque al aire durante unos 10 minutos en la capucha dejando las placas de Petri descubiertas. Cubre las placas tan pronto como la solución de la membrana deje de fluir.
   NOTA: Durante los pasos 5.1-5.4, mantén apagadas las luces del capó. Si es necesario, utiliza luces al añadir y extender la mezcla sobre las membranas (paso 5.3).
5. Después de secar al aire, incubar las placas a 25 °C en la oscuridad durante 2 días.

6. Selección de transformadores resistentes a G418

1. Tras 48 horas de coincubación (paso 5.5), transfiere las membranas ^{Hybond N+} boca abajo usando pinzas esterilizadas a placas de agar Plich suplementadas con G418 (30 μg/mL) y cefotaxima (100 μg/mL). Al colocar las membranas sobre las placas, no las arrastres sobre la superficie del medio.
   NOTA: Debe determinarse la concentración de G418 para la selección de transformantes para cada aislado de P. palmivora , ya que se observan diferentes niveles de sensibilidad para distintos aislados. Para ello, se coloca un tapón de micelio de 0,5 cm de diámetro en el centro de las placas de agar de Plicit, complementado con una serie de concentraciones de G418 en incrementos de 5 μg/mL partiendo de cero. Prepara tres placas replicadas para cada concentración. Incuba las placas a 25 °C durante 7 días. Identificar la concentración más baja de G418 que inhibe completamente el crecimiento del aislado de Phytophthora y utilizarla para la selección de transformantes.
2. Utiliza la base plana de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para presionar y deslizar suavemente sobre la superficie de la membrana y asegurarte de que está en contacto cercano con el medio. Observa la parte inferior de las placas para comprobar la presencia de burbujas de aire entre la membrana y el medio. Exprime suavemente la burbuja de aire, si la hay, usando la base plana del mismo tubo de microcentrífuga.
3. Incuba las placas bajo un ciclo de 12 horas de luz y de 12 horas de oscuridad a 25 °C durante 2-3 días.
4. Tras 3 días de incubación, retira las membranas usando pinzas estériles y continúa incubando las placas bajo las mismas condiciones. Las membranas pueden retirarse después de 2 días si aparecen colonias visibles en las placas.
   NOTA: Los transformantes suelen aparecer entre 1 y 3 días tras la retirada de la membrana, aunque algunas colonias pueden aparecer más tarde. Para obtener más transformantes, monitoriza las placas durante aproximadamente una semana después de retirar las membranas.
5. Transfiere los transformantes a placas de agar V8 al 10% con la misma concentración de G418 o una concentración reducida en un 30%.

Resultados

Siguiendo este protocolo, realizamos dos experimentos independientes para transformar P. palmivora usando A. tumefaciens EHA105 que transportaba pCB301TOR-GFP¹⁶. Como era de esperar, la coincubación de zoósporas con Agrobacterium produjo colonias resistentes a G418 en placas de agar Plich suplementadas con 30 μg/mL de G418, mientras que no se observaron colonias en placas de control sin infección por Agrobacterium (Figura 1A). El número de transformantes resistentes a G418 por cada 10⁷ zoosporas producidas en estos dos experimentos fue de 55 y 50, respectivamente (Tabla 1), casi el doble del número más alto (27 ± 5) obtenido anteriormente con el protocolo¹⁶.

Los verdaderos transformantes se verificaron mediante dos métodos: primero, la observación de la fluorescencia GFP usando un microscopio de fluorescencia, y segundo, la amplificación por PCR de un fragmento de 550 pb del gen EGFP usando Taq 2X Master Mix (NEB) con el par de cebadores EGFP-F2 (5'- GACGTAAACGGCCAAGTTC-3') y EGFP-R2 (5'-GGGTGCTCAGGTAGTTTG-3'). En el experimento (Exp) 1, 15 de 18 transformadores resistentes a G418, y en Exp 2, 17 de 21 transformantes mostraron fluorescencia GFP (Tabla 1, Figura 1B). De los siete transformadores resistentes a G418 que no mostraron fluorescencia en ambos experimentos, tres fueron confirmados como transformadores verdaderos mediante PCR (Figura 1C). En total, la tasa de transformadores verdaderos se estimó en un 90%.

Además, también pudimos transformar con éxito un aislado de calabaza de P. capsici , PC2024-14sz, utilizando A. tumefaciens EHA105 que transportaba pCB301TOR-GFP, siguiendo el protocolo con una modificación menor en la preparación de suspensiones de zoosporas (el periodo de incubación a 4 °C tras inundar una placa de P. capsici de 7 días con agua pre-enfriada se extendió a 30 minutos). El número de transformadores resistentes a G418 (30 μg/mL) por cada^{10 7} de un solo experimento fue 13. Se observaron nueve transformantes bajo un microscopio de fluorescencia, y todos produjeron fluorescencia (Archivo Suplementario 1), lo que sugiere que son transformadores verdaderos.

Figura 1: Transformación de P. palmivora usando A. tumefaciens EHA105 portador de pCB301TOR-GFP. (A) Aparición de transformantes de P. palmivora resistentes a G418 en agar Plich suplementado con 30 μg/mL de G418. (B) Detección de la expresión de GFP bajo un microscopio de fluorescencia en una cepa representativa de transformante y P. palmivora wild-type (WT). Las imágenes se tomaron tanto en canales de fluorescencia de campo claro (BF) como en GFP. (C) Amplificación por PCR de EGFP a partir de cuatro transformantes con fluorescencia detectable de GFP y siete sin fluorescencia de GFP. Se utilizó el par universal de cebadores ITS4/ITS5²⁰ para amplificar la región interna del espaciador transcrito (ITS) y comprobar la integridad del ADN. Los transformantes sin fluorescencia GFP se resaltan en texto en negrita y subrayado. Abreviaturas: M = NEB 100 pb escalera de ADN; WT = P . palmivora tipo salvaje aislado P1; N = PCR de control negativo usando H₂O como plantilla. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Experimento	OD600 de Agrobacterium	Concentración de zoosporas (/mL)	Volumen de la zoospora (mL)	Número de transformadores resistentes a G418	Número de transformadores con señal GFP detectable (Detectada / Observada)	Número de transformantes resistentes a G418/ 107 zoósporas
1	0.4	1,8 x 106	4.3	43	15/18	55
2	0.4	2,9 x 106	4.6	67	17/21	50

Tabla 1: Eficiencia de la transformación mediada por agrobacterias de P. palmivora utilizando A. tumefaciens EHA105 portadora de pCB301TOR-GFP.

Archivo suplementario 1: Expresión de GFP bajo microscopio de fluorescencia en P. capsici de tipo salvaje (WT ) y un transformante representativo generado usando A. tumefaciens EHA105 que transporta pCB301TOR-GFP. Las imágenes se tomaron tanto en canales de fluorescencia de campo claro (BF) como en GFP. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este protocolo utiliza medios basales Murashige y Skoog de media concentración (1/2 MS) para reemplazar componentes de sales de medio mínimo (MM) que se usan comúnmente en medios de inducción y co-cultivo de Agrobacterium para transformación de oomicetos y hongos. Preparar medios a base de sal MM requiere elaborar múltiples soluciones de stock a partir de numerosos productos químicos individuales y luego combinar estas^{soluciones 19}. La mitad de MS también contiene muchos componentes químicos; sin embargo, dado que el MS está ampliamente disponible comercialmente como polvo premezclado, la preparación del medio se simplifica a disolver el polvo en agua. Esta modificación reduce significativamente el tiempo de preparación del medio y minimiza el potencial de error humano. Además, el protocolo mejora la eficiencia de la transformación, generando un mayor número de transformadores en comparación con el método^{AMT 16} descrito anteriormente. También es eficaz para transformar P. capsici y probablemente sea aplicable a otras especies de Phytophthora . Para reforzar su posible aplicabilidad más amplia, el medio basado en EM se ha utilizado anteriormente para co-cultivar cepas de Agrobacterium tumefaciens que expresan la proteína interaccionante AtVIP1 (Arabidopsis thaliana VirE2 con proteína 1) y P. infestans , lo que ha permitido la transformación exitosa de P. infestans²¹.

Es importante señalar que este protocolo puede generar un bajo porcentaje de falsos positivos. Entre los 39 transformadores resistentes a G418 que se probaron mediante observación de fluorescencia con GFP o PCR, cuatro no mostraron ni fluorescencia ni amplificación de EGFP (Tabla 1, Figura 1C). Como la integración parcial del T-ADN durante la transformación mediada por Agrobacterium no es^{infrecuente 22,23}, es posible que solo la porción del T-ADN que contiene el gen NPTII del plásmido pCB301TOR-GFP¹⁶ haya sido integrada en el genoma de P. palmivora. Alternativamente, los falsos positivos pueden deberse a un contacto insuficiente entre la membrana y el medio selectivo, permitiendo escapar de la selección de G418. Por tanto, es esencial asegurar que la membrana permanezca en contacto completo con el medio (paso 6.2).

Este protocolo puede simplificarse aún más. Por ejemplo, el MES en medios de inducción Agrobacterium (AIM) y en el agar de co-cultivo Agrobacterium-zoóspora (AZCA) puede potencialmente omitirse. El MES se utiliza comúnmente como agente tampón en experimentos de bioquímica y biología molecular para mantener un pH estable; sin embargo, preparar una solución MES de 1 M a pH 5,6 requiere un tiempo suficiente y aumenta el coste. En el AMT de plantas, como albahaca dulce²⁴ y^{papaya 25}, se usaron medios similares de inducción y co-cultivo basados en Agobacterium sin MES, lo que sugiere que el MES podría no ser esencial para la transformación de P. palmivora. Se necesitan más experimentos para confirmar que la omisión de MES no compromete la eficiencia de la transformación.

En conjunto, este protocolo simplificado proporciona una plataforma práctica y accesible para la manipulación genética rutinaria de P. palmivora, P. capsici y potencialmente otros oomicetos. Apoya una amplia gama de estudios fundamentales, algunos de los cuales tienen potencial traslacional, incluyendo el marcaje fluorescente de patógenos para seguir la dinámica de infecciones, el marcado de proteínas para examinar la localización subcelular y análisis funcionales mediante cambios dirigidos en la expresión génica o secuencias codificantes de proteínas. Combinado con la edición genómica basada en CRISPR, se espera que el protocolo acelere la disección de los mecanismos de patogenicidad y la identificación de factores clave de virulencia en estos patógenos destructivos. Los conocimientos resultantes permitirán, a su vez, el desarrollo de nuevas estrategias de control de enfermedades basadas en mecanismos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos microcentrífugas de 1,5 mL	VWR	525-1126
4'-Hidroxi-3',5' dimetoxiacetofenona	TCI	D2666	Acetosiringona (AS)
Tubo de 50 mL	Greiner Bio-one	227261
Etanol absoluto	Biorreactivos de Fisher	BP28184
Agar	Biorreactivos de Fisher	BP1423-500
Papel de aluminio
Membrana Hybond-N+ (30 cm y 3 m)	Cytiva	RPN303B
Carbonato cálcico	Sigma-Aldrich	239216-500G	CaCO3
Cefotaxima sal sódica	Química Termocientífica	AAJ6269006
D-(+)-glucosa	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
Kit microbiano DNeasy PowerLyzer	Qiagen	12255-50
Pinzas
Microscopio de fluorescencia	Zeiss		Microscopio de fluorescencia ZEISS Axioscope 5 con conjunto de filtro 38 HE
G418 sulfato	Química Termocientífica	AC329400010
Glicerol	Sigma-Aldrich	911046-1L
Hemacitómetro (línea brillante)	Hausser Scientific
Sulfato de kanamicina	Santa Cruz Biotecnología	SC-257635
L-Asparagina anhidro	MP Biomedicina	ICN10079425
LB Broth, Miller	Biorreactivos de Fisher	BP1426-2
Sulfato de magnesio heptahidratado	Sigma-Aldrich	63138-250G	MgSO4· 7H2O
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M2933-100G
Medio Basal Murashige y Skoog	Sigma-Aldrich	M5519-50L
Placa de Petri (100 mm x 15 mm)	VWR	25384-342
Dihidrógeno fosfato de potasio	Sigma-Aldrich	1370391000	KH2PO4
Rifampicina	Santa Cruz Biotecnología	SC-200910
Taq 2X Master Mix	NEB	M0270L
Clorhidrato de tiamina	Sigma-Aldrich	T4625-5G
Espectrofotómetro UV-Visible	Fisher Scientific	14-385-355
V8 Original 100% Zumo de Verduras	Compañía de Sopas Campbell
Vórtice	Fisher Scientific	14-955-163
Agua			Grado de Biología Molecular, purificado mediante el sistema de purificación de agua Mill-Q
Extracto de levadura	ACROS	611805000	Actualmente disponible a través de Thermo Scientific Chemicals
β-Sitosterol	Sigma-Aldrich	85451-100G