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Artículo de investigación

El ARN circular ZBTB46 atenúa la apoptosis y el estrés oxidativo en células endoteliales humanas lesionadas por lipopolisacáridos modulando la señalización ERBB2-AKT

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DOI:

10.3791/69765

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13 de febrero de 2026

1Department of Emergency, Fuzhou University Affiliated Provincial Hospital, Fujian Provincial Hospital, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Emergency Medicine

En este artículo

Resumen

La lesión renal aguda asociada a sepsis (SA-AKI) se asocia a tasas de mortalidad considerables. Este estudio encuentra circZBTB46 regulado a la baja en HUVECs inducidos por LPS ( SA-AKI in vitro). Su sobreexpresión aumenta la viabilidad de HUVEC, reduce la apoptosis, la inflamación y el estrés oxidativo en asociación con la señalización ERBB2/AKT, lo que sugiere un posible objetivo terapéutico relevante para la SA-AKI.

Resumen

Los ARN circulares son reguladores emergentes de las respuestas al estrés, pero su papel en la lesión endotelial que conduce a la lesión renal aguda relacionada con la sepsis siguen incompletamente definidos. Planteamos la hipótesis de que el ARN circular ZBTB46 (circZBTB46) confiere protección endotelial mediante la señalización ERBB2-AKT. Utilizando un modelo basado en células en el que se desafiaron células endoteliales de venas umbilicales humanas con lipopolisacáridos, cuantificamos la expresión de circZBTB46 y probamos los efectos de su expresión forzada sobre la supervivencia, la apoptosis, los mediadores inflamatorios y la homeostasis redox. Los ensayos de viabilidad celular y la citometría de flujo evaluaron la supervivencia y la apoptosis. Los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas midieron la interleucina-6, el factor de necrosis tumoral α e interleucina-1β, mientras que las especies reactivas de oxígeno, malondialdehído, superóxido dismutasa y catalasa se evaluaron como indicadores de daño oxidativo y capacidad antioxidante. Para definir el mecanismo, realizamos un perfilado transcriptomático con análisis de enriquecimiento de conjuntos génicos, confirmamos proteínas de vía mediante Western blot y evaluamos la necesidad utilizando el inhibidor de ERBB2 AG-825. Lipopolisacáridos suprimidos circZBTB46. La sobreexpresión de CircZBTB46 aumentó la viabilidad, redujo la apoptosis, redujo las citocinas proinflamatorias y las especies reactivas de ogénio, disminuyó el malondialdehído y aumentó las actividades de superóxido dismutasa y catalasa. Los análisis transcriptómicos y proteicos apoyaron la activación del eje ERBB2-AKT, y el bloqueo farmacológico ERBB2 debilitó la citoprotección y revirtió los avances en el equilibrio redox. Estos hallazgos identifican circZBTB46 como un freno endógeno en el daño endotelial inducido por lipopolisacáridos mediante la señalización ERBB2-AKT y nominan circZBTB46 como un nodo mecanicista y posible objetivo terapéutico para la lesión renal aguda relacionada con sepsis.

Introducción

La sepsis, una cascada inflamatoria sistémica que pone en peligro la vida iniciada por invasión patógena, frecuentemente culmina en fallomultiorgánico 1. En este contexto crítico, la AS-AKI surge como una complicación predominante y clínicamente significativa en las unidades de cuidadosintensivos 2. Caracterizada por un deterioro abrupto de la capacidad de filtración renal concurrente con infección sistémica, esta condición muestra tasas de mortalidad superiores a las de la IAA no séptica en un 38%-42% en cohortesclínicas 2. Se prevé que aproximadamente el 60% de las personas diagnosticadas con sepsis o shock séptico desarrollenSA-AKI 3. Por lo tanto, la AKA se ha convertido en un gran desafío en cuidados intensivos, contribuyendo significativamente a la morbilidad ymortalidad 4. Actualmente, el mecanismo de SA-AKI sigue siendo incompletamente comprendido. Aunque los estudios preclínicos han involucrado disfunción microcirculatoria, alteraciones en el metabolismo celular y desequilibrios dentro del sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS), disfunción mitocondrial y desregulación inflamatoria, el mecanismo fisiopatológico de la AS AKI sigue siendo esquivo y actualmente carece de medidas óptimas para apoyar el diagnóstico precoz y el manejocontinuo 5,6,7,8 . La ACA (SA-AKI presenta apoptosis aumentada), estrés oxidativo excesivo einflamación 9. Dentro de este marco de investigación, se empleó lipopolisacáridos (LPS) en un sistema in vitro para imitar las manifestaciones de la AKI asociada a sepsis en células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVECs) para la exploración preliminar de objetivos5.

En los últimos años, los ARN circulares (circARN), una categoría recientemente identificada de moléculas de ARN no codificante, han ganado cada vez más atención por su papel en diversas enfermedades10. Los circARN poseen una estructura circular estable y participan en procesos fisiológicos y patológicos celulares actuando como esponjas moleculares para microARNs (miARN), regulando la transcripción génica o participando en interaccionesproteicas 11. Las investigaciones han indicado que los circARNs están fundamentalmente implicados en la modulación de la inflamación, el estrés oxidativo y las vías apoptóticas, generando así un mayor enfoque en la investigación sobre sus posibles implicaciones en la sepsis y condiciones relacionadas, incluida la lesión renalaguda 12. Por ejemplo, hsa_circ_0072463 ha sido identificado como un marcador diagnóstico prometedor y un objetivo terapéutico paraSA-AKI 13. Se informó que Circ_001653 aliviaba la SA-AKI mediante el reclutamiento deBUD13-14. Sin embargo, la importancia funcional de los circARN en SA-AKI sigue siendo en gran medida inexplorada.

Este estudio fue diseñado para examinar la influencia de circZBTB46 en la función de las células endoteliales, el estrés oxidativo y las respuestas inflamatorias utilizando un sistema in vitro SA-AKI. Al construir un modelo HUVEC inducido por LPS, investigamos la lesión endotelial bajo estimulación endotóxica. Cabe señalar que los HUVECs desafiados con LPS representan un modelo reduccionista de estrés endotelial impulsado por endotoxinas/TLR4, que es relevante para, pero no equivalente, a la fisiopatología multifactorial de la lesión renal aguda asociada a sepsis. Este modelo captura principalmente la activación inflamatoria mediada por TLR4, el estrés oxidativo y las respuestas endoteliales relacionadas con la apoptosis, mientras omite componentes clave in vivo como alteraciones hemodinámicas, cascadas de complemento y coagulación, patrones moleculares asociados al daño y estímulos microbianos heterogéneos. Dentro de este marco experimental, investigamos si circZBTB46 alivia el estrés oxidativo y la apoptosis inducidos por LPS modulando la vía de señalización ERBB2, protegiendo así la función de las células endoteliales. Hasta donde sabemos, este estudio proporciona la primera evidencia que vincula circZBTB46 con respuestas al estrés endotelial en el contexto de la lesión renal aguda asociada a sepsis. Al elucidar los mecanismos moleculares subyacentes a la protección endotelial mediada por circZBTB46, esta investigación puede profundizar en la comprensión de los mecanismos patógenos de SA-AKI y allanar el camino para enfoques terapéuticos innovadores centrados en el circARN.

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Protocolo

Este protocolo describe los procedimientos experimentales utilizados para investigar los efectos de la modulación circZBTB46 sobre la señalización inflamatoria, el estrés oxidativo y la activación de la vía ERBB2-AKT en HUVECs.

Cultivo celular
Las células HUVECs utilizadas en este estudio se obtuvieron de una fuente comercial. Los HUVECs se utilizaron como modelo representativo de células endoteliales debido a su amplia disponibilidad, condiciones de cultivo reproducibles y alta eficiencia de transfección, lo que facilita la manipulación genética y la investigación mecanicista de las vías de señalización endoteliales bajo estrésinflamatorio 15,16. Los HUVECs se cultivaron en DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10% (v/v) y cóctel antibiótico-antimicótico a concentración del 1%. Todos los cultivos celulares se mantuvieron bajo condiciones fisiológicas estándar en una cámara humidificada (37 °C, 5% CO2), lo que promovió una proliferación celular sostenida mientras preservaba la viabilidad del >95%, confirmado por el ensayo de exclusión con azul de tripán. Aunque los medios específicos para endotelios (por ejemplo, EGM-2 o M199 suplementados con suplementos de crecimiento endotelial) son comúnmente recomendados para el mantenimiento a largo plazo de HUVEC, en este estudio se utilizó DMEM para asegurar la consistencia entre tratamientos experimentales y compatibilidad con la estimulación LPS y los ensayos de inhibidores farmacológicos. Para los ensayos de inhibidores de AG-825, incubar los HUVECs con DMEM fresco que contenga 10 μM de AG-825 durante 1 hora. Luego, se añade la solución LPS a los pozos para alcanzar una concentración final de 10 μg/mL, y continúa el cultivo durante 24 horas. Para minimizar la posible deriva fenotípica, los HUVEC se utilizaron en números bajos de paso y se expusieron a condiciones experimentales basadas en DMEM solo para ensayos a corto plazo. Todos los experimentos funcionales se realizaron dentro de ventanas de tratamiento definidas en lugar de durante cultivos prolongados.

Transfección celular
Para esclarecer el papel biológico de circZBTB46, GenScript sintetizó y validó plásmidos de sobreexpresión (oe-circZBTB46) y constructos de control negativos emparejados (oe-NC). Los HUVECs se siembraron en placas de 6 pozos con una densidad de 1 x 10⁵ células/pozo y se cultivaron durante la noche para alcanzar una confluencia de ~70%-80% en el momento de la transfección. Para cada pozo, se diluyó 2,5 μg de ADN plasmídico (oe-circZBTB46 u oe-NC) en 125 μL de medio sérico reducido y se mezcló con 2,5 μL de reactivo P3000 (tubo A). En paralelo, se diluyeron 3,75 μL de Lipofectamina 3000 en 125 μL de medio sérico reducido (Tubo B). El tubo A y el tubo B se combinaron, mezclaron suavemente e incubaron a temperatura ambiente durante 15-20 minutos para permitir la formación de complejos (volumen complejo final: 250 μL/pozo). Los complejos se añadieron gota a gota a las células en un medio completo libre de antibióticos. Tras 6 horas de incubación a 37 °C, 5% deCO2, el medio de transfección fue reemplazado por un medio de crecimiento fresco completo. Las células se cultivaron durante 48 horas antes de los ensayos posteriores. Todos los procedimientos siguieron las instrucciones del fabricante.

Modelo inducido por LPS
Para generar un modelo in vitro SA-AKI, se siembraron HUVECs (5 x 10 célulasde 5 células/pozo) transfectados con oe-circZBTB46 o NC en placas de 96 pozos y se mantuvieron durante 24 horas hasta alcanzar una confluencia del 80%. Posteriormente, estas células recibieron tratamiento con LPS a 10 μg/mL durante 24 horas. Los HUVEC sin tratamiento LPS sirvieron como grupo de control.

qRT-PCR
La extracción total de ARN de los HUVECs utilizó un reactivo comercial. La transcripción inversa para la síntesis de ADNc se realizó con el kit de reactivos comercial. La PCR cuantitativa (qPCR) se ejecutaba en triplicado utilizando un sistema de PCR en tiempo real junto con una mezcla maestra. Las cantidades de expresión de genes objetivo se calibraron contra U6, con análisis realizado mediante el método 2−ΔΔCT 17,18. Para el análisis de expresión de circARN, se utilizó el ARN nuclear pequeño U6 como referencia interna para la normalización, ya que se emplea comúnmente para cuantificar ARN pequeños no codificantes y se ha informado que muestra una expresión relativamente estable en condiciones experimentales in vitro a corto plazo. Las secuencias de cebadores aplicadas en este estudio se enumeran de la siguiente manera:

circZBTB46-Delantero: 5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'

circZBTB46-Reverso: 5'-CGCCTCTCTACACTAGGGG-3'

U6-Delantero: 5'-TGCTATCACTTCAGCAGCA-3'

U6-Reversa: 5'-GAGGTCATGCTAATCTTCTCTCTG-3'.

Ensayo CCK-8
La viabilidad de los HUVEC se evaluó utilizando CCK-8 adquiridos comercialmente. En resumen, las células se sembraron en una placa de 96 pozos, y las células sufrieron un cultivo de adherencias durante 24 horas. Después de esto, se añadieron 10 μL de solución de CCK-8 a cada pozo, y las células se incubaron a 37 °C durante 2 horas. Se empleó un lector de microplacas para medir la densidad óptica (OD) a una longitud de onda de 450 nm. Las observaciones preliminares demostraron que 10 μg/mL de LPS disminuyeron significativamente la viabilidad de los HUVEC, lo que llevó a la selección de esta concentración para procesos experimentales posteriores.

Citometría de flujo
Inicialmente, los HUVECs se desprendían con tripsina libre de EDTA según los procedimientos estándar. De acuerdo con las directrices del fabricante para el Kit de Ensayo de Apoptosis Annexin V-APC/PI, las suspensiones celulares se centrifugaron a 1.000 x g durante 5 minutos a 4 °C, tras disociación enzimática. Las células en pellet se lavaron dos veces con PBS helado bajo las mismas condiciones y se resuspendieron en 100 μL de tampón de unión 1x. Cada muestra se trató con 5 μL de conjugado Annexin V-FITC y 5 μL de solución de tinción de yoduro propidio (PI), seguida de una incubación de 10 minutos en oscuridad a temperatura ambiente (20-25 °C). Finalmente, se añadieron 400 μL de buffer de unión 1x a todas las muestras, y la apoptosis se analizó en 1 hora usando un citómetro de flujo. Los eventos fueron bloqueados primero por FSC/SSC para excluir los restos. Para el análisis de apoptosis, se aplicaron compuertas de cuadrantes en el gráfico Annexin V-FITC vs PI utilizando controles apropiados (no teñidos y controles de una sola tinción/compensación) para definir poblaciones vivas (Annexin V-/PI-), apoptóticas tempranas (Annexin V+/PI-), apoptóticas tardías (Annexin V+/PI+) y necróticas (Annexin V-/PI+). Se aplicaron la misma plantilla de acceso y los mismos umbrales en todas las muestras.

Ensayo ELISA
Las concentraciones de factores inflamatorios —factor de necrosis tumoral α (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e interleucina-1β (IL-1β)— en el sobrenadante de HUVECs cultivados se midieron utilizando kits ELISA disponibles comercialmente. Específicamente, se utilizaron el kit ELISA TNF-α humano, el kit ELISA IL-6 humano y el kit ELISA IL-1β humano según las instrucciones del fabricante. Para cada ensayo, se cargaban 50 μL de sobrenadante de cultivo celular sin diluir por pozo. Se generaban curvas estándar usando las diluciones en serie proporcionadas (TNF-α: 0-1000 pg/mL; IL-6: 0-500 pg/mL; IL-1β: 0-200 pg/mL). Tras la muestra y la adición estándar, las placas se incubaron a 37 °C durante 90 minutos, seguidas de cinco lavados con tampón de lavado. Luego se añadió un anticuerpo de detección conjugado con biotina e incubado a 37 °C durante 60 minutos. Tras otro paso de lavado, se añadió estreptavidina-HRP y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Tras un lavado final, se añadió sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) y se incubó a 37 °C en la oscuridad durante 15 minutos. La reacción terminó con solución de parada y la absorbancia se midió inmediatamente a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm. Cada muestra y estándar se analizaron en duplicado, y todos los experimentos incluyeron tres réplicas biológicas independientes. Los niveles de marcadores de estrés oxidativo —malondialdehído (MDA), superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT)— en el sobrenadante se evaluaron utilizando el MDA ELISA Kit, SOD ELISA Kit y CAT ELISA Kit, respectivamente, siguiendo los protocolosproporcionados 19, 20 y 21. Para los ensayos MDA y SOD, se usaron 40 μL de sobrenadante por pozo sin dilución; para CAT, las muestras se diluyeron 1:10 con tampón de ensayo antes de la carga. Se prepararon curvas estándar según las especificaciones del kit (MDA: 0-60 nmol/mL; Peso de la Altura: 0-100 U/mL; CAT: 0-100 U/mL). Los pasos de incubación se realizaron de la siguiente manera: MDA - 60 min a 37 °C; SOD - 60 min a 37 °C; GATO - 30 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron 4 veces entre los pasos clave de incubación. El desarrollo del color se logró añadiendo los sustratos respectivos e incubando a 37 °C (MDA: 15 min; Segundo de día: 20 min; CAT: 15 min). La absorbancia se leía a 450 nm para SOD y CAT, y a 532 nm para MDA. Todas las mediciones se realizaron en pozos duplicados y se repitieron en tres réplicas biológicas independientes.

Secuenciación de ARN
El ARN total se extrajo de los HUVECs utilizando reactivos comerciales según las instrucciones del fabricante. La pureza y concentración de ARN se evaluaron utilizando un espectrofotómetro midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nm (A260/A280), y la integridad del ARN se evaluó con un bioanalizador. Solo se utilizaron muestras de ARN con un Número de Integridad de ARN (RIN) ≥ 7 para la preparación posterior de la biblioteca. El ARN ribosómico fue extraído durante la preparación de la biblioteca utilizando un procedimiento estándar de agotamiento de ARNr realizado por una empresa comercial. Cuando se indicó, el tratamiento con RNasa R se aplicó antes de la construcción de la biblioteca para digerir selectivamente ARN lineales y enriquecer especies circulares de ARN. La fragmentación del ARN se realizó entonces bajo condiciones de temperatura elevada siguiendo el protocolo estándar del manual del Kit de Preparación de Biblioteca de ARN para generar fragmentos de ARN de tamaño adecuado. Las bibliotecas de secuenciación se prepararon utilizando el Kit de Preparación de Bibliotecas de ARN según las instrucciones del fabricante y se secuenciaron en una plataforma Illumina utilizando una estrategia de secuenciación de extremos emparejados con una longitud de lectura de 150 bp (PE150). La profundidad de secuenciación fue suficiente para soportar el análisis a nivel de transcriptoma. Las lecturas de secuenciación en bruto se procesaban utilizando procedimientos estándar de control de calidad para eliminar secuencias de adaptadores y lecturas de baja calidad. Las lecturas limpias se alinearon con el genoma de referencia humano y los niveles de expresión génica se cuantificaronen consecuencia 22,23. Se identificaron genes (DEGs) diferencialmente expresados entre los HUVECs con sobreexpresión de circZBTB46 y los HUVECs tratados con NC bajo estimulación LPS mediante métodos estadísticos establecidos. Se realizó un análisis de enriquecimiento de conjuntos génicos (GSEA) para identificar las vías de señalización asociadas con la sobreexpresión de circZBTB46. Los genes se clasificaron según la expresión diferencial entre grupos experimentales. Se utilizaron conjuntos de genes seleccionados de la Molecular Signatures Database (MSigDB) para el análisis de enriquecimiento. La significación del enriquecimiento se evaluó en función de la puntuación de enriquecimiento normalizado (NES) y la tasa de descubrimiento de falsos (FDR), siendo FDR < 0,25 considerada estadísticamente significativa. La secuenciación de circARN y todos los análisis bioinformáticos asociados fueron externalizados.

Identificación de DEGs
Para detectar DEGs, se contrastaron los niveles de expresión entre dos grupos distintos mediante el paquete de software DESeq (2012) R. Los umbrales de significación estadística se definieron como p < 0,05 con un |log2FC| valor superior a 0,58. El mapa de calor se generó con el paquete R de pheatmap, y el gráfico volcánico utilizó el paquete Goplot2 R para el dibujo.

Análisis de enriquecimiento funcional
Los análisis de enriquecimiento GO y KEGG derivados de transcripciones lineales se realizaron utilizando la plataforma online EnrichR, y el Bubble Chart se dibujó basándose en el paquete GOplot R. Se utilizó el software GSEA, basado en la matriz de expresión y los archivos de conjuntos génicos proporcionados por la base de datos MSigDB, con parámetros de análisis establecidos (por ejemplo, número de permutaciones y métodos estadísticos). El enriquecimiento de conjuntos génicos se evaluó utilizando la puntuación de enriquecimiento normalizado (NES), el valor P y el valor FDR, proporcionando una exploración en profundidad de las funciones y posibles mecanismos biológicos de los genes expresados diferencialmente.

Western blot
La proteína total se extrajo de HUVECs (aproximadamente 1 x 10⁶ células) utilizando tampón de lisis RIPA suplementado con inhibidores de proteasa e fosfatasa. La concentración de proteínas se determinó con un Kit de Cuantificación de Proteínas BCA. Se resolvieron cantidades iguales de proteína (20 μg por carril) mediante electroforesis en geles de dodecilo sulfato de sodio y poliacrilamida al 10% (SDS-PAGE) a 80 V durante 30 minutos, seguidos de 120 V durante 60 minutos. Posteriormente, las proteínas se transfirieron a membranas de polivinilideno fluoruro (PVDF) utilizando un sistema de transferencia húmeda a 100 V durante 90 minutos a 4 °C. Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% en solución salina con Tween-buffer al 0,1% (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguida de incubación con anticuerpos primarios diluidos en el mismo tampón bloqueante (típicamente 1:1000 para proteínas objetivo y 1:5000 para GAPDH) a 4 °C durante la noche. Los anticuerpos principales utilizados fueron los siguientes: ERBB2, p-AKT, AKT y GAPDH. Tras la incubación, las membranas se lavaron 3 veces (10 minutos por lavado) con TBST y luego se incubaron con un anticuerpo secundario IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1:5000 en buffer bloqueador) durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras tres lavados adicionales de TBST (10 min cada uno), se visualizaron las bandas proteicas utilizando un kit de sustrato Western Blotting de Quimioluminiscencia Mejorada (ECL) y se fotografiaron con un sistema de imagen. Las intensidades de las bandas se cuantificaron mediante software.

Análisis estadístico
Las evaluaciones estadísticas se realizaron utilizando GraphPad Prism 10. Los datos se muestran como medios ± error estándar de las medias (SEM). Se definió un valor p < 0,05 para indicar significación estadística.

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Resultados

Análisis qRT-PCR de la expresión de circZBTB46 en un modelo in vitro de SA-AKI
Este conjunto de experimentos se llevó a cabo para probar la hipótesis de que la expresión de circZBTB46 se altera bajo la estimulación LPS y que la modulación de circZBTB46 afecta la viabilidad de las células endoteliales y la apoptosis en un modelo in vitro de SA-AKI. Inicial...

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Discusión

Durante la sepsis, los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), como el LPS liberado por los patógenos, activan receptores tipo Toll (por ejemplo, TLR4), iniciando una respuesta inflamatoriasistémica 26. Este proceso desencadena la secreción de múltiples mediadores proinflamatorios, como TNF-α, IL-6 e IL-1β, lo que da lugar a una tormenta decitocinas 27. Simultáneamente, el LPS daña directamente las células endoteliales vasculare...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia. Los autores declaran que los principales resultados presentados en este manuscrito no se han publicado previamente y no están siendo considerados para su publicación en otro lugar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AG-825 (Inhibidor de ErbB2)MedChemExpressHY-1019710 & mu; M de bloqueo de caminos
Bioanalizador Agilent 2100AgilentG2939BAIntegridad del ARN (RIN≥ 7)
Anticuerpo AKTProteintech60203-2-IGWB (1:15000)
Annexin V-APC/PI Apoptosis KitElabscienceE-CK-A327Detección de apoptosis
Antimicoótico antibióticoGibco15240062Concentración del 1%
Kit de cuantificación de proteínas BCABeyotimeP0012Concentración de proteínas
CAT ELISA KitMEIMIANAMM-0897H2Enzima antioxidante
CCK-8 KitDojindoCK04Ensayo de viabilidad celular
CircRNA seqFuzhou Huarong Kehui Biotechnology Co., Ltd.PE150Secuenciación de circARN y todos los análisis bioinformáticos asociados
Citómetro de flujo CytoFLEXBeckman CoulterB53000Análisis de apoptosis
DMEMGibco (Invitrogen)11965092Medio de cultivo celular
Kit de sustratos ECLMilliporeWBKLS0100Detección de proteínas
Anticuerpo ERBB2Sino Biological100271-T32WB (1:10000)
Suero fetal bovino (FBS)Industrias biológicas04-001-1ACSSuplemento del 10% (v/v)
Anticuerpo GAPDHProteintech60004-1-IGWB (1:50000)
HUVECsSistema ProcellCP-H082Origen de la línea celular
IL-1 y beta; ELISA KitMEIMIANAMM-0181H2Factor inflamatorio
IL-6 ELISA KitMEIMIANAMM-0049H2Factor inflamatorio
Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850Secuenciación de ARN
Lipofectamina 3000InvitrogenL3000008Reactivo de transfección
LPS (E. coli O111:B4)Sigma-AldrichL263010 & mu; g/mL para el modelo SA-AKI
MDA ELISA KitMEIMIANAMM-2037H2Marcador de estrés oxidativo
NanoDrop 2000Thermo FisherND-2000Cuantificación de ARN
Kit de biblioteca de ARN NEBNext Ultra IINEBE7770SPreparación de la biblioteca RNA-seq
Plásmido oe-circZBTB46GenScriptSíntesis personalizadaVector de sobreexpresión circZBTB46
Plásmido OE-NCGenScriptSíntesis personalizadaVector de control negativo
Anticuerpo p-AKT (Ser473)Proteintech66444-1-IGWB (1:1200)
Kit de reactivos PrimeScript RTTakaraRR047ASíntesis de ADNcDNA
Membranas PVDFMilliporeIPVH00010Transferencia de manchas occidentales
Sistema QuantStudio 5Thermo FisherA28137PCR en tiempo real
Ribonucleasa RLucigenRNR07250Eliminación de ARNrr
Búfer de Lisis RIPABeyotimeP0013BExtracción de proteínas
RNAiso PlusTakara9109Extracción total de ARN
SOD ELISA KitMEIMIANAMM-25469H2Enzima antioxidante
TB Green Premix Ex TaqTakaraRR420AReactivo qPCR
TNF-& alfa; ELISA KitMEIMIANAMM-0122H2Factor inflamatorio

Referencias

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